楊玉琴 曹青云 李 琦 肖順麗 王 敏 關(guān)亮俊 高榮凱 張宏桂

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2014級(jí)碩士研究生，北京 100102)

制劑與質(zhì)量控制

正交試驗(yàn)法優(yōu)選番瀉葉醇提工藝※

楊玉琴 曹青云1李 琦1肖順麗1王 敏1關(guān)亮俊2高榮凱2張宏桂△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2014級(jí)碩士研究生，北京 100102)

目的 優(yōu)選番瀉葉中番瀉苷A和番瀉苷B的醇提工藝。方法 利用高效液相色譜法同時(shí)測定不同提取工藝后番瀉葉中番瀉苷A和番瀉苷B的含量，并以番瀉苷A和番瀉苷B的含量為指標(biāo)，在乙醇濃度、提取時(shí)間單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳的醇提工藝。結(jié)果 優(yōu)選出的最佳提取工藝為：醇濃度70%，液料比1∶15，提取時(shí)間15 min，提取次數(shù)2次。結(jié)論 優(yōu)選出的最佳提取工藝提取率高、穩(wěn)定性好，可為番瀉葉的工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供指導(dǎo)。

番瀉葉(中藥)；番瀉葉提取物；正交試驗(yàn)

番瀉葉為豆科植物狹葉番瀉(CassiaangustifoliaVahl)或尖葉番瀉(CassiaacutifoliaLelile)的干燥小葉，其性寒，味甘、苦，歸大腸經(jīng)，具有瀉熱導(dǎo)滯、利水通便等功效，用于治療熱結(jié)積滯、便秘腹痛、水腫脹滿等病癥[1]，現(xiàn)代臨床廣泛應(yīng)用于治療便秘[2-3]、腹部術(shù)后恢復(fù)[4]、腹部X線攝片和手術(shù)前清潔腸道[5]。現(xiàn)代藥理研究顯示，番瀉葉主要含有蒽醌、黃酮、揮發(fā)油、多糖等化學(xué)成分[6]，其中蒽醌類成分番瀉苷A、B是治療便秘的主要有效成分。為優(yōu)化番瀉苷A、B的提取工藝，便于工業(yè)化生產(chǎn)，本研究采用不同濃度的乙醇作為提取溶劑，以番瀉苷A、B為指標(biāo)進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)番瀉葉的醇提工藝進(jìn)行研究。

1 試藥和儀器

1.1 試藥 番瀉葉飲片購自河北安國藥材市場，批號(hào)20160407，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。番瀉苷A、B對(duì)照品(98%)，購自寶雞市辰光生物科技有限公司。1.2 儀器 Waters 1525型高效液相色譜儀，Breeze2色譜工作站，Waters 2489型紫外可見檢測器，色譜柱Sunfire TM C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Waters公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；舒美KQ-300VDB超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 番瀉苷A、B含量測定2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸(79∶21)為流動(dòng)相；檢測波長為271 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按番瀉苷A峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000，理論板數(shù)按番瀉苷B峰計(jì)算應(yīng)不低于6 500。2.1.2 溶液制備 番瀉苷A對(duì)照品溶液制備：精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的番瀉苷A對(duì)照品0.003 3 g于25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解定容刻度，配制成0.132 mg/mL的番瀉苷A對(duì)照品溶液。 番瀉苷B對(duì)照品溶液制備：精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的番瀉苷B對(duì)照品0.004 0 g于20 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解定容刻度，配制成0.2 mg/mL的番瀉苷B對(duì)照品溶液。 番瀉苷A、B混標(biāo)對(duì)照品溶液制備：精密吸取番瀉苷A、B對(duì)照品溶液各200 μL，制成番瀉苷A、B混標(biāo)溶液。2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取番瀉苷A、B混標(biāo)對(duì)照品溶液0.625、1.875、3.125、4.375、5.000 mL于5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，配制成番瀉苷A濃度分別為0.016 5、0.049 5、0.082 5、0.115 5、0.132 0 μg/μL，番瀉苷B濃度分別為0.025、0.075、0.125、0.175、0.200 μg/μL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，分別吸取10 μL進(jìn)入高效液相色譜儀，在271 nm波長下檢測，記錄番瀉苷A、B的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，番瀉苷A對(duì)照品溶液濃度(μg/μL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得番瀉苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=1×107X+4 529.7(R=0.999 7，n=5)，式中Y為吸光度，X為濃度(μg/μL)，結(jié)果表明：番瀉苷A在0.016 5～0.1320 μg/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(見表1，圖1)。以峰面積為縱坐標(biāo)，番瀉苷B對(duì)照品溶液濃度(μg /μL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得番瀉苷B標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=2×107X+34 383(R=0.999 9，n=5)，結(jié)果表明：番瀉苷B在0.025～0.200 μg/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(見表2，圖2)。

表1 番瀉苷A線性關(guān)系考察結(jié)果 (n=5)

圖1 番瀉苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

(n=5)

2.1.4 供試品溶液制備 取番瀉葉提取物干膏，研細(xì)，精密稱取0.25 g試樣，置具塞錐形瓶中，精密加入0.1%碳酸氫鈉溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min(30～40 ℃)，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.1%碳酸氫鈉溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖2 番瀉苷B標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度的選擇 綜合文獻(xiàn)參考，在確定提取時(shí)間為15 min，提取次數(shù)為1次的情況下，取6份番瀉葉飲片各10 g，分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇各200 mL，根據(jù)其番瀉苷A和番瀉苷B的含量選擇合適的乙醇濃度。見表3，圖3。

表3 乙醇濃度對(duì)番瀉苷A、B提取的影響

圖3 乙醇濃度對(duì)番瀉苷A、B提取的影響

由表3、圖3可見，隨著乙醇濃度的不斷增加，番瀉苷的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)也逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度增加到70%以后，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)達(dá)到最大，所以正交試驗(yàn)選擇60%、70%、80%3個(gè)乙醇濃度。

2.2.2 提取時(shí)間的選擇 綜合文獻(xiàn)參考，在確定提取乙醇濃度為70%，提取次數(shù)為1次的情況下，取6份番瀉葉飲片各10 g，分別提取5、10、15、20、25、30 min，根據(jù)番瀉苷A和番瀉苷B的含量選擇合適的提取時(shí)間，結(jié)果見表4、圖4。

表4 提取時(shí)間對(duì)番瀉苷A、B提取的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)番瀉苷A、B提取的影響

由表4、圖4可見，隨著提取時(shí)間的不斷增加，番瀉苷的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)先增加后降低。當(dāng)提取時(shí)間到10 min時(shí)，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)達(dá)到最大，所以正交試驗(yàn)選擇5、10、15 min 3個(gè)時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在確定了提取乙醇濃度

(A)、提取時(shí)間(C)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響提取的其它主要因素乙醇倍量(B)、提取次數(shù)(D)進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)選，每次試驗(yàn)稱取干燥的番瀉葉飲片10 g，通過L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見表5。

表5 L9(34)番瀉苷A、B提取試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)表

按照L9(34)正交表及以上測量方法，測得每組試驗(yàn)中番瀉苷A、B的含量，評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大量為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重。番瀉苷A、B的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.5。以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表6，方差分析見表7。其中綜合評(píng)分Y=0.5×X×100/2.02+0.5×Y×100/2.35。

表6 番瀉苷A、B正交試驗(yàn)及結(jié)果

表7 番瀉苷A、B正交試驗(yàn)方差分析

從正交試驗(yàn)結(jié)果表及方差分析表可以看出：各因素作用的主次順序依次為乙醇濃度、溶劑倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)，即A>B>C>D。方差分析表顯示A、B、C因素差異顯著(P<0.05)，D因素差異不顯著(P>0.05)。由直觀分析，A因素中A2>A1>A3，故選擇A2；B因素中B1>B2>B3，故選B1；C因素中C3>C1>C2，故選C3；D因素中，三水平間差異不明顯，在A2、B1、C3條件下，將番瀉葉提取2次與3次進(jìn)行比較，番瀉苷A和番瀉苷B的含量沒有升高，為了節(jié)約時(shí)間和成本，綜合考慮提取次數(shù)定為2次，即D2。由此可推出，正交試驗(yàn)所得的最佳工藝條件為A2B1C3D2，即乙醇濃度為70%，液料比為1∶15，提取時(shí)間為15 min，提取次數(shù)為2次。

2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照以上結(jié)果分析的最佳工藝，分別各取3批番瀉葉飲片進(jìn)行試驗(yàn)，比較和驗(yàn)證最佳提取工藝的可靠性，結(jié)果見表8。

表8 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表8可見，在最佳提取工藝條件下所得的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)與正交試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)，因此可以說明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定，合理，可行。

3 討 論

近年來，隨著中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化、藥材資源產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，中藥的應(yīng)用范圍越來越廣泛。番瀉葉因具有瀉熱行滯、通便利水的功效，現(xiàn)代臨床多用于術(shù)前清潔腸道、治療便秘等。因番瀉葉瀉下的主要成分為番瀉苷A、B，故本試驗(yàn)以番瀉苷A、B來計(jì)有效成分的含量，優(yōu)選出最佳的番瀉苷A、B的提取工藝。傳統(tǒng)對(duì)番瀉苷類化合物的提取多采用沸水煎煮、沸水浸泡、醇回流及超聲等。如王文莉等[7]采用超聲波水提取番瀉葉中番瀉總苷，優(yōu)化工藝為提取溫度95 ℃，提取時(shí)間15 min，超聲波頻率40 kHz,該法提取總番瀉苷為其含量的99.1%。曹蔚等[8]用10倍50%乙醇為溶劑，室溫浸提24 h，每次提取2次，驗(yàn)證番瀉苷A提取率為91.2% (n=4)。本試驗(yàn)以番瀉苷A、B含量為指標(biāo)，在乙醇濃度、提取時(shí)間單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，最終確定了最佳提取工藝為：70%的乙醇，1∶15的液料比，提取時(shí)間為15 min，提取次數(shù)為2次。本試驗(yàn)得出的最佳提取工藝可靠穩(wěn)定，可為番瀉苷的相關(guān)研究和實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

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(本文編輯：曹志娟)

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.05.033

※ 項(xiàng)目來源：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30870262)

楊玉琴(1989—)，女，碩士研究生在讀。研究方向：中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R284.2

A

1002-2619(2017)05-0770-04

2017-03-14)

△ 通訊作者：北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2015級(jí)碩士研究生，北京 100102

2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2016級(jí)碩士研究生，北京 100102