高莉，龔小芳，余修龍，帥希元

循環(huán)miR-19a/b作為心肌缺血再灌注損傷標(biāo)志物的研究

高莉，龔小芳，余修龍，帥希元

目的：探討miR-19a/b在調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷中的作用及臨床意義。

方法：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測miR-19a/b在經(jīng)過10 h缺氧、2 h復(fù)氧后的H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析miR-19a/b的潛在靶基因。同時(shí)，以40例健康者的血清作為對照，采集40例急性心肌梗死（AMI）患者發(fā)病24 h內(nèi)的外周血標(biāo)本，分離血清后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清中miR-19a/b表達(dá)水平，并采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血心肌肌鈣蛋白I（cTnI）含量；免疫抑制法測定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的酶活力。

結(jié)果：miR-19a和miR-19b在經(jīng)過10 h缺氧、2 h復(fù)氧的H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)比在正常H9c2細(xì)胞中分別增加了5.876倍和2.761倍（P均＜0.01）。轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物和miR-19a/b抑制劑分別上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞中miR-19a/b的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-19a/b與第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白3'UTR區(qū)有靶向作用關(guān)系。轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物上調(diào)miR-19a/b的表達(dá)后，PTEN的表達(dá)降低；轉(zhuǎn)染miR-19a/b抑制劑下調(diào)miR-19a/b的表達(dá)后，PTEN的表達(dá)增加。與健康受試者比較，miR-19a/b在AMI患者血清中的表達(dá)增加（P均＜0.01）；AMI患者胸痛發(fā)作后0～3 h開始升高，6～12 h達(dá)高峰；血清CK-MB酶活力和cTnI水平在AMI發(fā)作后2～6 h開始升高，24 h左右達(dá)高峰。

結(jié)論：miR-19a/b在心肌缺血再灌注過程中高表達(dá)，PTEN是miR-19a/b的潛在靶基因；循環(huán)miR-19a/b可作為心肌缺血再灌注損傷新的無創(chuàng)性診斷標(biāo)志物。

微RNAs；再灌注損傷；生物學(xué)標(biāo)記

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:617.)

心血管疾病是影響人類最嚴(yán)重的疾病之一，其中以心肌梗死的死亡率最高。目前心肌梗死是人類第五位死因，據(jù)世界心臟聯(lián)盟預(yù)計(jì)，到2020年，心肌梗死將成為人類第一位死因[1]。心肌缺血再灌注損傷是心肌組織在較長時(shí)間缺血后恢復(fù)血液灌流，反而出現(xiàn)比再灌注前更明顯、更嚴(yán)重的損傷和功能障礙，包括收縮功能降低、冠狀動脈血流量下降及血管反應(yīng)性改變[2,3]。動物模型研究提示，致死性心肌缺血再灌注損傷體積占心肌梗死最終體積的比例可高達(dá)50%。因此，防治心肌缺血再灌注損傷可以提高急性心肌梗死（AMI）再灌注治療的臨床療效[4,5]，相關(guān)研究已成為熱點(diǎn)，但迄今還沒有可用于臨床的相應(yīng)藥物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷伴有多種微小核糖核酸（miRNA）的表達(dá)變化[6]。既往研究表明，不同疾病人群血清或血漿中miRNA的表達(dá)不同；miRNA分子與脫氧核糖核酸（DNA）和RNA一樣，廣泛存在于血清和血漿中，并且隨著生理狀況和疾病狀況的不同，miRNA在血清和血漿中的種類和數(shù)量也會發(fā)生變化。既往已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病的循環(huán)核酸中存在源自心血管系統(tǒng)的miRNA，這一現(xiàn)象提示，循環(huán) miRNA可能成為心血管疾病的無創(chuàng)診斷標(biāo)志物[7,8]。本研究通過檢測循環(huán)中miR-19a/b的表達(dá)水平，評價(jià)其作為心肌缺血再灌注損傷無創(chuàng)診斷標(biāo)志物的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

材料：經(jīng)新津縣人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書，收集40例AMI患者（平均年齡55歲）胸痛發(fā)作時(shí)24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)深靜脈血液標(biāo)本；另收集40例健康受試者的血液標(biāo)本作為對照。所有血液標(biāo)本在室溫下靜置1 h，4℃下1000 g離心20 min，移取血清置于無RNA酶的EP管中，凍存于-80℃冰箱中備用。心肌損傷生化標(biāo)志物[首選心肌肌鈣蛋白I（cTnI）]升高和（或）降低，至少有一次數(shù)值超過99%正常參考值上限，并有以下至少一項(xiàng)心肌缺血的證據(jù)可診斷為AMI[9]：（1）心肌缺血的癥狀；（2）新出現(xiàn)的ST-T改變或新出現(xiàn)的左束支傳導(dǎo)阻滯；（3）新出現(xiàn)的病理性Q波；（4）影像學(xué)有新出現(xiàn)的心肌活力喪失或區(qū)域性室壁運(yùn)動異常；（5）冠狀動脈造影或尸檢證實(shí)冠狀動脈內(nèi)有血栓。H9c2心肌細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（美國，ATCC）。

主要試劑：改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基（Gibco，美國，加利福尼亞）；胎牛血清（Gibco）；選擇性基本 （opti-MEM）培養(yǎng)基（Gibco）；脂質(zhì)體2000（Lipofectamine2000）；胰酶（0.02%乙二胺四乙酸）；TRIZOL RNA試劑盒、RT試劑盒、Taq酶、酶聯(lián)免疫反應(yīng)（PCR）試劑盒、miR-19a/b類似物和抑制劑，野生型和突變型磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）、熒光素酶報(bào)告基因均購自Invitrogen公司（美國，加利福尼亞）。

1.2 試驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)：H9c2心肌細(xì)胞于37℃、 5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

缺血再灌注損傷細(xì)胞模型建立：分別將H9c2細(xì)胞、轉(zhuǎn)染miR-19a類似物或抑制劑48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)于不含血清及葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃缺氧箱中培養(yǎng)10 h，然后將其重新培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)氧2 h。

總RNA的提取及質(zhì)量檢測：收集到的細(xì)胞及每份樣本取血清500 μl，參照TRIZOL試劑說明書的步驟，逐步提取兩組血清標(biāo)本中的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值計(jì)算其濃度，并計(jì)算A260/A280值檢測其純度，A260/A280值范圍在1.8～2.1認(rèn)為合格。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR測目的miRNA表達(dá)量：應(yīng)用U6 snRNA、miR-19a、miR-19b特異性莖環(huán)引物和miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI，美國，加利福尼亞）對血清中提取獲得的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得相應(yīng)miRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用2xSYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μl體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測樣本設(shè)置3個(gè)平行樣。用于特異擴(kuò)增miR-19a/b的引物和試劑盒購自ABI公司。以U6 snRNA作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

蛋白質(zhì)印跡法分析PTEN蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量[9]，每孔中加樣50 μg蛋白，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜膜。5%小牛血清（BSA）/TBST[800 ml蒸餾水溶解8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀和3 g三羥甲基氨基甲烷（Tris-base），加入0.015 g酚紅，用鹽酸調(diào)至PH 7.4，用蒸餾水定容到1 L，分裝后再高壓蒸汽滅菌20 min，室溫保持]室溫封閉1 h，加入鼠抗人第10號染色體缺失的PTEN單克?。?:200）孵育，4℃過夜。TBST漂洗三次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（1:5000）孵育，室溫2 h，TBST漂洗三次，底物化學(xué)發(fā)光檢測，暗室曝光10 s至10 min，顯影。

雙熒光素酶活性檢測：將熒光素酶報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞裂解，然后利用G1oMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測儀分別測定螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）和海腎熒光素酶（renilla luciferase）活性。共轉(zhuǎn)pRL-SV40質(zhì)粒作為內(nèi)對照用來校正轉(zhuǎn)染效率以Firefly luciferase與Renilla luciferase活性的比值作為熒光素酶的相對活性，進(jìn)行不同樣品間的比較。

肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性和cTnI水平檢測：采用Olympus，AU2700全自動生化分析儀及Olympus原裝試劑分析CK-MB活性。根據(jù)cTnI、肌紅蛋白、CK-MB三合一檢測試劑[膠體金法，購自艾博生物醫(yī)藥（杭州）有限公司]說明書檢測cTnI水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。cTnI水平和CK-MB酶活力的分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

健康受試者和AMI患者血清cTnI水平和CK-MB酶活力檢測結(jié)果：健康受試者血清cTnI水平和CK-MB酶活力分別為（0.21±0.06）μg/ml和（11.2±2.8）U/L，與AMI患者胸痛發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)的上述指標(biāo)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。AMI患者的血清cTnI水平和CK-MB酶活力動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示（表1），cTnI在AMI發(fā)作后2～6 h開始升高，24 h左右達(dá)高峰，升高幅度達(dá)正常數(shù)十倍以上，且在血中半衰期長，約7～10 d恢復(fù)至近正常水平；CK-MB也在AMI發(fā)作后2～6 h開始升高，24 h左右達(dá)高峰，為正常數(shù)倍至近十倍，但升高持續(xù)時(shí)間短，治療后2～3 d內(nèi)多可恢復(fù)接近正常水平。

表1 急性心肌梗死患者胸痛發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)血清cTnI水平和CK-MB酶活力檢測結(jié)果（n=40，±s）

miR-19a/b在缺血再灌注損傷的H9c2心肌細(xì)胞模型中的表達(dá)（圖1）：與正常H9c2心肌細(xì)胞比較，miR-19a和miR-19b在經(jīng)過10 h缺氧、2 h復(fù)氧的H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)分別增加了5.876倍和2.761倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-19a（1A）和miR-19b（1B） 在正常H9c2心肌細(xì)胞及缺血再灌注損傷H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)比較（n=3）

轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物或抑制劑對缺血再灌注損傷H9c2心肌細(xì)胞中miR-19a/b表達(dá)的影響（圖2）：與在正常H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)比較，miR-19a/b在轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物48 h的缺血再灌注H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加（miR-19a：0.998±0.005 vs 8.780±0.55；miR-19b：0.976±0.007 vs 7.530±0.95），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，圖2A和圖2B）；與在正常H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)比較，miR-19a/b在轉(zhuǎn)染miR-19a/b抑制劑48 h的缺血再灌注H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)下降（miR-19a：0.992±0.019 vs 0.250±0.007；miR-19b：0.987±0.009 vs 0.370±0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，圖2C和圖2D）。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物（2A/2B）或抑制劑（2C/2D）對缺血再灌注損傷H9c2心肌細(xì)胞中miR-19a/b表達(dá)的影響（n=3）

轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物或抑制劑對缺血再灌注損傷H9c2心肌細(xì)胞中PTEN表達(dá)的影響：通過基因信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-19a/b與PTEN之間有靶向作用關(guān)系。熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定，miR-19a/b與PTEN蛋白3' UTR區(qū)有靶向作用關(guān)系。轉(zhuǎn)染miR-19a/b類似物上調(diào)缺血再灌注損傷的H9c2心肌細(xì)胞中miR-19a/b的表達(dá)后，與在正常H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)比較，PTEN在信使RNA（mRNA）水平和蛋白水平上的表達(dá)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-19a/b 抑制劑下調(diào)缺血再灌注損傷的H9c2心肌細(xì)胞中miR-19a/b的表達(dá)后，與在正常H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)比較，PTEN在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)均明顯增加（P均＜0.05）。

miR-19a/b在AMI患者和健康受試者血清中的表達(dá)（圖3）：與健康受試者相比，AMI患者胸痛發(fā)作后24 h內(nèi)血清中miR-19a/b的表達(dá)均明顯增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測急性心肌梗死患者胸痛發(fā)作24 h內(nèi)和健康受試者血清中miR-19a（3A）和miR-19b（3B）的表達(dá)（n=40）

miR-19a/b在AMI患者胸痛發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)血清中的表達(dá)（圖4）：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-19a/b在AMI患者胸痛發(fā)作后0～3 h開始升高，在6～12 h達(dá)高峰，12 h后開始降低，72 h后基本降至正常。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR急性心肌梗死患者胸痛發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)血清中miR-19a（4A）和miR-19b（4B）的表達(dá)（n=40）

3 討論

世界衛(wèi)生組織制定的心肌梗死診斷依據(jù)要求有下列三項(xiàng)條件中至少兩項(xiàng)：缺血性胸部不適病史、心電圖的動態(tài)演變和血清標(biāo)志物水平升降[10]。因此，心肌梗死患者血清標(biāo)志物的檢測對于明確診斷和指導(dǎo)治療具有十分重要的意義[11]。眾所周知，心肌梗死不僅導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、凋亡，還累及血管床和心肌外膠原組織，復(fù)雜的病理生理、病理解剖導(dǎo)致心室重構(gòu)，引起心功能不全。PTEN是新發(fā)現(xiàn)的一種人類抑癌基因，與細(xì)胞的生長、分化、凋亡、信號傳遞等密切相關(guān)。既往對PTEN的研究大多側(cè)重于腫瘤方面，近些年來有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN/絲氨酸-蘇氨酸激酶（Akt）信號通路在心肌重構(gòu)、心肌肥厚、心肌缺血再灌注損傷等方面亦發(fā)揮著重要的作用，但其機(jī)制尚未完全闡明。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的小分子調(diào)節(jié)RNA，由約22個(gè)內(nèi)源性非編碼的核苷酸組成，可以和與之互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，對mRNA的穩(wěn)定及翻譯效率起到重要的調(diào)控作用，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)效果。miRNA不僅參與調(diào)控機(jī)體的多種生理過程，如細(xì)胞的新陳代謝、增殖分化、生長凋亡等，而且在眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)控作用[12]。2008年Mitchell等[13]發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于癌癥標(biāo)志物的研究提示，血漿中miRNA能以穩(wěn)定的形式存在，避免內(nèi)源性RNA酶的降解。正是由于這些非細(xì)胞性miRNA在循環(huán)中的穩(wěn)定性，我們可以十分簡便地獲得外周靜脈血并提取血清或血漿來代替心肌組織，從而研究心肌缺血再灌注損傷時(shí)特異性表達(dá)的miRNA。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-7a/b能夠靶向作用于二磷酸腺苷-核糖聚合酶防止缺血/再灌注心肌細(xì)胞損傷[14]；三碘甲腺原氨酸通過調(diào)節(jié)p53 miR-30a/軸可以防止心臟缺血/再灌注細(xì)胞線粒體的損傷[15]；miR-50通過下調(diào)c-myb基因的表達(dá)，增加過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[16]；miR-1加速小鼠心肌缺血再灌注損傷[17]；miR-145通過靶向作用于線粒體凋亡通路，減少過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]；miR-214通過控制鈣離子超載和細(xì)胞死亡保護(hù)小鼠心臟缺血再灌注損傷[19]；miR-494通過靶向促凋亡和抗凋亡蛋白減少缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷[20]；miR-19a/b通過靶向作用于肌萎縮素-1和肌環(huán)指蛋白-1調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大[21]。然而，國內(nèi)外尚未見miR-19a/b對心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a/b在經(jīng)10 h缺氧、2 h復(fù)氧的H9c2心肌細(xì)胞中高表達(dá)，PTEN是miR-19a/b的潛在靶基因；與健康受試者比較，miR-19a/b在AMI患者血清中的表達(dá)增加；AMI患者血清CK-MB活性和cTnI水平在胸痛發(fā)作后2～6 h開始升高，24 h左右達(dá)高峰，而miR-19a/b表達(dá)在胸痛發(fā)作后0～3 h開始升高，6～12 h達(dá)高峰。以上研究結(jié)果提示，miR-19a/b在心肌缺血再灌注過程中的升高早于目前常用的心肌損傷標(biāo)志物CK-MB和cTnI，循環(huán)miR-19a/b可能作為心肌缺血再灌注損傷新的無創(chuàng)性早期診斷標(biāo)志物。

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Investigation of Circulating miR-19a/b as the Biological Marker for Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

GAO Li, GONG Xiao-fang, YU Xiu-long, SHUAI Xi-yuan.
Department of Cardiology, Xinjin County Hospital, Chengdu (611430), Sichuan, China

SHUAI Xi-yuan, Email: xiyuansh@163.com

Objective: To investigate the role of miR-19a/b in myocardial ischemia reperfusion injury (R/I) with its clinical significance.

Methods: Our research included in 2 parts. Part 1: in H9c2 cells. miR-19a/b expression in H9c2 cells with 10 h hypoxia and 2 h re-oxygenation was detected by real-time PCR, miR-19a/b potential target gene was assessed by luciferase reporter activity assay. Part 2: in natural person. Control group, n=40 healthy subjects and AMI (acute myocardial infarction) group, n=40 relevant patients. Peripheral blood levels of miR-19a/b were detected as Part 1, cTnI were measured by chemiluminescence immune analysis and CK-MB were assessed by immune inhibition method.

Results: Part 1: Compared with normal H9c2 cells, miR-19a/b expressions were increased 5.876 times and 2.761 times in H9c2 cells with 10 h hypoxia and 2 h re-oxygenation, both P＜0.01. With respectively transfected miR-19a/b mimic and inhibitor, miR-19a/b expression was up-regulated and down-regulated respectively. miR-19a/b and chromosome-10 deleted phosphatase, tensing homolog gene (PTEN) had the targeting effect. With up-regulated miR-19a/b expression, PTEN level was decreased and with down-regulated miR-19a/b expression, PTEN level was increased. Part 2: Compared with Control group, AMI group had elevated blood level of miR-19a/b, P＜0.01. In AMI patients, miR-19a/b was increasing at 0-3 h ofchest pain and reaching the peak at 6-12 h; CK-MB enzyme activity and cTnI content were elevating at 2-6 h of onset and reaching the peak at 24 h.

Conclusion: miR-19a/b expression was up-regulated by myocardial ischemia reperfusion in H9c2 cells, PTEN was the potential target gene of miR-19a/b. Circulating miR-19a/b might be used as a new non-invasive biological marker for myocardial ischemia R/I diagnosis.

MicroRNAs; Reperfusion injury; Biological markers

2016-07-08）

（編輯：朱柳媛）

611430 四川省成都市，新津縣人民醫(yī)院 心內(nèi)科（高莉、龔小芳、余修龍）；武警綜合保障基地成都倉庫衛(wèi)生所（帥希元）

高莉 主治醫(yī)師 學(xué)士 研究方向：心血管疾病 Email：Gaolimed@163.com 通訊作者：帥希元 Email：xiyuansh@163.com

R54

A

1000-3614（2017）06-0617-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.020