楊佳瑤++申紅妙++賈招閃++郭金堂++冉隆賢

摘要：為了研究不同品種及葉齡的葡萄葉提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子的影響，選用3個(gè)葡萄品種，制備其新葉、老葉的乙醇提取物，測(cè)定不同提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子釋放、萌發(fā)和游動(dòng)性的影響。結(jié)果表明，不同品種的葡萄葉提取物對(duì)霜霉病菌的游動(dòng)孢子均有明顯的抑制作用，并且新老葉之間差異較小；抗病品種巨峰葉片提取物在濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)游動(dòng)孢子釋放、萌發(fā)的抑制率都能達(dá)90%，并能使游動(dòng)孢子失去游動(dòng)性；感病品種紅乳葉片提取物在濃度為10 mg/mL以上時(shí)才能達(dá)到上述效果；感病品種美人指葉片提取物在濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)游動(dòng)孢子萌發(fā)的抑制率可達(dá)90%，在濃度為10 mg/mL時(shí)才對(duì)游動(dòng)孢子的釋放、游動(dòng)性具有強(qiáng)烈的抑制作用。由結(jié)果可知，抗病品種的葡萄葉提取物的抑制效果要好于感病品種，而同一品種的新葉和老葉之間差異基本不顯著。

關(guān)鍵詞：葡萄霜霉??；葉提取物；葡萄生單軸霉菌；葡萄；游動(dòng)孢子；霜霉病防治

中圖分類號(hào)： S436.631.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0079-03

葡萄霜霉病是世界上最嚴(yán)重的卵菌病害之一，多發(fā)生在雨水較多的地區(qū)和年份[1]，在我國(guó)各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布，其病原為葡萄生單軸霉菌[Plasmopara viticola （Berk. et Curt.） Burl. et de Toni]，屬于藻物界（假菌界）卵菌門卵菌綱霜霉菌目單軸霉屬，是一種專性寄生菌，主要危害葡萄的葉片、新梢、卷須、嫩梢、葉柄、花穗梗等[2]。該菌的無(wú)性階段會(huì)產(chǎn)生大量孢子囊，在高濕、溫暖的條件下，梨形的孢子囊會(huì)釋放多個(gè)具有雙鞭毛的游動(dòng)孢子，當(dāng)游動(dòng)孢子靠近氣孔后會(huì)收縮其鞭毛變?yōu)殪o止孢，隨后萌發(fā)產(chǎn)生芽管，由氣孔侵入寄主。孢子囊可以通過(guò)雨水、空氣等條件傳播后再次進(jìn)行侵染。在適宜條件下，病菌傳播迅速且危害巨大，每年都會(huì)給葡萄產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子的釋放、游動(dòng)、萌發(fā)是病菌完成侵染的關(guān)鍵，也是病害發(fā)生最重要的階段和病害防治的關(guān)鍵時(shí)期。Islam等研究發(fā)現(xiàn)，2，4-二乙?；g苯三酚（DAPG）及其衍生物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子的釋放和游動(dòng)性均有良好的抑制作用[5]；Abdalla等研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌ANK313菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子的游動(dòng)性具有強(qiáng)烈的抑制作用，同時(shí)還表現(xiàn)出對(duì)游動(dòng)孢子具有較強(qiáng)的溶解作用[6]。目前葡萄霜霉病的防治手段以化學(xué)農(nóng)藥為主，雖然化學(xué)農(nóng)藥具有高效、速效和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，但是由于大量使用，造成病原產(chǎn)生抗藥性、破壞環(huán)境及影響人類健康等諸多弊端[7]。植物源農(nóng)藥主要來(lái)源于植物體內(nèi)，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機(jī)體中大部分有機(jī)物質(zhì)。與化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有環(huán)境相容性好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、生物活性多樣、種類多、開發(fā)途徑多等優(yōu)點(diǎn)[8]。近年來(lái)，利用植物源提取物防治葡萄霜霉病的研究日漸增多，焦文哲研究表明，樟樹、桉樹、馬齒莧的不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)葡萄霜霉病具有很好的防治作用[9]；郭秀萍等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄、委陵菜以及無(wú)花果葉片的有機(jī)提取物能降低葡萄生單軸霉菌的侵染率[10]。

葡萄作為一種具有抗菌活性的生物質(zhì)資源，具有廣闊的發(fā)展前景。葡萄體內(nèi)包含大量的抗微生物活性的化學(xué)成分，如酚酸類、鞣酸類、黃酮類和茋類等[11-12]。Schnee等在葡萄藤提取物中發(fā)現(xiàn)，6種物質(zhì)對(duì)葡萄生單軸霉菌具有良好的抑制作用[13]；袁茜等研究認(rèn)為，葡萄葉有機(jī)提取物能明顯抑制黃瓜、辣椒枯萎菌的生長(zhǎng)[14]；李曉瓊等研究發(fā)現(xiàn)，圓葉葡萄葉提取物對(duì)南方根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)的毒殺活性[15]。關(guān)于葡萄不同抗性品種之間存在的抑菌物質(zhì)的種類和含量是否存在差異，以及是否都能對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子產(chǎn)生抑制作用尚未見報(bào)道。為了測(cè)定不同抗性葡萄品種，以及不同葉齡葡萄葉提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌的抑制作用，本研究選取對(duì)霜霉病具有不同抗性的3個(gè)葡萄品種，制備其新葉、老葉的乙醇提取物，測(cè)定不同乙醇提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子釋放、萌發(fā)和游動(dòng)性的影響，旨在為葡萄葉提取物應(yīng)用于葡萄霜霉病防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試葡萄品種巨峰、紅乳、美人指的新葉、老葉均采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃，其中巨峰為抗病品種，紅乳、美人指為感病品種[16-17]。從枝條頂端以下算起，第2、3張葉片視為新葉，第6、7張葉片視為老葉。

葡萄生單軸霉菌，分離自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃發(fā)病葉片。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葡萄葉提取物的制備將3個(gè)品種健康的新葉、老葉分別用清水洗凈晾干，放入烘箱內(nèi)于60 ℃烘至恒質(zhì)量，用微型植物粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩。分別取過(guò)篩的材料，按料液比1 g ∶8 mL與95%乙醇混合，在40 ℃超聲提取30 min，用4層紗布過(guò)濾；濾液于8 000 r/min離心20 min，取上清液在恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至固態(tài)，最后用50%乙醇定容至原植物干樣含量為1 g/mL的提取母液[14]。分別將母液用無(wú)菌水稀釋成1、5、10、50、100 mg/mL備用。

1.2.2葡萄葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子釋放的影響將新鮮病葉采回，用清水洗凈，葉柄用脫脂棉包扎后置于鋪有紗布的培養(yǎng)皿中，于20 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)2 d，待新孢子囊成熟，用毛筆將孢子囊刷至無(wú)菌水中，用單層鏡頭紙過(guò)濾，配成濃度為106個(gè)/mL的孢子囊懸浮液[18]。然后將不同濃度葡萄葉提取物分別與孢子囊懸浮液按體積比1 ∶1混合，分別用5%乙醇、無(wú)菌水與孢子囊懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對(duì)照，混合后放置在22 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 h后置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)處理觀察20個(gè)視野，記錄每個(gè)視野下游動(dòng)孢子的數(shù)量（個(gè)），并計(jì)算抑制率，相關(guān)公式：

游動(dòng)孢子釋放抑制率=[（對(duì)照游動(dòng)孢子總數(shù)-處理游動(dòng)孢子總數(shù)）/對(duì)照游動(dòng)孢子總數(shù)]×100%。

1.2.3葡萄葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響孢子囊懸浮液的制備同“1.2.2”節(jié)，待游動(dòng)孢子釋放后加入NaCl，使懸浮液中NaCl含量為10 mmol/L，輕輕搖晃以促進(jìn)游動(dòng)孢子停止萌發(fā)[19]。然后將不同濃度葡萄葉提取物與懸浮液按體積比 1 ∶1 混合，分別用5%乙醇、無(wú)菌水與懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對(duì)照，放入22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，鏡檢游動(dòng)孢子的萌發(fā)數(shù)，每個(gè)處理檢驗(yàn)不少于200個(gè)獨(dú)立的游動(dòng)孢子，計(jì)算游動(dòng)孢子萌發(fā)抑制率，相關(guān)公式：

游動(dòng)孢子萌發(fā)抑制率= [（對(duì)照游動(dòng)孢子萌發(fā)率-處理游動(dòng)孢子萌發(fā)率）/對(duì)照游動(dòng)孢子萌發(fā)率]×100%。

1.2.4葡萄葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子游動(dòng)性的影響將濃度為106個(gè)/mL的孢子囊懸浮液置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中2 h，待游動(dòng)孢子被釋放后，將懸浮液與不同葡萄葉提取物按體積比1 ∶1混合，分別用5%乙醇、無(wú)菌水與懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對(duì)照，5 min后置于200倍光學(xué)顯微鏡下檢查游動(dòng)孢子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[20]。每個(gè)處理觀察不少于15個(gè)視野，并記錄每個(gè)視野下具有游動(dòng)性的游動(dòng)孢子數(shù)量，計(jì)算每個(gè)視野下的平均值。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄葉提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子釋放的影響

由圖1可知，隨著處理濃度的增加，3個(gè)品種葡萄的新葉和老葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制率也顯著提高；當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，各個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子的釋放均無(wú)明顯抑制作用。巨峰葉片提取物處理濃度為 5 mg/mL 時(shí)，對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制率達(dá)90%；當(dāng)濃度提高到10 mg/mL時(shí)，對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制率可達(dá)95%；當(dāng)處理濃度為50 mg/mL及以上時(shí)可完全抑制游動(dòng)孢子的釋放，且新老葉作用基本相同，與其他處理相比不存在顯著差異（圖1-a）。紅乳葉片提取物對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制能力較弱，新葉、老葉之間無(wú)顯著差別，當(dāng)處理濃度為5、10、50 mg/mL時(shí)，對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制率均低于巨峰、美人指葉片提取物；當(dāng)處理濃度達(dá)到100 mg/mL時(shí)，其抑制率才能達(dá)到另兩者濃度為50 mg/mL的抑制水平（圖1-b、圖1-c）。美人指葉片提取物處理濃度為5 mg/mL時(shí)，新葉、老葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制率分別為75%、58%，存在顯著性差異；當(dāng)處理濃度大于10 mg/mL時(shí)，新老葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子釋放的抑制率均為95%以上，且差異不明顯（圖1-c）。

2.2葡萄葉提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，當(dāng)處理濃度為1 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物均不能明顯抑制游動(dòng)孢子的萌發(fā)；當(dāng)處理濃度為5 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子的萌發(fā)抑制率顯著提高，只有紅乳新葉的抑制率仍較低，為77%，其他葡萄葉提取物抑制率均在90%左右，同品種新老葉提取物之間無(wú)顯著差異；當(dāng)處理濃度為10 mg/mL及以上時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉和老葉提取物均能明顯抑制游動(dòng)孢子的萌發(fā)，且不存在顯著差異。

2.3葡萄葉提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子游動(dòng)性的影響

由表1可知，當(dāng)處理濃度為1 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物均不影響游動(dòng)孢子的游動(dòng)性，并且與對(duì)照無(wú)明顯差異，巨峰葉片提取物在處理濃度為5mg/mL及以上時(shí)，使游動(dòng)孢子完全失去游動(dòng)性，與對(duì)照差異顯著，并且新葉、老葉的作用相同；紅乳葉片提取物在處理濃度為5 mg/mL

時(shí)，對(duì)游動(dòng)孢子的游動(dòng)性產(chǎn)生抑制作用，與巨峰處理無(wú)顯著差異，但與對(duì)照有顯著差異；在處理濃度為10 mg/mL及以上時(shí)，使游動(dòng)孢子完全失去游動(dòng)性，并且新、老葉之間無(wú)明顯差異；美人指葉片提取物當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)游動(dòng)孢子的游動(dòng)性產(chǎn)生抑制作用，并與對(duì)照有顯著差異，但是顯著低于巨峰葉片提取物，新葉的抑制作用也低于老葉，在10 mg/mL濃度下，對(duì)游動(dòng)孢子游動(dòng)性的抑制作用增強(qiáng)，美人指老葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子游動(dòng)性的影響顯著好于新葉提取物，當(dāng)濃度為 50 mg/mL 及以上時(shí)，使游動(dòng)孢子失去游動(dòng)性。運(yùn)動(dòng)中的游動(dòng)孢子鞭毛透明，其形態(tài)在顯微鏡下不明顯，而失去游動(dòng)性的游動(dòng)孢子鞭毛變得清晰可見，并向兩側(cè)伸展（圖3）。

3結(jié)論與討論

本研究表明，3個(gè)葡萄品種新葉和老葉的乙醇提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子的釋放、萌發(fā)及游動(dòng)性均有良好的抑制作用。在高濃度下不同葡萄品種、葉齡的葡萄葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子均有顯著的影響且無(wú)明顯差異；在低濃度下巨峰葉片提取物的抑制效果最穩(wěn)定，好于紅乳、美人指葉片提取物。相比較而言，抗病品種的葡萄葉提取物的抑制效果要好于感病品種，而同一品種的新葉和老葉之間差異較小。因此可見，在不同抗性品種、不同葉齡葡萄葉中抑菌活性物質(zhì)的種類沒有差別，只是含量有所不同，這與Pezet等的研究結(jié)果[20-21]一致。結(jié)合葡萄葉提取物對(duì)游動(dòng)孢子3個(gè)方面的影響和不同濃度的抑制效果，建議在應(yīng)用葡萄葉提取物防治葡萄霜霉病時(shí)抗病品種提取物采用5 mg/mL以上濃度，感病品種提取物采用 10 mg/mL 以上濃度為宜。

本研究初步探討了葡萄葉乙醇提取物對(duì)葡萄生單軸霉菌游動(dòng)孢子的抑制作用，但是對(duì)于田間防治效果尚須進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，在處理濃度為5 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物都有游動(dòng)孢子的釋放、萌發(fā)，但與對(duì)照相比其釋放的游動(dòng)孢子大多數(shù)為不具游動(dòng)性的畸形孢子，萌發(fā)的游動(dòng)孢子也存在一定的畸形且芽管短小，其中的作用機(jī)制和活性成分尚不明確，今后還須要進(jìn)一步研究。

植物源農(nóng)藥產(chǎn)品中除有效成分外，還含有其他多種物質(zhì)。有些物質(zhì)表現(xiàn)出特殊的生物活性，例如促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物提高抗病性和抗逆性、改善作物的品質(zhì)等[22]。前人研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉有機(jī)提取物可以提高葡萄葉片內(nèi)2種防御酶的活性[10]，圓葉葡萄葉乙醇提取物可以增加番茄的高度、鮮質(zhì)量和根長(zhǎng)[15]。關(guān)于葡萄葉乙醇提取物是否能誘導(dǎo)葡萄對(duì)霜霉病產(chǎn)生抗性以及對(duì)葡萄是否具有促生作用也須要做進(jìn)一步研究。

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