楊 雪，葉 麟，高 瑋，申光輝，黎杉珊，張志清

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014； 2.攀枝花市食品藥品監(jiān)督管理局，四川攀枝花 617000)

麥麩酯酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

楊 雪1,2，葉 麟1，高 瑋1，申光輝1，黎杉珊1，張志清1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014； 2.攀枝花市食品藥品監(jiān)督管理局，四川攀枝花 617000)

為了能更好地將麥麩酯酶用于檢測食品中的農(nóng)藥殘留，采用硫酸銨分段沉淀、透析、SephadexG-200凝膠層析、超濾濃縮等方法對麥麩中提取的酯酶粗液進(jìn)行了分離和純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，得到的麥麩酯酶比活力為289.14 U·mg-1，回收率為47.7%，純化倍數(shù)為16.17。麥麩酯酶的分子量約為26.0 kDa，最大紫外吸收峰為224 nm和280 nm，最適反應(yīng)溫度為30 ℃，穩(wěn)定范圍為25～40 ℃；最適pH為8.0，pH穩(wěn)定范圍為4.0～8.0。Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、檸檬酸鈉、四硼酸鈉均對麥麩酯酶有抑制作用，而Fe2+、Mn2+、檸檬酸、硫酸鋁鉀對該酶有促進(jìn)作用；以α-乙酸萘酯為底物的動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值分別為0.85 mg·mL-1和0.93 mg·mL-1·min-1。4 ℃時(shí)，麥麩酯酶半衰期為10.4 d，而25 ℃時(shí)，酯酶半衰期為8.6 d。本研究結(jié)果對麥麩酯酶的應(yīng)用具有一定參考價(jià)值。

麥麩；酯酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

麥麩是小麥加工的副產(chǎn)品，在加工中其產(chǎn)量約為小麥加工量的五分之一[1]。植物酯酶(plant esterase,PE)是植物不同部位、各個(gè)成長時(shí)期的細(xì)胞組成成分[2]，是羧酸酯水解酶類的一種[3]。以植物酯酶作為農(nóng)殘檢測的酶標(biāo)記物[4]，與膽堿酯酶相比，具有價(jià)格低廉、來源廣泛、檢測時(shí)間短、檢測限低、檢測靈敏性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。杜 英等[7]發(fā)現(xiàn)，金屬離子Sn2+、Zn2+、Hg2+、Ag+、Cr6+、Cu2+對海參乙酰膽堿酯酶有不同程度的抑制作用。Surinenaite等[8]從假單胞菌3121-1中分離得到一種脂肪酶， Fe2+、Ba2+、Mn2+對該酶有不同程度的抑制作用，Ca2+、Mg2+、K+、Na+對該酶有不同程度的促進(jìn)作用。目前，國內(nèi)對于酯酶酶學(xué)性質(zhì)的研究主要集中于乙酰膽堿酯酶和脂肪酶，鮮見植物酯酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。本研究擬對麥麩酯酶粗提液進(jìn)行分離純化，并研究純化后酶的酶學(xué)特性，以期為該酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料：麥麩，雅安市售。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 粗酶液的制備

麥麩→粉碎→0.15 mol·L-1、pH 6.5的NaNO3-PBS緩沖液浸提(料液比1∶5，水浴35 ℃，靜置60 min)→過濾(四層紗布)→離心(4 ℃，8 000 r·min-1，5 min)→上清液即為粗酶液。

1.2.2 麥麩酯酶的分離與純化

(1)硫酸銨分段鹽析和透析

在0 ℃條件下，根據(jù)溶液體積和硫酸銨飽和度常用表計(jì)算所需的固體硫酸銨的量，向10 mL的粗酶液中分別緩慢添加固體硫酸銨粉末，使其飽和度分別達(dá)到20%、25%、30%、35%、40%、45%，4 ℃靜置4 h，6 000 r·min-1離心15 min，取上清液并再次緩慢向其加入(NH4)2SO4，使其飽和度分別達(dá)到50%、55%、60%、65%、70%、75%，4 ℃靜置4 h，6 000 r·min-1離心15 min，沉淀即為麥麩酯酶粗提物。用10 mL pH 7.3的0.02 mol·L-1PBS緩沖液溶解沉淀，并測定總酶活和蛋白質(zhì)含量。硫酸銨鹽析分級沉淀時(shí)采用的硫酸銨飽和度各梯度見表1。將分級鹽析后的酶液用超純水4 ℃冷藏透析。

(2) Sephadex G-200凝膠層析

Sephadex G-200常規(guī)處理后自然沉降法裝柱，用0.2 mol·L-1NaCl溶液平衡2～5 h，上樣體積為2 mL，自動收集器收集樣品，洗脫液為0.2 mol·L-1NaCl溶液，流速為0.2 mL·min-1，每管1.8 mL。洗脫結(jié)束以后測定樣品在280 nm處的吸光度及酶活。

(3) 濃縮干燥

收集酶活性較高的樣品進(jìn)行超濾，將超濾后的酶液置于凍干機(jī)內(nèi)(-50 ℃，24 h)進(jìn)行冷凍干燥，制成粉末狀成品。

表1 硫酸銨分級鹽析時(shí)硫酸銨飽和度梯度Table 1 Saturation gradient of ammonium sulfate in fractional salting out

1.2.3 麥麩酯酶酶學(xué)性質(zhì)分析

(1)紫外吸收光譜的確定

取凍干酶粉適量，用超純水配制成1 mg·mL-1的酶液，在200～800 nm波長處進(jìn)行掃描，繪圖查看樣品圖譜的走勢、峰形及出峰位置。

(2)麥麩酯酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性檢測

取凍干酶粉適量，用pH 7.0的 PBS(0.2 mol·L-1)緩沖液配制成1 mg·mL-1的酶液，將酶液在不同溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)下保溫5 min，在室溫下測定酶活力。將酶液在25、30、35、40、45、50 ℃分別保溫2、4、6、8 h后迅速冷卻至室溫，測定酶活力。

(3)麥麩酯酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性檢測

取凍干酶粉適量，用pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PBS(0.2 mol·L-1)緩沖液分別配制成1 mg·mL-1的酶液，在最適溫度下保溫5 min測定其酶活。將pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的酶液4 ℃保溫24、48、72 h后，在最適溫度下測定其酶活。

(4)金屬離子及化學(xué)試劑對麥麩酯酶的影響

取凍干酶粉適量，加入最適pH值的PBS (0.2 mol·L-1)緩沖液配制成1 mg·mL-1的酶液，在麥麩酯酶最適pH值和溫度下，分別加入0.25 mL的2、4、6 mmol·L-1的Mg2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Al3+、檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸鋁鉀、四硼酸鈉0.25 mL，測定酶活力，以未添加金屬離子和有機(jī)化合物時(shí)的麥麩酯酶的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

(5)麥麩酯酶米氏常數(shù)的確定

取凍干酶粉適量，加入最適pH值的PBS (0.2 mol·L-1)緩沖液配制成1 mg·mL-1的酶液，將底物α-乙酸萘酯用無水乙醇配制成不同濃度(0.25、0.75、1.25、1.75、2.25 mg·mL-1)，與純化后的麥麩酯酶反應(yīng)，分別測定不同底物濃度下的反應(yīng)速度(用吸光度A599表示)。以濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖原理，求出米氏常數(shù)Km。

(6)麥麩酯酶半衰期的確定

按上述(5)的方法配制酶液，將酶液分別在4 ℃、25 ℃下保存，每3 d取樣一次，每次用樣0.25 mL，預(yù)熱到室溫，測定麥麩酯酶酶活。根據(jù)以下公式計(jì)算半衰期[9]：t1/2=0.693/[(2.303/t)·lg(E0/E)]

式中：t1/2：半衰期；E0：原始酶活；t：終止時(shí)的天數(shù)；E：t時(shí)的酶活。

1.2.4 酶活測定

取上述各步驟中的酶液0.25 mL→與4.25 mL pH 7.2 的PBS緩沖液混勻→加入0.25 mL 8×10-4mol·L-1的 α-乙酸萘酯溶液→40 ℃恒溫水浴5 min→加入0.25 mL 4.25% 的SDS水溶液和0.3 mg·mL-10.25 mL固蘭B鹽→反應(yīng)30 s→ 加入0.25 mL 50%的HCl溶液→測定。

根據(jù)以下公式計(jì)算單位酶活：

EAs=(k×OD+b)/(5×V)×N

式中：EAs：酶液的單位酶活，1 U定義為在一定條件下，每分鐘催化得到1 μmol α-萘酚所需的酶量；N：酶液的稀釋倍數(shù)；k：α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b：α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；OD：反應(yīng)液的吸光度；V：反應(yīng)酶液的體積；5：測定反應(yīng)時(shí)間為5 min。

根據(jù)以下公式計(jì)算總酶活、比活力、酶活回收率 、純化倍數(shù)：

E1=EAs×V1

式中：E1：酶液總酶活；V1：酶液總體積。

比活力=麥麩酯酶活性/蛋白含量

酶活回收率=處理后的麥麩酯酶酶活/處理前粗提酶液的麥麩酯酶酶活

純化倍數(shù)=處理后的麥麩酯酶比活力/處理前粗提酶液的麥麩酯酶比活力

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定

分別取粗酶液、硫酸銨分級沉淀后的酶液、透析后的酶液、凝膠層析后的酶液以及超濾后的酶液各1 mL，加5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液顯色，在595 nm測吸光度。根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白含量。

1.2.6 SDS-PAGE酶譜分析及分子量測定

電泳條件：濃縮膠濃度為4.5%，電壓90 V，時(shí)間30 min；分離膠濃度為12%，電壓120 V，時(shí)間120 min；電極緩沖液使用pH 8.3的Tris-Gly緩沖液。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250(0.1%)染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均3次重復(fù)。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)顯著性分析，采用Quantity One軟件進(jìn)行電泳圖譜采集和分子量的計(jì)算，其余試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥麩酯酶的最佳分離純化條件

2.1.1 硫酸銨分段鹽析

由圖1可知，隨著硫酸銨濃度的增加，麥麩酯酶純化倍數(shù)和回收率的變化趨勢基本一致。2號管即第一級沉淀硫酸銨飽和度為25%、第二級沉淀硫酸銨飽和度為55%時(shí)的麥麩酯酶純化倍數(shù)和回收率最高。故選擇2號管的硫酸銨飽和度進(jìn)行梯度鹽析。

曲線上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Different letters on curve mean significant difference among treatments(P<0.05).The smae in Fig.5.

圖1 不同硫酸銨飽和度梯度下麥麩酯酶的純化倍數(shù)及回收率

Fig.1 Effect of different saturation of ammonium sulfate on wheat bran esterase purification fold and recovery rate

2.1.2 Sephadex G-200凝膠層析

由圖2可知，洗脫曲線上有一個(gè)主要蛋白峰和3個(gè)雜峰；經(jīng)檢測，第一個(gè)和第二個(gè)峰均具有酶活性，但第二個(gè)峰酶活較低，因此只對第一個(gè)峰的酶進(jìn)行收集、超濾濃縮、真空冷凍干燥，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

2.1.3 麥麩酯酶的純化

由表2可知，與粗酶液相比，經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、透析、凝膠層析以及超濾后的酶活逐漸降低，但比活力分別提高了1.11倍、2.18倍、11.88倍、16.17倍。酯酶比活力的增加表明，經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、透析、凝膠層析以及超濾后，酯酶得到了一定程度的純化。

圖2 SephadexG-200洗脫曲線

純化步驟Purificationstep總酶活Totalenzymeactivity/U總蛋白Totalprotein/mg比活力Specificactivity/(U·mg-1)回收率Recoveryrate/%粗酶液Crudeenzyme1698495017.88100.0硫酸銨分級沉淀Ammoniumsulfateprecipitation1258463719.7674.1透析Dialysis1143029339.0167.3SephadexG-200凝膠層析SephadexG-200gellfiltrationchromatography892242212.4352.5超濾Ultrafiltration809628289.1447.7

2.1.4 SDS-PAGE酶譜分析及分子量測定

由圖3可以看出，經(jīng)過逐級的純化，蛋白雜帶逐漸減少，SDS-PAGE圖譜變得更加清晰，證明純化效果較好，去除了大部分的雜蛋白。植物酯酶的分子量約為29.0 kDa[10]。利用蛋白分析軟件(Quantity One)計(jì)算本試驗(yàn)所提取麥麩酯酶的分子量約為26.0 kDa。圖3中的其他模糊帶可能是由于柱層析載體或洗脫液速度等原因?qū)е旅敢褐泻衅渌s蛋白。

2.2 麥麩酯酶的基本酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 紫外吸收光譜

如圖4所示，純化后的麥麩酯酶有兩個(gè)吸收峰(224 nm和280 nm)。根據(jù)蛋白質(zhì)光譜的特性可知，蛋白質(zhì)在190～380 nm范圍的紫外波長下有兩個(gè)特征吸收峰，一是由于其含有色氨酸和酪氨酸殘基，分子內(nèi)部存在共軛雙鍵，在280 nm處有一個(gè)吸收峰，二是由于肽鍵的存在，在220 nm處有一個(gè)吸收峰。說明麥麩酯酶在蛋白質(zhì)紫外吸收光譜的特征范圍內(nèi)。

2.2.2 麥麩酯酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

從圖5可知，溫度對麥麩酯酶的相對酶活具有顯著影響(P<0.05)，隨著溫度的升高，酶活先升高后降低， 30 ℃時(shí)酶活達(dá)到最大，當(dāng)溫度高于35℃后，酯酶失活速度加快，50 ℃時(shí)，酶的活力僅為最大值的44.17%。這是因?yàn)檫^高的溫度會影響麥麩酯酶活性部位三維結(jié)構(gòu)的完整性，而這種三維結(jié)構(gòu)又是保持酶活力的關(guān)鍵[11]。由表3可知，隨著時(shí)間的延長，麥麩酯酶的相對活性呈下降趨勢。隨溫度升高，相對酶活呈先升后降趨勢，以30 ℃時(shí)相對酶活最高，保溫8 h后仍保留有71.23%的酶活；35 ℃次之，保溫8 h后保留有64.90%的酶活； 50 ℃穩(wěn)定性較差，保溫2 h，相對酶活為64.50%，保溫8 h活性僅保留39.80%。說明麥麩酯酶在較高溫度下的穩(wěn)定性較差，原因可能與溫度對酶構(gòu)象的影響、酶分子的三級結(jié)構(gòu)與原子間的疏水相互作用、范德華力、氫鍵等作用力有關(guān)，熱處理會導(dǎo)致這些鍵不穩(wěn)定從而使酶分子的展開，酶分子的展開會直接影響酶活性中心的特定結(jié)構(gòu)[12]，從而影響酶的活性。

M:Marker; A:粗酶液樣; B:硫酸銨鹽析樣; C:Sephadex G-200柱層析樣; D:超濾濃縮樣。

M:Marker; A:Sample of crude enzyme; B:Sample of ammonium sulfate precipitation; C:Sample of sephadex G-200 gell filtration chromatography; D:Sample of ultrafiltration.

圖3 麥麩酯酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.3 SDS-PAGE picture of wheat bran esterase

圖4 麥麩酯酶紫外吸收光譜圖

圖5 溫度對麥麩酯酶活性的影響

%

對照：最佳條件下的酶活。同行數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，表4～6同。

Control:The enzyme activity with the best condition.Different letters following date at same line mean significant difference among treatments(P<0.05).The same in table 4-6.

2.2.3 麥麩酯酶的最適pH及穩(wěn)定性

如圖6所示，麥麩酯酶在pH為8.0時(shí)的相對酶活顯著高于其他處理， pH 7.0、9.0時(shí)的相對酶活顯著高于其他低pH處理，pH為3.0時(shí)的相對酶活顯著低于其他處理，僅為最大值的47.80%，說明麥麩酯酶最適pH值為8。

由表4可知，pH4.0～8.0范圍內(nèi)，麥麩酯酶的相對酶活較穩(wěn)定，pH值為8時(shí)，麥麩酯酶保溫24 h后的相對酶活與空白組沒有顯著差異。表明在最適pH值下，保溫24 h內(nèi)麥麩酯酶酶活較穩(wěn)定，保溫72 h后其相對酶活仍保留有92.10%。pH值為7時(shí)，麥麩酯酶也具有較好的穩(wěn)定性，保溫72 h后其相對酶活保留有89.00%。在過酸的情況下，麥麩酯酶失活較快，在pH值為3時(shí)保溫24 h后，麥麩酯酶的相對酶活僅為18.20%。

2.2.4 金屬離子對麥麩酯酶的影響

由表5可知，Mg2+對麥麩酯酶酶活的影響不顯著；低濃度Cu2+(2 mmol·L-1)對麥麩酯酶相對酶活的抑制作用顯著，而高濃度的Cu2+(4和6mmol·L-1)對麥麩酯酶相對酶活沒有顯著的影響；低濃度Fe2+(2 mmol·L-1)對麥麩酯酶相對酶活具有促進(jìn)作用，高濃度的Fe2+(6 mmol·L-1)對麥麩酯酶相對酶活的抑制作用顯著；Ca2+、Al3+對麥麩酯酶的相對酶活具有顯著抑制作用； 當(dāng)Al3+的濃度為6 mmol·L-1時(shí)，麥麩酯酶的相對酶活僅為41.91%?？赡苁? mmol·L-1的Al3+引起了麥麩酯酶的變性。Ca2+可能與酯酶中的某些基團(tuán)結(jié)合使酯酶的活性降低。供試的不同濃度的Mn2+對麥麩酯酶相對酶活均具有顯著促進(jìn)作用，但各處理間差異不顯著。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Different letters above column mean significant difference among treatments(P<0.05).

圖6 pH對麥麩酯酶活性的影響

Fig.6 Effect of pH on wheat bran esterase activity

表4 麥麩酯酶在不同pH值下保存不同時(shí)間后的相對酶活Table 4 Relative enzyme activity of wheat bran esterase with different pH and time %

表5 不同金屬離子作用下麥麩酯酶的相對活性Table 5 Relative enzyme activity of wheat bran esterase with different metal ions %

2.2.5 化學(xué)試劑對麥麩酯酶的影響

由表6可知，供試濃度的硫酸鋁鉀對麥麩酯酶酶活均具有顯著促進(jìn)作用，但不同處理間差異不顯著，相對酶活最大值達(dá)到了148.29%，表明硫酸鋁鉀對麥麩酯酶酶活具有顯著的促進(jìn)作用。不同濃度的四硼酸鈉對麥麩酯酶相對酶活均具有顯著抑制作用，但不同處理間差異不顯著，檸檬酸對麥麩酯酶相對酶活沒有顯著的影響；不同濃度的檸檬酸鈉對麥麩酯酶相對酶活均具有顯著抑制作用影響，但不同處理間差異不顯著。

表6 不同化學(xué)物質(zhì)作用下麥麩酯酶的相對活性Table 6 Effect of different chemical substances on wheat bran esterase activity %

2.2.6 麥麩酯酶米氏常數(shù)的確定

以反應(yīng)初速度倒數(shù)對底物濃度倒數(shù)作圖，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法獲得的方程為：1/v=0.915[1/S]+1.072 4。由該方程得麥麩酯酶的動力學(xué)參數(shù)，Km和Vmax值分別為0.85 mg·mL-1和0.93 mg·mL-1·min-1。

2.2.7 麥麩酯酶半衰期的確定

由圖7可知，麥麩酯酶在4 ℃條件下，相對酶活下降較慢，半衰期為10.4 d，在15 d時(shí)，相對酶活為36.7%。在25 ℃條件下，半衰期為8.6 d，在12 d時(shí)，相對酶活為37.9%，12 d后酶活迅速下降。因此，推薦將酯酶在4 ℃下避光保存。

圖7 麥麩酯酶的半衰期

3 討 論

本研究中，麥麩酯酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，而來源于大豆的植物酯酶的最適反應(yīng)溫度為25 ℃[13]，原因可能與酶的構(gòu)象有關(guān)。高溫下植物酯酶的酶活會受到顯著影響，這是因?yàn)槊傅鞍椎淖冃允菚r(shí)間和溫度的函數(shù)，隨著溫度的升高，酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。此外，氨基酸序列的長度[14]也是影響酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性的主要因素，不同來源的植物酯酶，其氨基酸序列組成和長度也可能存在差異。本研究中，麥麩酯酶的最適pH為8.0，pH穩(wěn)定范圍為4.0～8.0，這與前人的研究結(jié)果基本一致[15-16]，存在的一定差異可能與酶所在部位或酶的生物學(xué)特性[17]相關(guān)。酶分子只能在一定范圍的pH條件下保持穩(wěn)定，超過界限，酶分子就會變性[18]。過酸或過堿環(huán)境不僅會破壞酶分子的靜電鍵、氫鍵等保持天然構(gòu)象的平衡力，同時(shí)酶分子的解離狀態(tài)以及作用部位及作用方式也會發(fā)生改變[19]。植物酯酶在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下失活速度都很快，但強(qiáng)酸比強(qiáng)堿條件更快[13]。

現(xiàn)有的研究表明，植物酯酶不是單一的酶系，而是由多種酯酶同工酶共同組成[3,13,15,20]，單一的同工酶還可能由不同的酶蛋白亞基構(gòu)成，所以植物酯酶是一個(gè)復(fù)雜的酶體系。周艷利[13]從大豆中提取植物酯酶，經(jīng)差速冷凍離心、硫酸銨鹽析、透析，然后依次進(jìn)行纖維素DEAE-32離子交換層析和葡聚糖Sephadex G-100凝膠過濾層析，最終得到三種純的大豆酯酶同工酶(Soybean Esterase Isozyme,SEI)，分別記為SEIl、SEI2和SEI3，其中，SEI2是由兩個(gè)相對分子量分別為37.2 kDa和21.4 kDa的酶蛋白亞基組成的共聚體。劉文君[21]直接采用DEAE-52離子交換層析對小麥酯酶進(jìn)行提純，最終分離得到三種小麥酯酶同工酶，其中，用0.1 mol·L-1的NaCl進(jìn)行洗脫時(shí)酶活性最高。本試驗(yàn)的后續(xù)研究將從分離純化以得到單一植物酯酶組分著手，以對麥麩酶酯進(jìn)行更深入研究。

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Purification and Characterization of Wheat Bran Esterase

YANG Xue1,2,YE Lin1,GAO Wei1,SHEN Guanghui1,LI Shanshan1,ZHANG Zhiqing1

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an,Sichuan 625014,China; 2.Panzhihua Food and Drug Administration,Panzhihua,Sichuan 617000,China)

Collecting plant esterase from the wheat bran and studying the enzymatic properties in the experiment can provide worthful theoretical data for the application of wheat bran esterase in detecting pesticides in food. The liquid of crude enzyme extraction solution was purified by fractional ammonium sulfate precipitation,dialysis,SephadexG-200 gell filtration chromatography and ultrafiltration. The results showed that the specific activity of the enzyme was 289.14 U·mg-1,and recovery of activity was 47.7%,and the purification fold was 16.17. The molecular weight of wheat bran esterase was 26.0 kDa,and the maximum ultraviolet absorption was at 224 nm and 280 nm. The optimum temperature is 30 ℃,with temperature stability range from 25 to 40 ℃. The optimum pH is 8.0,with stable range from 4.0 to 8.0. Esterase activity was inhibitied by Cu2+,Mg2+,Ca2+,Al3+,citric acid sodium,and sodium tetraborate,while it was enhenced by Fe2+,Mn2+,citric acid,and potassium aluminum sulfate. The esterase kinetic parametersKmandVmaxvalues with α-naphthyl acetate as substrate are 0.85 mg·mL-1and 0.93 mg·mL-1·min-1,respectively. The half-life were 10.4 and 8.6 d when storing at 4 and 25 ℃,respectively. This study made fundamental knowledge for using wheat bran esterase.

Wheat bran; Esterase; Isolation and purification; Characterization of esterase

10.7606/j.issn.1009-1041.2017.06.18

時(shí)間：2017-06-07

2016-10-08

2016-11-07

E-mail：834261391@qq.com

張志清(E-mail:zqzhang721@163.com)

S512.1；S312

A

1009-1041(2017)06-0846-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170607.1005.036.html