陳之忍，馬 猛，申玉霞，吳林楠，劉香利,2，趙惠賢,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵 712100)

TaCYP78A5基因過(guò)表達(dá)小麥的遺傳和功能初步分析

陳之忍1，馬 猛1，申玉霞1，吳林楠1，劉香利1,2，趙惠賢1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵 712100)

為了驗(yàn)證小麥籽粒大小相關(guān)基因 TaCYP78A5在小麥籽粒發(fā)育中的功能，對(duì)pINO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 TaCYP78A5基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥后代株系進(jìn)行了鑒定，檢測(cè)了T0代植株目標(biāo)基因拷貝數(shù)，定量分析了7個(gè)T1代陽(yáng)性植株的目標(biāo)基因表達(dá)，并對(duì)其籽粒大小進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，利用Bar試紙條和目標(biāo)基因特異PCR檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)21株轉(zhuǎn)基因T0代再生苗進(jìn)行檢測(cè)，共鑒定出14個(gè)陽(yáng)性植株，除2個(gè)植株的目標(biāo)基因拷貝數(shù)為3和1個(gè)植株為7外，其余11個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)基因插入拷貝數(shù)均為1～2個(gè)，其中有6個(gè)單拷貝植株。與野生型相比，7個(gè)T1代陽(yáng)性植株目標(biāo)基因表達(dá)量均極顯著增加，粒厚和粒寬均有不同程度增加，粒重極顯著增加。

小麥； TaCYP78A5基因；Bar基因；轉(zhuǎn)基因株系

小麥(TriticumaestivumL.)是主要的糧食作物之一，在谷物種植中居于首位[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，全球范圍內(nèi)耕地面積下降，環(huán)境逐漸惡化，使得小麥生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，提高小麥產(chǎn)量，維持其可持續(xù)供應(yīng)具有重要意義[2]。籽粒大小是決定谷物產(chǎn)量的重要組成因素之一，也是現(xiàn)代作物育種的一個(gè)重要選擇性狀[3-4]。在水稻和擬南芥中，許多與種子大小相關(guān)的基因都已被克隆并進(jìn)行了功能鑒定，但小麥種子大小相關(guān)基因的分離和功能研究?jī)H有個(gè)別報(bào)道[5]。

細(xì)胞色素P450(Cytochromes P450)是植物最大的蛋白家族之一[6]，此類蛋白含有硫羥基和血紅素結(jié)構(gòu)域，在多個(gè)生化代謝途徑中起著重要的作用，參與多種生物合成和分子解毒[7]。 CYP78A家族是植物特有的細(xì)胞色素P450家族成員，在陸生植物中高度保守[8]。許多 CYP78A家族成員作用于植物生殖器官和籽粒的生長(zhǎng)發(fā)育，被認(rèn)為是可以用于作物改良[9]。例如，在擬南芥中， KLUH(KLU)/CYP78A5以及 CYP78A7通過(guò)非細(xì)胞自主信號(hào)來(lái)促進(jìn)器官的生長(zhǎng)，它們的活性高低與種子大小成正相關(guān)[10]；在水稻中， CYP78A13通過(guò)調(diào)節(jié)胚與胚乳之間的大小平衡來(lái)調(diào)節(jié)種子的大小，功能缺失突變體的種子胚增大但胚乳減小，而過(guò)表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致種子的胚減小和胚乳增大[4,11]；在番茄中，KLUH的直系同源基因SIKLUH通過(guò)增加果皮和中隔組織細(xì)胞數(shù)目增大了果實(shí)的體積，提高了果實(shí)的品質(zhì)[12]。

本實(shí)驗(yàn)室馬 猛等[5,9]采用大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)基因沉默(BSMV-VIGS)的技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，小麥 TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因沉默可導(dǎo)致小麥籽粒變小，而在擬南芥中過(guò)表達(dá) TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因可導(dǎo)致其種子增大。由此初步認(rèn)為， TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因具有調(diào)控小麥籽粒大小的功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 TaCYP78A5基因在小麥種子發(fā)育中的功能，本研究以擬南芥胚珠珠被特異表達(dá)啟動(dòng)子pINO(Promoter of INNER NO OUTER)驅(qū)動(dòng)的 TaCYP78A5基因過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301-TaCYP78A5 轉(zhuǎn)化春小麥JW1所得T0代和T1代轉(zhuǎn)基因植株為材料，進(jìn)行分子檢測(cè)及遺傳 分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料及載體

由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化并經(jīng)PPT篩選攜帶 TaCYP78A5基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株和野生型受體小麥JW1由濟(jì)南邦迪生物科技有限公司提供。轉(zhuǎn)化所用雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA3301- TaCYP78A5由本實(shí)驗(yàn)室程繪繪[13]構(gòu)建，其T-DNA結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.1.2 試劑

2×EsTaqMasterMix和DNA Marker DL2000為康為世紀(jì)產(chǎn)品；2× Premix ExTaq、Fruit-mateTMfor RNA Purification和RNAiso Plus為TaKaRa產(chǎn)品；GoScriptTMReverse Transcriptase System和2× SYBR Green Master Mix為Promega產(chǎn)品；PAT/Bar檢測(cè)試紙條為EnviroLogix產(chǎn)品；引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

Camv35S：花椰菜病毒35S強(qiáng)啟動(dòng)子；pINO：胚珠珠被特異性啟動(dòng)子。

Camv35S:Cauliflower mosaic virus 35S promoter; pINO:Promoter of INNER NO OUTER.

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA3301- TaCYP78A5的T-DNA結(jié)構(gòu)

Fig.1 T-DNA region of plant expression vector pCAMBIA3301- TaCYP78A5

1.2 方 法

1.2.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株Bar試紙條檢測(cè)及目標(biāo)基因特異PCR檢測(cè)

野生型JW1和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化篩選后再生植株于株高3～5 cm時(shí)進(jìn)行移栽，移栽前剪取部分葉片至1.5 mL離心管中，用研磨棒搗碎，加入500 μL EB2 Extraction Buffer，將試紙條按正確方向插入混合液中，靜置10 min，觀察條帶的變化。

再生植株移栽溫室后，三葉期取葉片，利用CTAB法提取其基因組DNA。以ddH2O為空白對(duì)照，野生型小麥JW1為陰性對(duì)照，植物表達(dá)載體pCAMBIA3301- TaCYP78A5為陽(yáng)性對(duì)照，利用特異性引物SPA5-F/SPA5-R(SPA5-F:5′-GC TACGACGATTTCACAAGCCAAG-3′，位于目標(biāo)基因 TaCYP78A5內(nèi)；SPA5-R：5′-GCCTG CCCAACCTTTCGGTAT-3′，位于GUS基因內(nèi))對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系：2× EsTaqMasterMix 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，照相分析。

1.2.2 T0代轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)

通過(guò)qPCR(TaqMan探針?lè)?對(duì)Bar試紙條及目標(biāo)基因特異PCR鑒定均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)。內(nèi)參基因選用小麥中的單拷貝基因Pinb[14]。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目標(biāo)基因所用引物和探針，為了防止內(nèi)源基因?qū)z測(cè)的干擾，上游引物位于目標(biāo)基因 TaCYP78A5上，下游引物和探針位于GUS基因上。引物和探針序列見(jiàn)表1。以5倍梯度稀釋的轉(zhuǎn)基因植株T0A5-21的基因組DNA為模板，ddH2O為空白對(duì)照，野生型小麥JW1為陰性對(duì)照，進(jìn)行qPCR，3個(gè)重復(fù)，得到Pinb和 TaCYP78A5基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)體系：2× Premix ExTaq10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.25 μL，5 μmol·L-1的TaqMan探針1.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。參照劉振華等[14]和Weng等[15]的方法對(duì) TaCYP78A5基因的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，各待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)得到其Ct值，由公式X=2×10[(Ctx-Ix)/Sx-(CtR-IR)/SR] 計(jì)算出目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。其中，IX和IR是 TaCYP78A5和Pinb的標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SX和SR是 TaCYP78A5和Pinb的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，CtX和CtR是各待測(cè)樣品 TaCYP78A5與Pinb基因的Ct值。 TaCYP78A5基因的拷貝數(shù)估測(cè)值是將X值的小數(shù)按大于0則入的原則只保留整數(shù)得到的。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物及探針序列Table 1 Sequences of primer and probe for real-time PCR

1.2.3 T1代單拷貝轉(zhuǎn)基因植株最適Basta濃度的確定及其目標(biāo)基因的遺傳分析

將6個(gè)T0代單拷貝植株及野生型JW1植株種子在溫室中加代繁殖，于三葉期，利用CTAB法提取T1代基因組DNA，對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系及條件同1.2.1。于拔節(jié)期，設(shè)置5個(gè)Basta溶液濃度梯度(10、20、50、100和200 mg·L-1)，用棉簽將Basta溶液均勻涂抹于轉(zhuǎn)基因小麥和野生型JW1葉片，5個(gè)重復(fù)，每隔2 d觀察表型，一周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。利用確定的最適Basta濃度涂抹T1代各轉(zhuǎn)基因植株，比較其和PCR鑒定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性植株和陰性植株的數(shù)量。

1.2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)基因的表達(dá)量檢測(cè)

選取7個(gè)T1代陽(yáng)性植株(T1A5-18株系所對(duì)應(yīng)的T1代植株由于錯(cuò)過(guò)取樣時(shí)間而沒(méi)有取樣)和野生型JW1，取其開(kāi)花前胚珠，采用試劑盒提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系：5×Reaction Buffer 4 μL，25 mmol·L-1MgCl24 μL，Random Primer 0.5 μL，qA5-R 0.5 μL，PCR Nucleotide Mix 1 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.4 μL，Reverse Transcriptase 1 μL，RNA 8 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃退火5 min，42 ℃延伸30 min，70 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活15 min。得到cDNA后通過(guò)qRT-PCR來(lái)檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)情況，內(nèi)參基因選擇GADPH來(lái)進(jìn)行歸一化處理。定量PCR以ddH2O為空白對(duì)照，野生型小麥JW1為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系：2× SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)。目標(biāo)基因檢測(cè)所用引物為qA5-F/qA5-R(表1)，內(nèi)參基因引物為GADPH-F/GADPH-R(GADPH-F：5′-CCTTCCGTGTTCCCACTGTTG-3′；GADPH-R：5′-ATGCCCTTGAGGTTTCCCTC-3′)。qRT-PCR結(jié)束后，分析各植株的Ct值，計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株籽粒大小的統(tǒng)計(jì)

待小麥種子成熟并干燥后，選取qRT-PCR分析所用7個(gè)陽(yáng)性植株的主穗穗中部的10粒種子，用游標(biāo)卡尺測(cè)定粒寬、粒長(zhǎng)和粒厚，同時(shí)使用電子天平測(cè)量單粒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果

對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了Bar試紙條檢測(cè)及多次重復(fù)PCR檢測(cè)，圖2A中Bar試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照(野生型JW1)和陰性轉(zhuǎn)基因植株只顯示一條控制線，而陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株則可同時(shí)顯出控制線和檢測(cè)線；圖2B中PCR檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照(ddH2O)和陰性對(duì)照(野生型JW1)基因組均沒(méi)有擴(kuò)增出預(yù)期目的條帶，而陽(yáng)性對(duì)照(pCAMBIA3301-TaCYP78A5質(zhì)粒)與陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出與理論值一致的1 353 bp目的條帶。從圖2中可以看出，Bar試紙條檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，21株轉(zhuǎn)基因再生苗中共鑒定出14株陽(yáng)性植株。

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)入基因拷貝數(shù)

以T0A5-21的基因組DNA(5倍的稀釋，設(shè)置5個(gè)梯度)作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，得到Pinb和 TaCYP78A5基因的擴(kuò)增曲線，并以模板濃度(C)的Log值和對(duì)應(yīng)的Ct值為X軸和Y軸，得到Pinb和 TaCYP78A5基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。2個(gè)基因的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都為0.998，接近于1，所以得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于測(cè)定T0代轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因拷貝數(shù)。

分別以各轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的基因組DNA為模板，用內(nèi)參基因Pinb和 TaCYP78A5基因特異引物和探針進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)定3個(gè)重復(fù)，得到其Ct值(表2)，參照劉振華等[14]和Weng等[15]的方法進(jìn)一步計(jì)算各轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)(表2)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后代目標(biāo)基因拷貝數(shù)均較低，14個(gè)陽(yáng)性植株中除了2個(gè)植株的外源基因拷貝數(shù)為3和1個(gè)植株為7外，其余的均為1～2個(gè)拷貝，其中有6個(gè)單拷貝植株，約占總檢測(cè)數(shù)目的一半。

T0A5-1至T0A5-24：轉(zhuǎn)基因植株；M：DL2000；H2O：ddH2O；Y：pCAMBIA3301- TaCYP78A5。

T0A5-1-T0A5-24:Transgenic plants; M:DL2000; H2O:ddH2O; Y:pCAMBIA3301- TaCYP78A5.

圖2 轉(zhuǎn)基因植株Bar試紙條檢測(cè)(A)和PCR檢測(cè)(B)結(jié)果

Fig.2 Pictures of transgenic plants by Basta strips (A) and PCR (B)

圖3 內(nèi)參基因Pinb(A)和目標(biāo)基因 TaCYP78A5(B)的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

轉(zhuǎn)基因植株TransgenicplantCt(Pinb)Ct(TaCYP78A5)X拷貝數(shù)估測(cè)值EstimatedcopiesT0A5-127.22±0.04030.16±0.0050.141T0A5-226.56±0.05027.48±0.0300.731T0A5-325.13±0.02524.67±0.0302.683T0A5-427.64±0.01027.76±0.0101.182T0A5-625.11±0.03025.11±0.1101.872T0A5-1025.83±0.01524.10±0.1656.587T0A5-1325.49±0.08026.44±0.0500.841T0A5-1525.35±0.02026.49±0.0150.761T0A5-1626.33±0.01026.29±0.0101.612T0A5-1826.31±0.01527.38±0.0750.671T0A5-1925.09±0.03524.96±0.0352.083T0A5-2126.02±0.02526.01±0.1001.652T0A5-2228.72±0.02028.28±0.0251.562T0A5-2428.26±0.01529.02±0.0100.651

X：拷貝數(shù)計(jì)算值。X：Caculated copies.

2.3 轉(zhuǎn)基因植株最適Basta濃度

分別用10、20、50、100和200 mg·L-1五個(gè)濃度梯度的Basta溶液涂抹拔節(jié)期的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小麥T1A5-2、陰性轉(zhuǎn)基因小麥T1A5-5和野生型JW1，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，野生型JW1和轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照T1A5-5的葉片在Basta濃度為10 mg·L-1時(shí)，幾乎沒(méi)有變化，隨著B(niǎo)asta溶液濃度的增大，葉片的枯萎面積逐步增大，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，葉片涂抹部分已全部枯萎，而轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小麥株系葉片在Basta溶液濃度200 mg·L-1時(shí)仍保持正常生長(zhǎng)。為了防止假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，選用200 mg·L-1的Basta來(lái)篩選T1代轉(zhuǎn)基因植株，鑒定部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，200 mg·L-1的Basta涂抹結(jié)果與前期PCR鑒定結(jié)果相一致，所以200 mg·L-1的Basta溶液葉片涂抹可用于大規(guī)模篩選含Bar基因的轉(zhuǎn)基因植株。

2.4 轉(zhuǎn)基因單拷貝插入的T0∶1株系目標(biāo)基因的遺傳分析

結(jié)合PCR檢測(cè)與Basta葉片涂抹法的鑒定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)出各T0∶1代株系所對(duì)應(yīng)的T1代陽(yáng)性植株與陰性植株的數(shù)量，其結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，目標(biāo)基因是可遺傳。

2.5 T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株目標(biāo)基因的表達(dá)量

T1代陽(yáng)性植株和野生型JW1開(kāi)花前胚珠總RNA的RT-PCR分析結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，與野生型JW1相比，各轉(zhuǎn)基陽(yáng)植株目標(biāo)基因 TaCYP78A5表達(dá)量都極顯著增加，且各植株間表達(dá)水平存在一定的差異，T1A5-2-8、T1A5-13-2、T1A5-13-9和T1A5-15-7表達(dá)量相對(duì)較高，而T1A5-1-4和T1A5-15-13表達(dá)量相對(duì)較低。

+：陽(yáng)性； -：陰性。

+:Positive; -:Negative.

2.6 T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的籽粒大小

各個(gè)陽(yáng)性植株主穗中部籽粒粒寬、粒長(zhǎng)、粒厚和粒重的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，與野生型相比，各轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的粒寬、粒重和粒厚均有所增加。在粒寬方面，除T1A5-13-2外，其他植株均極顯著增加；在粒長(zhǎng)方面，除T1A5-1-4極顯著增加外，其他植株變化不明顯；在粒厚方面，T1A5-1-4、T1A5-13-2和T1A5-15-7極顯著增加，T1A5-13-9和T1A5-29-9顯著增加，其余植株變化不明顯；在粒重方面，所有植株都極顯著增加。說(shuō)明 TaCYP78A5基因在小麥中過(guò)表達(dá)能夠增加小麥的籽粒大小，從而增加粒重。

3 討 論

外源基因整合在轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)是影響外源基因穩(wěn)定性遺傳和表達(dá)水平的一個(gè)重要因素。轉(zhuǎn)基因植株中以單拷貝形式整合到基因組中的外源基因具有穩(wěn)定遺傳和較好的表達(dá)特性[16-17]，而多拷貝則更容易導(dǎo)致外源基因的沉默[18]。因此，通過(guò)外源基因拷貝數(shù)測(cè)定，獲得低拷貝數(shù)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)于植物遺傳改良有非常重要作用。檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的方法主要有Southern blot和熒光定量PCR，Southern blot所需樣品DNA量大、耗時(shí)、費(fèi)力以及使用放射性同位素等缺點(diǎn)[19]；熒光定量PCR快速靈敏，檢測(cè)結(jié)果也與Southern blot相一致，所以應(yīng)用起來(lái)較為方便[15]。本研究對(duì)小麥 TaCYP78A5過(guò)表達(dá)T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株利用TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行了拷貝數(shù)檢測(cè)，14個(gè)植株中共有6個(gè)單拷貝植株，5個(gè)雙拷貝植株，其余3個(gè)植株在3拷貝以上，這與Zhang等[20]報(bào)道的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中外源基因主要以單拷貝形式整合到基因組中相一致。

表4 T0∶1代轉(zhuǎn)基因株系目標(biāo)基因的遺傳分析Table 4 Genetic analysis of target genes in T0∶1 transgenic lines

**：P<0.01.

E和F中標(biāo)尺為5 mm。 *:P<0.05; **:P<0.01; Scale bars are 5 mm in E and F.

在大規(guī)模轉(zhuǎn)基因后代植株檢測(cè)時(shí)，傳統(tǒng)PCR步驟繁雜、結(jié)果不穩(wěn)定，而B(niǎo)ar試紙條成本較高，即兩種方法均存在一定的局限性。Sato等[21]對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因植株葉片涂抹Liberty除草劑所得到的結(jié)果與后期PCR和Southern blot結(jié)果相一致。李 欣等[22]使用葉片涂抹和植株噴灑對(duì)含Bar基因的轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，200 mg·L-1的Liberty涂抹葉片法比PCR結(jié)果更精確，而植株噴灑Basta最適濃度為100 mg·L-1，Liberty最適濃度為150 mg·L-1。Basta溶液涂抹葉片成本低且效率高，不同轉(zhuǎn)基因受體品種對(duì)Basta溶液的耐受性不同，因此本研究對(duì)小麥JW1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的最適Basta濃度進(jìn)行了摸索，結(jié)果表明，在拔節(jié)期涂抹200 mg·L-1的Basta溶液能夠有效地篩選出陽(yáng)性植株。

細(xì)胞色素P450在植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，其中， CYP78A是植物細(xì)胞色素P450家族中特有的一類[23]。近年來(lái)， CYP78A家族中一些成員都已被證實(shí)與植物生殖器官的發(fā)育有著密切的關(guān)系，如，擬南芥中的 CYP78A5、 CYP78A6、 CYP78A8和 CYP78A9[24]，水稻中的 CYP78A13[11]，大豆中的 CYP78A10和 CYP78A72[8,25]，麻風(fēng)樹(shù)中的 CYP78A98[26]，以及小麥中的 TaCYP78A3和 TaCYP78A5[5,9]。在擬南芥中，Adamski等[10]通過(guò)采用pKLU::vYFPer報(bào)告株系發(fā)現(xiàn)， KLUH/CYP78A5在胚珠發(fā)育時(shí)的內(nèi)珠被中表達(dá)，并且KLU能促進(jìn)胚珠中珠被細(xì)胞的增殖，進(jìn)而來(lái)控制種子的大小。Xu等[4]通過(guò)水稻 CYP78A13突變體證實(shí)了該基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致籽粒增大。Zhao等[8]將 CYP78A72基因在擬南芥及大豆中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥和大豆種子均增大。Tian等[26]從麻風(fēng)樹(shù)中克隆出 CYP78A98基因，構(gòu)建pINO:: JcCYP78A98過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草， CYP78A98基因過(guò)表達(dá)使煙草籽粒大小和粒重增加，并且還提高了種子蛋白和脂肪酸的含量。Ma[5]等利用3種啟動(dòng)子(Camv35S、pINO和pKLU)啟動(dòng) TaCYP78A5基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示， TaCYP78A5基因通過(guò)促進(jìn)胚表皮細(xì)胞增殖來(lái)影響胚的發(fā)育，其表達(dá)量的高低影響著器官和種子的發(fā)育，過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致擬南芥種子增大，初步證實(shí)小麥 TaCYP78A5基因正調(diào)控種子生長(zhǎng)。本研究對(duì) TaCYP78A5基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定分析，并統(tǒng)計(jì)了7個(gè)T1代陽(yáng)性植株的籽粒大小和粒重，在粒寬、粒厚和粒重方面，陽(yáng)性植株與野生型相比均增大，而在粒長(zhǎng)方面，T1A5-13-9和T1A5-24-92與野生型相比變小，其余植株均增大。總體來(lái)說(shuō)， TaCYP78A5基因在小麥中過(guò)表達(dá)能夠增加小麥的籽粒大小并顯著提高粒重，這為后期的小麥高產(chǎn)育種提供了科學(xué)依據(jù)。本研究材料為雜合株系，后期仍需要對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行追蹤檢測(cè)以期獲得轉(zhuǎn)基因純合株系，并能夠?qū)υ摶虻墓δ苓M(jìn)行深入研究。

[1] 陳俊男,高潤(rùn)紅,鄧志英,等.小麥成熟胚組織培養(yǎng)體系優(yōu)化及優(yōu)良轉(zhuǎn)化受體基因型的篩選[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(11):1.CHEN J N,GAO R H,DENG Z Y,etal.Optimization of regeneration system of tissue culture from mature embryos and selection of suitable transformation acceptor genotype in wheat [J].ShandongAgriculturalSciences,2010(11):1.

[2] 金松燦,王春平,孔欣欣,等.黃淮麥區(qū)小麥產(chǎn)量和生理性狀的遺傳增益研究[J].種子,2014,33(9):1.JIN S C,WANG C P,KONG X X,etal.Genetic gain for grain yield and its relational traits in Yellow-Huai River valley winter wheat region [J].Seed,2014,33(9):1.

[3]SHOMURA A,IZAWA T,EBANA K,etal.Deletion in a gene associated with grain size increased yields during rice domestication [J].NatureGenetics,2008,40(40):1023.

[4]XU F,FANG J,OU S,etal.Variations in CYP78A13 coding region influence grain size and yield in rice [J].Plant,Cell&Environment,2015,38(4):800.

[5]MA M,ZHAO H X,LI Z J,etal. TaCYP78A5 regulates seed size in wheat(Triticumaestivum) [J].JournalofExperimentalBotany,2016,67(5):1397.

[6]NELSON D R,SCHULER M A,PAQUETTE S M,etal.Comparative genomics of rice andArabidopsis.Analysis of 727 cytochrome P450 genes and pseudogenes from a monocot and a dicot [J].PlantPhysiology,2004,135(2):756.

[7]SCHULER M A,WERCK-REICHHART D.Fuctional genomics of P450s [J].AnualReviewofPlantBiology,2003,54(1):629.

[8]ZHAO B T,DAI A H,WEI H C,etal.ArabidopsisKLUhomologue GmCYP78A72 regulates seed size in soybean [J].PlantMolecularBiology,2016,90(1):33.

[9]MA M,WANG Q,LI Z J,etal.Expression of TaCYP78A3,a gene encoding cytochrome P450 CYP78A3 protein in wheat (TriticumaestivumL.),affects seed size [J].ThePlantJournal,2015,83(2):312.

[10]ADAMSKI N M,ANASTASIOU E,ERIKSSON S,etal.Local maternal control of seed size by KLUH/CYP78A5-dependent growth signaling [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2009,106(47):20115.

[11]NAGASAWA N,HIBARA K I,HEPPARD E P,etal.GIANTEMBRYOencodes CYP78A13,required for proper size balance between embryo and endosperm in rice [J].ThePlantJournal,2013,75(4):592.

[12]CHAKRABARTI M,ZHANG N,SAUVAGE C,etal.A cytochrome P450 regulates a domestication trait in cultivated tomato [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2013,110(42):17125.

[13] 程繪繪. TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因表達(dá)載體的構(gòu)建及小麥的遺傳轉(zhuǎn)化[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2015:21-23.CHENG H H.Expression vector construction of TaCYP78A3/TaCYP78A5 and wheat transformation [D].Yangling:Northwest A&F University,2015:21-23.

[14] 劉振華,劉香利,李冰冰,等.小麥轉(zhuǎn)基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷貝數(shù)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,22(8):949.LIU Z H,LIU X L,LI B B,etal.Copy number analysis of lipoxygenase RNAi gene (Loxi) in transgenic lines of wheat (Triticumaestivum) [J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2014,22(8):949.

[15]WENG H B,PAN A H,YANG L T,etal.Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by real-time PCR assay withHMGI/Yas an endogenous reference gene [J].PlantMolecularBiologyReporter,2004,22(3):289.

[16]CHENG M,FRY J E,PANG S Z,etal.Genetic transformation of wheat mediated byAgrobacteriumtumefaciens[J].PlantPhysiology,1997,115(3):971.

[17]VAUCHERET H,BéCLIN C,ELMAYAN T,etal.Transgene-induced gene silencing in plants [J].ThePlantJournal,1998,16(6):651.

[18]SONG P,CAI C Q,SKOKUT M,etal.Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERSTM-derived transgenic maize [J].PlantCellReports,2002,20(10):948.

[19] 楊立桃,趙志輝,丁嘉羽,等.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2005,17(2):140.YANG L T,ZHAO Z H,DING J Y,etal.Estimating copy number of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR [J].ChineseJournalofFoodHygiene,2005,17(2):140.

[20]ZHANG J,CAI L,CHENG J Q,etal.Transgene integration and organization in cotton (GossypiumhirsutumL.) genome [J].TransgenicResearch,2008,17(2):293.

[21]SATO S,XING A Q,YE X G,etal.Production of γ-linolenic acid and stearidonic acid in seeds of marker-free transgenic soybean [J].CropScience,2004,44(2):646.

[22] 李 欣,杜麗璞,殷桂香,等.轉(zhuǎn)bar基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥抗除草劑鑒定方法比較[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2012,13(4):596.LI X,DU L P,YIN G X,etal.Comparison of different methods forbargene detection in trangenic or non-transgenic wheat using herbcide as tool [J].JournalofPlantGeneticResources,2012,13(4):596.

[23]NELSON D R.Plant cytochrome P450s from moss to poplar [J].PhytochemistryReviews,2006,5(2-3):193.

[24]BAK S,BEISSON F,BISHOP G,etal.Cytochromes P450 [J].TheArabidopsisBook,2011,9(6):e0144.

[25]WANG X B,LI Y H,ZHANG H W,etal.Evolution and association analysis of GmCYP78A10 gene with seed size/weight and pod number in soybean [J].MolecularBiologyReports,2015,42(2):489.

[26]TIAN Y S,ZHANG M,HU X L,etal.Over-expression of CYP78A98 ,a cytochrome P450 gene fromJatrophacurcasL.,increases seed size of transgenic tobacco [J].ElectronicJournalofBiotechnology,2016,19:15.

Genetic and Functional Analysis of Transgenic Wheat Overexpressing TaCYP78A5 Gene

CHEN Zhiren1,MA Meng1,SHEN Yuxia1,WU Linnan1,LIU Xiangli1,2,ZHAO Huixian1,2

(1.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.State Key Labaratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

In order to verify the function of TaCYP78A5 gene,which is associated with wheat (TriticumaestivumL.) grain size in the process of wheat grain development,the transgenic wheat lines with the TaCYP78A5 gene overexpression under the controlling of pINO promoter were used as materials. The copy number of target gene in T0generation transgenic plants was detected.The expression of the target gene of seven T1positive plants was tested and the grain size were measured. The results showed that out of 21 regenerated seedlings,14 positive plants were obtained by combining Bar strip test and PCR detection. The results of copy number detection showed that two and one transgenic plants had three and seven copies of target gene,respectively,and the rest eleven transgenic plants each had a copy number of 1 or 2,among which there were six single copy plants.Compared with the wild type JW1,the expression levels of the target gene in seven T1positive plants were significantly increased,the grain width and grain thickness were increased by different rates,and the grain weight were significantly increased.

Wheat; TaCYP78A5 gene;Bargene; Transgenic lines

10.7606/j.issn.1009-1041.2017.06.02

時(shí)間：2017-06-07

2017-01-16

2017-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471482，31101205);西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Z109021565，Z109021568)

E-mail：chenzhiren0405@163.com

劉香利(E-mail:liuxianglii@163.com)；趙惠賢(E-mail:hxzhao212@nwafu.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)06-0721-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170607.1004.004.html