周鵬輝，李 進(jìn)，李澤福，蹇木棟，袁小單

(中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司/山東省葡萄酒工程技術(shù)研究中心/山東省企業(yè)技術(shù)中心，山東蓬萊265608)

起泡葡萄酒的酵母菌耐受性研究

周鵬輝，李 進(jìn)，李澤福，蹇木棟，袁小單

(中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司/山東省葡萄酒工程技術(shù)研究中心/山東省企業(yè)技術(shù)中心，山東蓬萊265608)

為了研究起泡葡萄酒的酵母菌穩(wěn)定性，進(jìn)行山梨酸鉀和游離二氧化硫不同濃度的梯度實驗，以確定不同壓力條件下酵母菌的安全耐受濃度。實驗結(jié)果表明，0.20 MPa的低泡葡萄酒山梨酸鉀使用濃度范圍為100～150 mg/L、游離二氧化硫濃度為30～40 mg/L；0.40 MPa的高泡葡萄酒產(chǎn)品山梨酸鉀使用濃度范圍為50～100 mg/L、游離二氧化硫濃度為20～30 mg/L。

起泡葡萄酒； 酵母菌； 耐受性； 山梨酸鉀； 游離二氧化硫； 壓力

在干型葡萄酒的發(fā)酵過程中酵母菌能徹底將葡萄汁中的葡萄糖轉(zhuǎn)化代謝，以保證產(chǎn)品在瓶儲銷售階段的微生物穩(wěn)定性，而對于保留了部分殘?zhí)堑陌胩鹦汀⑻鹦推咸丫?，因其糖分的存在適于酵母菌等微生物的生長繁殖，在生產(chǎn)中若工藝管理不善，極易出現(xiàn)渾濁或沉淀，因此微生物安全問題成為限制殘?zhí)呛枯^高的葡萄酒產(chǎn)品發(fā)展的一個技術(shù)瓶頸。根據(jù)現(xiàn)有研究報道，酵母菌的活性受化學(xué)因素（如高濃度葡萄糖）、物理條件（如溫度）、培養(yǎng)條件（如營養(yǎng)物質(zhì)）、菌齡等諸多因子的影響，而酵母菌在壓力條件下對山梨酸鉀和游硫二氧化硫相關(guān)的研究較少，為此，本實驗通過對酵母菌在不同壓力條件的起泡葡萄酒中耐受性的研究，以探索完善該技術(shù)難題。

1 材料與方法

1.1 材料

起泡葡萄酒基酒：煙臺產(chǎn)區(qū)含有適量殘?zhí)堑拿倒逑阍?，?jīng)下膠處理熱穩(wěn)定檢測合格，基本指標(biāo)為：酒精度6.0%vol；殘?zhí)?5 g/L（以葡萄糖計）；總酸6.0 g/L（以酒石酸計）；pH3.21；濁度0.84 NTU。

酵母菌：起泡葡萄酒發(fā)酵專用酵母菌，由國內(nèi)知名葡萄酒輔料商提供；山梨酸鉀溶液：配制濃度為150 g/L的山梨酸鉀溶液；亞硫酸稀釋液：按6%亞硫酸溶液∶水=1∶3的體積比稀釋，配制1.5%的亞硫酸溶液；雙氧水溶液：將30%的雙氧水原液稀釋100倍配成0.3%的雙氧水稀釋液。

設(shè)備與儀器：濁度儀、恒溫生化培養(yǎng)箱各1臺；酵母培養(yǎng)基、香檳塞、鐵絲扣、香檳杯、750 mL起泡葡萄酒專用耐壓白料玻璃瓶若干；起泡葡萄酒用混氣機(jī)和等壓灌裝機(jī)等配套生產(chǎn)設(shè)施1套，意大利進(jìn)口。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌純化

將活性干酵母活化進(jìn)行單菌落分離，涂布培養(yǎng)，制得純種酵母菌。

1.2.2 菌液制備

將酵母菌溶于生理鹽水中制得酵母菌原液，然后再逐級稀釋制成10-1、10-2、10-3。

1.2.3 接種培養(yǎng)

用起泡葡萄酒混氣機(jī)和等壓灌裝機(jī)等專業(yè)設(shè)備分別生產(chǎn)0.20 MPa和0.40 MPa兩種壓力條件下的酒樣若干瓶，其中每個壓力條件下在打塞前分別添加上述濃度梯度酵母菌液1 mL，山梨酸鉀按照0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L梯度適量添加（按照750 mL/瓶計，下同），游離二氧化硫按照0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L梯度添加，打塞后置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察酒體變化情況。

1.2.4 酵母菌計數(shù)：將接種液（或經(jīng)培養(yǎng)的酒樣）吸1 mL于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，計算酵母總數(shù)。

1.2.5 酒體觀察：用手電照經(jīng)培養(yǎng)的酒樣，記錄酒體內(nèi)部有渾濁或沉淀出現(xiàn)的時間（以天數(shù)計），同時檢測濁度，其余酒樣繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒樣初始指標(biāo)的測定

酒樣經(jīng)過濾、混氣、灌裝等工藝處理后，兩個壓力下的基本指標(biāo)為：0.20 MPa酒樣：CO24.3 g/L，游離二氧化硫18 mg/L，酒精度6.0%vol，殘?zhí)?5 g/L（以葡萄糖計），總酸6.0 g/L（以酒石酸計）；0.40 MPa酒樣：CO27.6 g/L，游離二氧化硫18 mg/L，酒精度6.0%vol，殘?zhí)?5 g/L（以葡萄糖計），總酸6.0 g/L（以酒石酸計）。以不添加山梨酸鉀和游離二氧化硫的酒樣作為實驗空白酒樣。

2.2 酵母菌接種液的濃度

為了準(zhǔn)確了解接種液中的酵母菌濃度情況，需要對接種液進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)（平行實驗），以掌握酒樣接種后酒中的實際菌濃，經(jīng)測定：酵母原液的菌濃為5.6×106個/mL。

2.3 酒樣接種酵母菌的山梨酸鉀作用實驗

山梨酸是一種短鏈的不飽和脂肪酸，可以被人體的代謝系統(tǒng)吸收而迅速分解為二氧化碳和水，在體內(nèi)無殘留，是國家標(biāo)準(zhǔn)中允許添加的高效安全防腐劑。生產(chǎn)中常用其鉀鹽的存在形式——山梨酸鉀，通過抑制微生物體內(nèi)的脫氫酶系統(tǒng)，對霉菌、酵母菌有很強(qiáng)的抑制作用。

實驗將山梨酸鉀的添加濃度分別設(shè)為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，目的在于考察0.20 MPa和0.40 MPa兩個不同壓力條件下不同山梨酸鉀濃度對酵母菌生長繁殖的抑制作用。山梨酸鉀實驗的結(jié)果見表1、表2。

表1 0.20 MPa壓力下不同山梨酸鉀添加濃度的實驗結(jié)果

由表1、表2可以看出：

（1）接種酵母菌液原液后，在0.20MPa和0.40MPa兩個不同壓力條件下，酒體都出現(xiàn)了嚴(yán)重的渾濁現(xiàn)象，最終的濁度都大于7.0 NTU，說明在此酵母菌濃度下即使添加200 mg/L的山梨酸鉀仍不能達(dá)到抑制菌體生長和繁殖的目的。但在0.20 MPa壓力下酒液開始變化的時間和最終渾濁時間都比0.40 MPa下的更早，說明壓力對酵母菌的生長和繁殖具有一定的抑制作用。

表2 0.40 MPa壓力下不同山梨酸鉀添加濃度的實驗結(jié)果

（2）接種10-1酵母菌液后，兩個壓力條件下，酒體也都出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的渾濁現(xiàn)象，說明此酵母菌濃度下山梨酸鉀仍不能起到作用，但開始變化的濁度和最終表現(xiàn)濁度都較接種100酵母菌液的稍低，說明酵母菌的接種量直接影響濁度等酒液外觀指標(biāo)。在0.20 MPa壓力下酒液開始變化的時間和最終渾濁時間都比0.40 MPa下出現(xiàn)的更早，與酵母菌液原液表現(xiàn)規(guī)律一致。

（3）10-2的酵母接種濃度，酒體已經(jīng)不會出現(xiàn)嚴(yán)重渾濁的現(xiàn)象，在0.20 MPa壓力下，山梨酸鉀在150 mg/L時酒體就未出現(xiàn)異常變化；0.40 MPa壓力下，山梨酸鉀在100 mg/L時酒體未出現(xiàn)異常變化；說明此酵母菌濃度時，在0.20 MPa和0.40 MPa壓力條件下，山梨酸鉀對酵母菌產(chǎn)生有效抑制作用的添加濃度范圍分別為100～150 mg/L、50～100 mg/L。

（4）10-3的酵母接種濃度，兩個壓力條件下，酒體均未出現(xiàn)異常變化，說明在此酵母濃度下，在壓力存在時，即使0 mg/L的山梨酸鉀添加量，壓力也對酵母菌的生長和繁殖產(chǎn)生脅迫。

2.4 酒樣接種酵母菌的游離二氧化硫影響實驗

在添加山梨酸鉀的同時，需要考慮游離二氧化硫與山梨酸鉀對酵母菌生長抑制的協(xié)同作用，根據(jù)上述實驗初步確定0.20 MPa和0.40 MPa壓力下山梨酸鉀濃度為150 mg/L、100 mg/L，在此基礎(chǔ)上考慮對游離二氧化硫的濃度進(jìn)行梯度實驗。

將游離二氧化硫的梯度濃度分別設(shè)定為0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L酒樣的初始游離二氧化硫濃度為18 mg/L，通過計算加入適量雙氧水使其濃度達(dá)到上述梯度值。具體實驗結(jié)果見表3、表4。

由表3、表4可以看出：

（1）接種酵母菌原液后，在0.20 MPa和0.40 MPa壓力條件下，酒體都出現(xiàn)了嚴(yán)重的渾濁現(xiàn)象，最終的濁度都大于7.5 NTU，說明在此酵母菌濃度下即使60 mg/L的游離二氧化硫仍不能達(dá)到抑制菌體生長和繁殖的目的。但在0.20 MPa壓力下酒液開始變化的時間和最終渾濁時間都比0.40 MPa下的更早，說明壓力對酵母菌的生長和繁殖具有一定的抑制作用。

（2）接種10-1酵母菌液后，兩個壓力條件下，酒體也都出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的渾濁現(xiàn)象，說明此酵母菌濃度下游離二氧化硫仍不能起到作用，但開始變化的濁度和最終表現(xiàn)濁度都較接種酵母菌原液的延遲和降低。在0.20 MPa壓力下酒液開始變化的時間和最終渾濁時間仍都比0.40 MPa下的出現(xiàn)的更早，與酵母菌原液表現(xiàn)規(guī)律一致。

（3）10-2的酵母接種濃度，在0.20 MPa壓力下，酒體仍出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，但在0.40 MPa壓力下，游離二氧化硫在40 mg/L時酒體未出現(xiàn)異常變化；說明此酵母菌濃度時，0.20 MPa壓力和游離二氧化硫的協(xié)同脅迫并未對酵母菌產(chǎn)生明顯作用，而在0.40 MPa壓力下，協(xié)同脅迫作用明顯，此壓力下游離二氧化硫產(chǎn)生有效抑制作用的添加濃度范圍分別為20～40 mg/L。

表4 0.40 MPa壓力下不同游離二氧化硫添加濃度的實驗結(jié)果

（4）10-3的酵母接種濃度，在0.20 MPa壓力下，游離二氧化硫的添加量直至60 mg/L時，酒體才未出現(xiàn)異常變化，說明在此壓力和酵母菌濃度下，游離二氧化硫產(chǎn)生協(xié)同脅迫的有效作用濃度范圍為40～60 mg/L。而在0.40 MPa壓力下，酒體均未出現(xiàn)異常變化，說明在此壓力和酵母菌濃度下，即使0 mg/L的游離二氧化硫添加量，壓力也對酵母菌的生長和繁殖產(chǎn)生脅迫。

3 結(jié)論

（1）當(dāng)酵母接種量達(dá)到7500個/mL酒樣時，6～8 d后酒體會因酵母的生長繁殖開始出現(xiàn)沉淀。酵母接種量越低，酒體出現(xiàn)沉淀或渾濁程度就會越小，出現(xiàn)的時間就會越晚；山梨酸鉀的添加濃度越大，開始出現(xiàn)酵母繁殖現(xiàn)象的時間就越晚，根據(jù)實驗結(jié)果，建議在0.20 MPa和0.40 MPa兩個壓力條件下，山梨酸鉀添加濃度范圍分別為100～150 mg/L、50～100 mg/L。

（2）對酵母的生長抑制作用來講，游離二氧化硫和山梨酸鉀之間存在協(xié)同抑制作用，總體來看，山梨酸鉀對微生物的抑制作用更強(qiáng)，當(dāng)游離二氧化硫濃度較低時，微生物的繁殖較快，且對酒體造成的渾濁和沉淀影響更為明顯，且壓力也對酵母菌產(chǎn)生生存脅迫，壓力越高越明顯。從實驗中可以得知，建議在0.20 MPa和0.40 MPa兩個壓力條件下，游離二氧化硫添加濃度范圍分別為40～60 mg/L、20～40 mg/L。

（3）從微生物安全和感官質(zhì)量角度綜合考慮，建議對于0.20 MPa左右的低泡葡萄酒產(chǎn)品山梨酸鉀使用濃度范圍為100～150 mg/L、游離二氧化硫濃度為30～40 mg/L濃度過高會對感官產(chǎn)生刺激，影響消費(fèi)者體驗；0.40 MPa左右的高泡葡萄酒產(chǎn)品山梨酸鉀使用濃度范圍為50～100 mg/L、游離二氧化硫濃度為20～30 mg/L。但無論何種類型的產(chǎn)品，灌裝前均應(yīng)通過除菌過濾，確保裝瓶的酒液中無任何酵母菌的存在。

[1] 楊亞珍,查凡,果然,等.釀酒酵母的紫外誘變選育及發(fā)酵條件研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(7)：1664-1667.

[2] 李進(jìn),李澤福,都振江.低醇半干白葡萄酒的酵母菌耐受性研究[J].中國釀造,2011(10)：119-121.

[3] 高年發(fā),高玉榮.低醇干白葡萄酒生產(chǎn)工藝的研究[J].釀酒科技,2000(6)：76-78.

[4] 黃宏慧.低度甜型葡萄酒微生物超標(biāo)的原因及對策[J].食品與生物,2007(7)：9.

[5] 樊璽,李記明.酵母菌的生長因子及特性[J].釀酒科技, 2001(6)：28-29.

[6] 福杰桑.葡萄酒釀造微生物學(xué)——實驗技術(shù)與規(guī)程[M].徐巖,康文懷,譯.北京：中國輕工業(yè)出版社,2010.

[7] 翁秀花.山梨酸鉀如何防止葡萄酒二次發(fā)酵[J].飲料, 1999,6(5)：44-45.

[8] 尹卓容,王飚.葡萄酒生產(chǎn)中合理使用SO2[J].中外葡萄與葡萄酒,2000(2)：54-57.

Tolerance of Yeast Strains of Sparkling Wine

ZHOU Penghui,LI Jin,LI Zefu,JIAN Mudong and YUAN Xiaodan
（Shandong Enterprise Technology Center,Shandong Wine Engineering Research Center, COFCO Greatwall Winery(Yantai)Co.Ltd.,Penglai,Shandong 265608,China）

In order to investigate yeast stability in sparkling wine,a gradient experiment of different concentration of potassium sorbate and free sulfur dioxide was performed to determine the safe tolerance concentration of yeast under different pressure conditions. The experimental results suggested that,the concentration range of potassium sorbate and free sulfur dioxide of 0.20 MPa semi-sparkling wine were 100～150 mg/L and 30～40 mg/L respectively,and the concentration range of potassium sorbate and free sulfur dioxide of 0.40 MPa sparkling wine were 50～100 mg/L and 20～30 mg/L respectively.

sparkling wine;yeast strains;tolerance;potassium sorbate;free sulfur dioxide;pressure

TS262.6；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）06-0049-04

10.13746/j.njkj.2017022

2017-02-23

周鵬輝（1987-），男，河南周口人，助理工程師，大學(xué)本科，主要從事葡萄酒釀造相關(guān)的研究。

李澤福。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-05-04；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170504.0848.003.html。