劉桂鋒，韓 亮，趙景偉

(1.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 放射科， 吉林 長春130033； 2.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 病理科， 吉林 長春130033； 3.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 神經外科， 吉林 長春130033)

腦缺血再灌注后Src激酶抑制劑PP2對神經元保護機制的探討

劉桂鋒1，韓 亮2，趙景偉3*

(1.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 放射科， 吉林 長春130033； 2.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 病理科， 吉林 長春130033； 3.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 神經外科， 吉林 長春130033)

目的 探討Src激酶抑制劑PP2在大鼠腦缺血再灌注后對神經元延遲性死亡保護作用的機制。方法 建立Wistar大鼠全腦缺血再灌注動物模型，分為無缺血再灌注正?？瞻讓φ战M(sham)，Src激酶抑制劑PP2實驗組(PP2)和Src激酶抑制劑PP2類似物的實驗對照組(PP3)。實驗組及實驗對照組Wistar大鼠在雙側頸動脈夾閉造成全腦缺血前30分鐘于腦室內分別注射PP2和PP3，控制大鼠腦組織缺血時間均為10 min，再灌注時間均為72 h。于再灌注時取出大鼠腦組織，部分腦組織通過甲醛固定后行HE染色觀察每組大鼠海馬CA1區(qū)神經元存活數量；另外部分腦組織在-20℃環(huán)境下將丘腦背外側皮層腦組織分離，并應用差速離心法分離出神經元，通過Western Blot分析神經元組分中Src激酶、NMDA受體及PSD蛋白的磷酸化變化情況。結果 通過HE病理切片發(fā)現，在成功建立了大鼠全腦缺血再灌注動物模型中海馬CA1區(qū)神經元出現延遲性死亡的現象，大鼠海馬CA1區(qū)神經元死亡數量PP2實驗組的明顯少于PP3實驗對照組。Western Blot分析結果顯示：與空白對照組比較，實驗組及實驗對照組神經元出現缺血延遲性死亡時NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表達明顯升高(P<0.001)；實驗組與實驗對照組比較，Src激酶抑制劑PP2可顯著下調腦缺血再灌注后NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表達(P<0.01)。結論 腦缺血再灌注后Src激酶抑制劑PP2可以對神經元起到保護作用，其機制可能與NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src磷酸化表達水平的改變有關。

神經元；缺血再灌注；Src激酶抑制劑PP2

(ChinJLabDiagn,2017,21:1072)

腦血管疾病是造成人類死亡的重要疾病之一，而其中80%-85%的腦血管疾病屬于缺血性腦血管病[1]。缺血性腦卒中引起的患者神經功能障礙常常難以恢復，其原因與缺血區(qū)域腦組織即使在恢復血液再灌注后仍會發(fā)生神經元延遲性死亡的現象有關。目前，腦組織缺血再灌注后神經元延遲性死亡的分子機制仍不十分明確[2]，其主要原因可能與腦缺血再灌注時神經元中興奮性氨基酸毒性作用、細胞內鈣超載或自由基過度形成等有關[3,4]。本研究旨在觀察和探討Src激酶抑制劑PP2對腦缺血再灌注后神經元延遲性死亡保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 成年雄性Wistar大鼠、呼吸機、麻醉機、顯微手術器械均來自美國Charles River實驗室，大鼠腦立體定向固定儀來自美國Stoelting公司，電泳儀、超聲儀、蛋白濃度測定試劑盒來自美國Bio-rad公司，伊紅染料、4%多聚甲醛來自美國Sigma公司，Src激酶抑制劑PP2、PP2類似物PP3、P-NMDAR2B(Tyr1472)、P-NMDAR2B(Tyr1325)、P-NMDAR2A(Tyr1246)、P-PSD93(Tyr340)和P-Src(Tyr416)抗體均來自美國Calbiochem公司。

1.2 大鼠側腦室注藥手術方法 術前動物禁食12 h，以5%異氟烷誘導麻醉氣管插管，以2%異氟烷維持麻醉。將大鼠頭部固定于立體定位儀上，于前囟右側1.4 mm、前囟后0.9 mm位置單孔鉆顱，以微量注射泵將15 μl PP2或PP3緩慢注入側腦室，拔出針頭，關顱。待大鼠完全清醒后拔出氣管插管，30 min后行全腦缺血手術。實驗分組：無缺血再灌注正常組(sham)，Src激酶抑制劑PP2實驗組(PP2)和Src激酶抑制劑PP2類似物實驗對照組(PP3)。

1.3 制作大鼠腦缺血模型手術方法 注藥后的大鼠再次麻醉，分離出雙側頸總動脈，于右下肢股動脈插管回抽血液，使大鼠血壓降至50 mmHg，以動脈瘤夾夾閉雙側頸總動脈，造成大鼠出現全腦缺血狀態(tài)，維持缺血時間為10 min，并控制缺血過程中血壓持續(xù)在45 mmHg左右。缺血結束后，血液回輸。

1.4 大鼠腦組織HE染色 取出腦組織，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中，在4℃溫度下固定12 h，常規(guī)組織脫水、滲透、包埋，切片機按10 μm層厚行冠狀位切片，挑選背側丘腦處的腦片伊紅染色。

1.5 差速離心法 -20℃環(huán)境下分離出丘腦背外側皮層腦組織，按照重量體積比1：10加入勻漿緩沖液，勻漿器抽壓35次，腦組織勻漿液在4℃條件下10 000 g離心10 min，去除上清，向沉淀部分中加入10倍體積的勻漿緩沖液，超聲擊打三次，每次5 s，然后在4℃ 條件下18 000 g離心20 min，沉淀部分即神經元組分。

1.6 Western blot檢測 使用RIPA裂解液進行神經元組分總蛋白提取，并用BCA法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液沸水浴5 min。12%SDS-PAGE電泳后200 mA電轉至PVDF膜上，4℃下封閉過夜，室溫TBST洗滌3次，一抗2 h，繼續(xù)TBST洗滌3次，進行辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h后漂洗，二氨基聯苯胺顯色。

1.7 統(tǒng)計學分析 數據統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件和Graphpad Prism 5.0軟件，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為有差異統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腦缺血動物模型的建立 病理切片HE染色觀察缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經元存活情況，腦組織未缺血及缺血3 min再灌注72 h后未出現神經元延遲性死亡的現象，全腦缺血10 min再灌注后大鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經元出現死亡現象。結果表明大鼠腦缺血動物模型建立成功，見圖1。

A:未缺血組；B:缺血3 min組；C：缺血10 min組。箭頭顯示神經元死亡區(qū)域圖1 大鼠腦缺血動物模型海馬CA1區(qū)神經元死亡現象

2.2 Src激酶抑制劑PP2對腦缺血再灌注后神經元死亡干預結果 通過病理切片發(fā)現：大鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經元死亡數量，Src激酶抑制劑PP2實驗組(PP2)的明顯少于Src激酶抑制劑PP2類似物的實驗對照組(PP3)，見圖2。

圖2 Src激酶抑制劑PP2對腦缺血再灌注后神經元死亡干預結果

2.3 腦缺血再灌注后Src激酶抑制劑PP2對神經元NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶磷酸化表達水平的影響 Western Blot分析結果顯示：與空白對照組比較，實驗組及實驗對照組神經元出現缺血延遲性死亡時NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表達明顯升高(P<0.001)；實驗組與實驗對照組比較，Src激酶抑制劑PP2可顯著下調腦缺血再灌注后NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表達(P<0.01)，見圖3。

*P<0.001；#P<0.01圖3 腦缺血再灌注后Src激酶抑制劑PP2對神經元NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶磷酸化表達水平的影響

3 討論

雖然腦缺血的研究是神經內科和神經外科研究的一個重要方向，但目前腦缺血后出現缺血灶周邊的神經元延遲性死亡的分子機制仍未明確。前人研究認為：由NMDA受體介導的興奮性神經毒性作用被認為是腦缺血常伴發(fā)缺血灶周邊的神經元延遲性死亡的一個重要原因[3,4]。中樞神經系統(tǒng)中正常存在NMDA(N-methyl-D-aspartic acid，N-甲基-D-天冬氨酸)的廣泛表達，而NMDA受體過度或持續(xù)激活可導致細胞內Ca2+超載，繼而產生興奮性神經毒作用。這種NMDA神經毒作用是引發(fā)缺血性腦損傷、中風、癲癇等病理狀態(tài)下神經元死亡的關鍵[5]。因此，正常表達的NMDA受體參與神經元正常生理功能，異常表達的NMDA受體可引起神經元病理死亡[6，7]。Src是一種酪氨酸蛋白激酶，其正常作用是感知受體激活并向胞內傳遞信號的核心蛋白激酶。Src廣泛參與腦組織中神經元的突觸可行性及神經元的增殖、分裂和存活等生理活動[8]。由Src介導的受體磷酸化還可調節(jié)突觸后膜NMDA受體群的動態(tài)平衡[9]。選擇性阻斷Src激酶的磷酸化信號，可減少大鼠腦缺血再灌注后由NMDA受體超激活介導的神經元延遲性死亡。所以Src家族酪氨酸蛋白激酶的抑制劑可能是一個潛在的治療腦缺血的新藥，有待進一步研究。

本實驗中，我們應用大鼠雙側頸總動脈夾閉合并股動脈抽血降血壓的方法建立了Wistar大鼠全腦缺血的動物模型。由于理論表明NMDA受體在興奮性神經毒過程中的作用由Src蛋白激酶介導，因此在本實驗中我們通過腦缺血前30 min腦室內注射選擇性Src激酶的抑制劑PP2，同時通過觀察建立的腦缺血前30 min腦室內注射PP2類似物PP3的實驗對照組，分析PP2是否具有神經保護作用、并通過病理組織切片及蛋白印跡分析大鼠丘腦背外側皮層腦組織內NMDA受體蛋白、Src酪氨酸蛋白激酶及相關蛋白的表達，來探討PP2的作用機制。針對建立的Wistar大鼠全腦缺血動物模型，我們通過大鼠腦組織標本的病理檢查實驗發(fā)現：Src激酶抑制劑PP2實驗組(PP2)的大鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經元死亡數量，明顯少于Src激酶抑制劑PP2類似物的實驗對照組(PP3)；通過大鼠腦組織標本的Western Blot分析發(fā)現：Src激酶抑制劑PP2可顯著下調腦缺血再灌注后NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表達水平。本實驗結果表明：PP2與減少腦缺血后神經元的延遲性死亡有關，PP2可能具有神經保護作用。我們的實驗結果與Hou XY等的文獻報道[10]相符。

本實驗結果提示：腦缺血再灌注后Src激酶抑制劑PP2可以對神經元起到保護作用，其機制可能與NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src磷酸化表達水平的改變有關。

[1]張 妮,邵延坤.缺血性腦血管病急性期血壓干預與預后[J].中國實驗診斷學,2016,20(2):331.

[2]李培培,彭俊陽,姚建華.頸動脈狹窄與腦梗死發(fā)生的相關性分析及干預措施[J].中國實驗診斷學,2016,20(4):691.

[3]Bai J,Lyden PD.Revisiting cerebral postischemicreperfusioninjury:new insights in understanding reperfusion failure,hemorrhage,and edema [J].Int J Stroke,2015,10(2):143.

[4]Kaur A,Kaur T,Singh B,et al.Curcumin alleviates ischemia reperfusion-induced acute kidney injury through NMDA receptor antagonism in rats [J].Ren Fail,2016,38(9):1462.

[5]Petralia RS,Wang YX,Hua F,et al.Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations[J].Neuroscience,2010,167(1):68.

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[9]Jiang X,Mu D,Biran V,et al.Activated Src kinases interact with the N-methyl- D-aspartate receptor after neonatal brain ischemia[J].Ann Neurol,2008,63(5):632.

[10]Hou XY,Liu Y,Zhang GY.PP2,a potent inhibitor of Src family kinases,protects against hippocampal CA1 pyramidal cell death after transient global brain ischemia [J].Neurosci Lett,2007,420(3):235.

The protection mechanism of Src kinase inhibitor PP2 on neurons after cerebral ischemia reperfusion

LIUGui-feng,HANLiang,ZHAOJing-wei.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the protection mechanism of Src kinase inhibitor PP2 on delayed neuron death after cerebral ischemia reperfusion.Methods Wistar rats with global cerebral ischemia-reperfusion model divided into is the normal group (sham),Src kinase inhibitor PP2 group (PP2) and Src kinase inhibitor PP2 analogue control group (PP3) are used.30 minutes before the whole cerebral ischemia of rats the drug is injected,ischemia time for 10 min,reperfusion time of 72 h.Brain tissue of rat is fixed by formalin and stained by HE on arriving reperfusion.The number of survival neuron in hippocampal CA1 between the test group and contral groups is observed.Brain tissues from another part of the rats are rapidly frozen in liquid nitrogen under anesthesia.Brain tissues from hypothalamic dorsolateral cortex are separated in the -20℃,the various subcellular fractions are separated by differential centrifugation,the phosphorylation status of Src kinase,NMDA receptors and PSD protein in the neurons component are analyzed by Western Blot.Results The successfully established the whole cerebral ischemia reperfusion animal models of rats hippocampus CA1 area neurons in delayed the phenomenon of death.The number of neuronal death with cerebral ischemia and reperfusion for 72 h from PP2 treatment group with intraventricular 15 μg PP2 given 30 min before ischemia was significantly less than that of the control group according to HE pathological findings in the hippocampal CA1.Western Blot analysis results indicate that the phosphorylation of NMDAR2B,NMDAR2A,PSD93 and Src expression increased significantly indelayed neuron death after cerebral ischemia reperfusion (P<0.001),while the Src kinase inhibitor PP2 can significantly decreasethe expression of NMDAR2B,NMDAR2A,PSD93 and Src phosphorylation after cerebral ischemia reperfusion (P<0.01).Conclusion Src kinase inhibitor PP2 can protect neurons and its mechanism may be related to NMDAR2B,NMDAR2A,PSD93 and Src phosphorylation expression level change after cerebral ischemia reperfusion.

Neurons;Ischemia reperfusion;Src kinase inhibitor PP2

吉林省科學技術廳青年科研基金項目(20140520015JH)

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1072-04

R743

A

2016-10-14)