譚洪波+王麗華++張紅城++吳黎明

摘要：利用固相萃取-高效液相色譜研究了6個(gè)石榴蜜樣品中多酚類(lèi)成分含量，以及石榴蜜對(duì)DPPH 自由基的清除作用，通過(guò)ORAC法測(cè)定其抗氧化能力，并對(duì)其還原力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，石榴蜜的總酚含量在 29.28～37.25 mg/100 g 之間，總黃酮含量在 2.31～2.47 mg/100g，其中酚酸含量較高的樣品1和樣品2抗氧化能力較強(qiáng)。石榴蜜各樣本中均含脫落酸、木樨草素及芹菜素3種酚類(lèi)化合物。同時(shí)，所有石榴蜜樣品均具有一定的抗氧化活性，與總酚含量呈現(xiàn)量效關(guān)系，呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：石榴蜜；總酚；總黃酮；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S896.1；R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0179-04

蜂蜜是指蜜蜂采集蜜源植物的花蜜、分泌物或蜜露，并與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]，是公認(rèn)的具有多種生物學(xué)活性的天然食品[2]。近年來(lái)對(duì)蜂蜜的研究主要集中在各種活性成分及抗氧化等活性能力方面。多酚類(lèi)成分是蜂蜜中的重要活性物質(zhì)之一，包括黃酮、單寧、酚酸及其衍生物等[3]。酚酸是蜂蜜中的主要多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化等多種保健功能[4]。黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎[5]等生物學(xué)活性。由于蜂蜜蜜源植物的不同，蜂蜜中的酚酸和黃酮類(lèi)化合物的含量和種類(lèi)也有很大差異。

石榴樹(shù)（Punica granatum L.）為石榴蜜蜜源，是桃金娘目石榴科石榴屬多年生落葉喬木或灌木。石榴在全國(guó)部分地區(qū)有分布，可食用的名品有安徽淮北百子糖石榴、山東棗莊軟子石榴、陜西臨潼石榴、廣西胭脂紅石榴、四川青皮石榴以及云南蒙自青殼石榴等。云南省地理氣候特征獨(dú)特又復(fù)雜，區(qū)域差異非常明顯，在此條件下孕育出了極其豐富的蜜源植物。云南省一年四季如春，花開(kāi)不斷，養(yǎng)蜂條件優(yōu)越，出產(chǎn)的蜂蜜品種較多，但關(guān)于該地區(qū)石榴蜜中酚酸、黃酮類(lèi)化合物含量的報(bào)道較少。本研究測(cè)定 6 個(gè)云南石榴蜜樣品中多酚類(lèi)成分的含量，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在發(fā)現(xiàn)石榴蜜的保健功能，以期為開(kāi)發(fā)云南的特色蜂蜜提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1樣品6個(gè)石榴蜜樣品均為2015年產(chǎn)自云南省，1、2號(hào)蜜樣采自蒙自縣；3、4號(hào)蜜樣采自巧家縣；5、6號(hào)蜜樣采自建水。樣品采集后均置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2試劑三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、鄰苯三酚、碳酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、魯米諾等均為分析純，均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼DPPH，熒光素鈉（sodium fluorescein），6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchr- oman-2-carboxylic acid trolox，2，2，-azobis（2-methylpropionamidine） dihydrochloride ABAP均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；沒(méi)食子酸（98%）、脫落酸、蕓香苷對(duì)照品購(gòu)自上海佳和生物科技有限公司；木樨草素、芹菜素購(gòu)自四川成都生物技術(shù)有限公司；乙酸購(gòu)自J.T Baker公司；Strata-X-A固相萃取柱（60 mg/3 mL）購(gòu)自廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3主要儀器與設(shè)備微量移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；AL204型分析天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，購(gòu)自長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZF-6090型真空干燥箱，購(gòu)自科學(xué)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，購(gòu)自Merk Millipore公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器，購(gòu)自超聲儀器有限公司；HZS-H型水浴搖床，購(gòu)自東明醫(yī)療儀器廠；24孔固相萃取裝置，購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；恒溫水浴氮吹儀，購(gòu)自北京科林工貿(mào)有限公司；SY21-K型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；Synergy TM HT型多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-tek公司；LC-6AD高效液相色譜儀，購(gòu)自日本島津公司。

1.2方法

1.2.1蜂蜜提取液的制備在Dimitrova和孫春麗研究[6-7]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體步驟如下：（1） 對(duì)固相萃取柱預(yù)處理，用3 mL甲醇進(jìn)行活化，用3 mL pH值=7的超純水進(jìn)行平衡；（2） 稱取蜂蜜樣品30 g，用120 mL超純水稀釋?zhuān)ＡО魯嚢柚练涿弁耆芙?。然后用氨水調(diào)節(jié)至pH值=7，8 000 g離心除去固體不溶物，取上清液倒入處理好的固相萃取柱中。上樣結(jié)束后，用3 mL的超純水 （pH值=7） 清洗，然后用 5 mL 甲酸甲醇 （5 ∶95，V/V） 溶液進(jìn)行洗脫。將洗脫液在 45 ℃ 恒溫水浴中用氮吹至干燥，然后用2 mL色譜級(jí)甲醇溶液復(fù)溶，最后用0.22 μm濾膜過(guò)濾后放于上樣瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蜂蜜提取物中總酚含量的測(cè)定[8]采用Folin-Ciocalteu法，以沒(méi)食子酸作為對(duì)照建立總酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取30 μL蜂蜜提取液，以沒(méi)食子酸相對(duì)含量表示，每1個(gè)品牌的蜂蜜樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.2.3蜂蜜提取物中總黃酮含量的測(cè)定[8]采用AICI3 法，以蕓香苷作為對(duì)照建立總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取1 mL蜂蜜提取物溶液，用蕓香苷的相對(duì)含量表示樣品中黃酮含量，每1個(gè)品牌的蜂蜜樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.2.4DPPH自由基清除能力測(cè)定將蜂蜜樣品用超純水分別稀釋成2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 g/mL，吸取1 mL稀釋后的蜂蜜樣品，并加入0.2 mmol/L 的4 mL DPPH溶液（2 mmol/L）以及5 mL對(duì)應(yīng)的溶劑，混勻，于室溫下避光靜置30 min。然后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定石榴蜂蜜樣品的吸光度，計(jì)算石榴蜜樣品對(duì)DPPH自由基的清除率[9]。

DPPH自由基清除率=（D0-D）/D0×100%；

式中，D0表示空白試劑的吸光度，D表示石榴蜜樣品溶液吸光度。

1.2.5蜂蜜還原力的測(cè)定蜂蜜中的多酚類(lèi)化合物能夠?qū)Fe（CN）6]3- 還原成為[Fe（CN）6]4-，3分子的[Fe（CN）6]4- 和FeCl3又能轉(zhuǎn)化為Fe4[Fe（CN）6]3-，這種物質(zhì)稱為普魯士藍(lán)，是1種深藍(lán)色的復(fù)合物，在700 nm處有強(qiáng)吸度[10]。

在10 mL的試管中分別加入200 μL稀釋成不同濃度的蜂蜜水溶液，然后依次加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值= 6.6）2.5 mL、鐵氰化鉀（2.5 mL，1%），水浴20 min （50 ℃），冷卻至室溫后加入1 mL 三氯乙酸（10%），取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL，三氯化鐵0.5 mL （0.1%），700 nm下測(cè)定石榴蜜樣品的吸光度。以不同濃度Trolox對(duì)比溶液吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.001 62x+0.153 17，r2=0990 54），不同濃度蜂蜜樣品根據(jù)吸光度變化對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其Trolox當(dāng)量，結(jié)果用mg Trolox/100 g表示。

1.2.6過(guò)氧陰離子清除能力（ORAC法）的測(cè)定在Zulueta等研究[11]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體步驟如下：吸取20 μL的稀釋后的蜂蜜樣品液至96孔板中，然后在每個(gè)加樣孔中加入150 μL 熒光素溶液 （8.16×10-2 μmol/L ），覆膜后預(yù)熱（37 ℃）10 min。加入30 μL的ABAP （153 mmol/L），使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)儀測(cè)定條件：發(fā)射波長(zhǎng)是528 nm、激發(fā)波長(zhǎng)是485 nm、振蕩5 s后測(cè)定1次/min，總測(cè)定時(shí)間為50 min。ORAC值為μmol Trolox/100 g。

抗氧化能力=AUC（抗氧化劑）-AUC（空白）。

樣品得出的面積差代入Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出該樣品相應(yīng)的Trolox當(dāng)量，換算成美國(guó)農(nóng)業(yè)部的單位即為該樣品的ORAC值（IC50），ORAC值越大代表抗氧化能力越弱。

1.2.7HPLC色譜條件色譜柱：150×4.6 mm，5μm （Phenomenex Gemini C18），具體參數(shù)設(shè)置：檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm、柱溫箱溫度35 ℃、進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相：B相是甲醇 （含有2%乙酸），A相是水 （含有2%乙酸）。梯度洗脫程序如下：0～8 min，0%～3% B；8～10 min，3%～9% B；10～12 min，9～33；12～16 min，33% B；16～21 min，33%～34% B；21～31 min，34%～36% B；31～41 min，36%～40% B；41～51 min，40%～45% B；51～61 min，45%～52% B；61～71 min，52%～57% B；71～81 min，57%～65% B；81～86 min，65%～99% B；86～110 min，99%～100% B；總流速為0.7 mL/min。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 13.0軟件，采用鄧肯法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[12]。

2結(jié)果與分析

2.1石榴蜜中總酚和總黃酮含量

由表1可知，不同的石榴蜜樣品的總酚和總黃酮含量具有一定的差異。4號(hào)蜜的總酚含量最低，僅為29.28 mg/100 g；1號(hào)蜜和2號(hào)蜜的總酚含量較高，分別為37.25、35.18 mg/100 g。其中，樣品1、2、6總酚含量之間差異不顯著，樣品1、3、4之間呈顯著差異。

此外，不同石榴蜜樣品的黃酮含量相差不大，在 2.31～2.47 mg/100 g 之間，各樣本之間差異不顯著。同時(shí)，各樣品的黃酮含量和總酚含量并無(wú)明顯的相關(guān)性。

2.2石榴蜜的抗氧化能力

總酚和總黃酮含量較高的1號(hào)蜜樣和2號(hào)蜜樣具有較高的清除DPPH·自由基的能力，IC50值分別為（45.54±9.73）、（47.98±7.83） mg/mL；4號(hào)蜜的IC50值為（78.54±11.01） mg/mL，是6個(gè)樣品中清除DPPH·自由基能力最弱的。6個(gè)樣品清除DPPH·自由基能力由大到小依次為2>1>5>6>3>4（表2）。

由表2可知，6個(gè)石榴蜜樣品均具有一定強(qiáng)度的還原力，在157.64～179.67 mg Trolox/100 g蜂蜜之間，并差異不顯著。這表明采自不同地區(qū)的同一品種石榴蜜，還原能力并無(wú)明顯差異，即石榴蜜的還原能力可能與蜜源植物的地域并無(wú)線性關(guān)系。

氧化自由基吸收能力測(cè)定法（ORAC方法），已成為衡量食品抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法，美國(guó)農(nóng)業(yè)部2007、2010年公布的一系列食品的抗氧化能力都是采用ORAC法測(cè)定的[13-14]。各樣本石榴蜜都有明顯的抗氧化性，其中2號(hào)蜜的抗氧化能力最強(qiáng)，ORAC值為（210.73±10.98） μmol Trolox/100 g，與3、5、6號(hào)蜜之間呈顯著差異（P<0.05）；5號(hào)蜜樣的抗氧化能力最弱，ORAC值為182.67±8.21 μmol Trolox/100 g。同時(shí)，對(duì)其顯著性分析可知，5號(hào)蜜與1、2號(hào)蜜之間也呈顯著性差異（P<0.05） （表2）。石榴蜜樣品分別采自不同的地區(qū)，這可能是導(dǎo)致其抗氧化性差異的1個(gè)因素，由2號(hào)蜜（采自云南蒙自）抗氧化能力最強(qiáng)，或許可以推斷這一地區(qū)的蜜源植物（石榴）比較優(yōu)質(zhì)。

2.3石榴蜜中多酚類(lèi)成分測(cè)定

按相同的色譜條件檢測(cè)6個(gè)石榴蜜樣品中的3種酚類(lèi)化合物含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0，結(jié)果見(jiàn)表3，樣品色譜圖見(jiàn)圖1（其中1、2、3號(hào)峰分別代表脫落酸、木樨草素和芹菜素）。

2.4石榴蜜中3種酚類(lèi)化合物含量

由表3可知，6個(gè)石榴蜜樣品的酚類(lèi)化合物含量差異顯著，脫落酸含量2號(hào)蜜最高（144.12 μg/100 g），4號(hào)蜜最低（65.02 μg/100 g）；木樨草素含量同樣是2號(hào)蜜中最高

3討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同石榴蜜的總酚含量、清除 DPPH 自由基能力、清除過(guò)氧陰離子能力及還原能力各不相同?？偡雍颗c還原能力、抗氧化能力呈正相關(guān)，而總黃酮含量與總酚含量、還原能力及清除DPPH 自由基能力無(wú)明顯的相關(guān)性。與其他研究的比較，所有石榴蜜樣品均具有一定的抗氧化活性，抗氧化能力與還原能力及總酚酸含量正相關(guān)。石榴蜜具有一定的抗氧化活性，其抗氧化能力因樣品產(chǎn)地的不同而有所差異。不同產(chǎn)地的石榴蜜樣品所含的酚類(lèi)化合物的含量不同，導(dǎo)致其抗氧化能力不盡相同。同種蜂蜜所具有的化學(xué)成分的種類(lèi)和結(jié)構(gòu)與不同種蜂蜜相差較小，因而總黃酮含量與還原能力能夠表現(xiàn)出高度的相關(guān)性。石榴蜜來(lái)源復(fù)雜，并且環(huán)境條件對(duì)蜜源也有一定的影響，因而導(dǎo)致不同樣本的石榴蜜在酚類(lèi)成分的含量及抗氧化活性方面表現(xiàn)出一定的差異性。

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