楊小風，郭婷婷，歸 婧，王雅莉

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 ，鄭州 450007)

臨床醫(yī)學

高通量測序技術(shù)對自然流產(chǎn)的遺傳學價值*

楊小風，郭婷婷，歸 婧，王雅莉△

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 ，鄭州 450007)

目的 觀察高通量測序技術(shù)檢測自然流產(chǎn)組織及遺傳因素對自然流產(chǎn)的影響。方法 選擇91例自然流產(chǎn)患者，孕6～29周。取流產(chǎn)組織(絨毛或胚胎組織)，提取組織DNA，采用高通量測序技術(shù)對樣本基因組信息進行分析解讀，并與傳統(tǒng)的染色體核型分析進行對照，統(tǒng)計染色體異常的類型及所占比率。結(jié)果 91例自然流產(chǎn)患者絨毛或胚胎組織處理后經(jīng)高通量基因測序異常33例，染色體數(shù)目異常24例，100 Kb以上片段缺失/重復(fù) 9例，其中6例為多態(tài)覆蓋區(qū)域；傳統(tǒng)染色體核型成功分析89例，高通量基因測序結(jié)果與其中82例結(jié)果一致，符合率為92.00%(82/89)。結(jié)論 與染色體核型分析技術(shù)相比，高通量測序技術(shù)對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者流產(chǎn)組織的遺傳學檢查具有更高的敏感性、高效性、特異性，具有臨床實際應(yīng)用價值。

自然流產(chǎn)；絨毛；高通量測序；染色體異常

隨著社會壓力、環(huán)境、物理化學、精神心理等因素的影響，自然流產(chǎn)的發(fā)病率日益增加,懷孕早期自然流產(chǎn)高達25%[1],導(dǎo)致自然流產(chǎn)的因素有遺傳、內(nèi)分泌、免疫及母親宮腔的解剖結(jié)構(gòu)、環(huán)境等，其中近60%是由染色體異常引起[2]。傳統(tǒng)的細胞學培養(yǎng)檢查雖是金標準，但對樣本要求較高，且存在耗時、檢出率低下的局限[3]。高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學分析技術(shù)可在24 h內(nèi)獲得23對染色體的大量堿基信息，可發(fā)現(xiàn)100 Kb以上染色體微缺失、微重復(fù)和非整倍體改變等染色體異常，與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)相比具有更高的檢測成功率、高效性，對染色體結(jié)構(gòu)異常具有更高的敏感性，加快了早期流產(chǎn)遺傳因素的確定，使得早期流產(chǎn)的病因?qū)W診斷更加全面和深入[4]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月—2015年9月在鄭州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的自然流產(chǎn)患者91例，年齡21～40( 27.65±5.00)歲，孕齡6～29 周，并有1次或以上的孕產(chǎn)史，在知情同意的原則下無菌獲取絨毛組織，進行高通量測序分析，同時進行絨毛組織細胞培養(yǎng)染色體核型分析。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取 取新鮮冷凍過的流產(chǎn)組織，選取絨毛組織10 mg，按照 《血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒》操作說明提取基因組DNA，用分光光度計(Nanodrop，美國)檢測DNA濃度及純度，質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.2.2 基因文庫的構(gòu)建及DNA測序 將提取的基因組DNA在超聲打斷儀上打斷成小片段核酸，采用酶反應(yīng)對打斷后的基因組DNA片段進行末端修復(fù)，將DNA片段3’端堿基“A”與5’端堿基“T”接頭對接。通過PCR擴增進行富集。用磁珠純化的方法對PCR擴增后的DNA文庫純化，去除反應(yīng)體系中引物二聚體等干擾，得到DNA小片段文庫。應(yīng)用Hise2000測序平臺，將通過質(zhì)控的DNA文庫按照染色體異常分析所需的數(shù)據(jù)量進行上機，在Illumina Genome Analyzer上測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 高通量測序結(jié)果通過對比軟件將每個測序Reads匹配到其所在的染色體上。隨后做相應(yīng)標準化Z值分析，通過Z值進行染色體異常判定。

1.2.4 絨毛染色體核型確診方法 取適量無菌絨毛標本用生理鹽水洗3遍，剪碎，分2瓶接種于5 ml Ammiomax完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d，常規(guī)消化法收集細胞、制片、吉姆薩染色，鏡下計30個分裂象，分析3～5個核型，異常計數(shù)加倍。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以頻數(shù)、構(gòu)成比成率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量基因測序結(jié)果和組織細胞染色體核型分析結(jié)果比較 91例患者中33例患者高通量基因測序結(jié)果異常。高通量基因測序檢測成功率100%(91/91)，而傳統(tǒng)的組織細胞培養(yǎng)成功率為97.8%(89/91)，樣本污染檢測失敗2例,后經(jīng)高通量測序檢測1例正常，另1例為常染色體第11號染色體長臂缺失。兩種方法均檢測成功的89例中，82例結(jié)果完全一致，符合率92%(82/89)。高通量基因測序染色體異常核型檢出率100%(33/33)，而染色體核型分析異常檢測率為78.8%(26/33)。雖然高通量基因染色體異常檢測率高于傳統(tǒng)染色體分析，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1-2。

2.2 絨毛或胚胎染色體非整倍體的發(fā)生與孕婦年齡的關(guān)系 91例樣本按年齡分成2個亞組(①組≤34歲。②組：35～40歲)，比較各組間染色體異常發(fā)生率。結(jié)果顯示②組染色體異常發(fā)生率高于①組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.21,P<0.01)，且②組中三體型和性染色體單體型高于①組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.37,P<0.01)。提示隨著孕婦年齡增加，染色體異常比率增加。見表3。

表1 33例高通量基因測序結(jié)果異常樣本

表2 高通量測序方法和傳統(tǒng)染色體核型分析方法的結(jié)果比較[n(%)]

表3 不同年齡段異常核型構(gòu)成情況

3 討論

胚胎的染色體異常是導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育而發(fā)生流產(chǎn)的重要原因，有研究[5]指出因染色體數(shù)目異常引發(fā)的自然流產(chǎn)達23%～61%[5]。目前臨床應(yīng)用較廣的傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)對組織樣本要求高，培養(yǎng)周期長且存在培養(yǎng)失敗風險。因此，找出一種快速、準確地檢測自發(fā)流產(chǎn)組織染色體異常的方法，從而合理指導(dǎo)臨床妊娠有重要作用。

第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology)為代表的高通量測序技術(shù)最大特點是測序高度平行化，即成千上萬個測序反應(yīng)可在一個平臺同時進行。結(jié)合生物信息學分析，一次性覆蓋23對染色體，減少了傳統(tǒng)染色體核型分析中細胞培養(yǎng)過程，可以發(fā)現(xiàn)100 kb以上染色體的缺失和重復(fù)。對樣本要求低，可對污染、凍存標本進行檢測，取材方便，檢測周期短，對微小片段的缺失、重復(fù)檢出率高，彌補了傳統(tǒng)染色體核型分析、FISH技術(shù)、CGH的不足[6～8]。

該研究運用高通量測序技術(shù)對91例自發(fā)流產(chǎn)者的絨毛或胚胎組織進行快速檢測，篩查染色體，檢測成功率100%，檢出率為36.3%(33/91)，傳統(tǒng)染色體核型檢測成功率97.8%，均明顯高于文獻報道的傳統(tǒng)染色體核型的異常檢出率66.0%[9]。

隨著孕婦年齡增大，孕婦卵巢功能老化，雌激素、黃體酮水平降低，導(dǎo)致卵泡紡錘體老化，卵細胞在減數(shù)分裂過程錯誤分離率增高，染色體三體發(fā)生率隨之增高。在該次高通量測序檢出的33例樣本中，數(shù)目異常占72.7%(24/33)，最常見的染色體異常類型是三體型，主要包括16-三體、21-三體、13-三體等，此外還有部分結(jié)構(gòu)異常和單體型。這些發(fā)現(xiàn)與Yakut[10]研究結(jié)果相符。孕婦孕中和新生兒檢測中最常見三體是21-三體，21-三體占染色體異常的比例隨孕婦年齡的增大而增高[11]。而16-三體是自發(fā)流產(chǎn)中最常見的三體類型[12]，因此又稱16號染色體為“流產(chǎn)性染色體”。常染色體三體中，最常見的還有8、9、10、13、15、22號等染色體，性染色體三體在自發(fā)流產(chǎn)中較常見。此外高齡孕婦中異常染色體尤為多見，孕雙或多三體孕婦的平均年齡是35.6歲。該研究發(fā)現(xiàn)，35歲以上孕婦自然流產(chǎn)中染色體異常率為80%(16/20)，明顯高于35歲以下孕婦。因此，35歲以上孕婦在做產(chǎn)前評估時相比較35歲以下孕婦應(yīng)更詳盡。國外研究[13]發(fā)現(xiàn)的第一例雙三體是唐氏-克氏雙三體綜合征，之后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了385例雙三體[13]。雙三體在自發(fā)流產(chǎn)中的檢出率為1.2%,不同機構(gòu)雙三體的檢出率在0.80%～2.64%[14]間。該研究中雙三體的檢出率為1.1%(1/91)，與文獻報道相符。

在流產(chǎn)組織樣本檢測過程中，發(fā)現(xiàn)染色體異常對自發(fā)流產(chǎn)原因的分析有重要價值。高通量測序技術(shù)在較短的時間內(nèi)給予病因?qū)W診斷，對檢測出自發(fā)流產(chǎn)組織及其父母攜帶有染色體結(jié)構(gòu)異常的家庭，給予其適當?shù)倪z傳咨詢，預(yù)測再次妊娠流產(chǎn)風險，同時給予科學的孕育指導(dǎo)，對于早期流產(chǎn)的預(yù)防和治療有重要作用。

[1] Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion[J]. Fertil Steril, 2012,98(5):1103-1111.

[2] Farr SL, Schieve LA, Jamieson DJ. Pregnancy loss among pregnancies conceived through assisted reproductive technology, United States, 1999-2002[J]. Am J Epidemiol, 2007,165(12):1380-1388.

[3] Lomax B, Tang S, Separovic E, et al. Comparative genomic hybridization in combination with flow cytometry improves results of cytogenetic analysis of spontaneous abortions[J]. Am J Hum Genet, 2000, 66(5):1516-1521.

[4] Koboldt DC, Steinberg KM, Larson DE, et al. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics[J]. Cell, 2013,155(1): 27-38.

[5] Carvalho B, Dória S, Ramalho C, et al. Aneuploidies detection in miscarriages and fetal deaths using multiplex ligation-dependent probe amplification: An alternative for speeding up results[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2010,153(2):151-155.

[6] Jiang F, Ren J, Chen F, et al. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies[J]. BMC Med Genomics.BioMed Central Ltd, 2012,5(1):57.

[7] Benn P, Cuckle H, Pergament E, et al Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J]. Obstet Gynecol, 2012,119(6):1270-1271.

[8] Zhao M, Wang Q. Computational tools for copy number variation (CNV) detection using next-generation sequencing data: features and perspectives[J]. BMC Bioinformatics, 2013,14(11):S1.

[9] Chang L, Zhong S, Zhao N, et al. Comparative Study of Fluorescence in situ Hybridization Analysis and Karyotype Analysis in Spontaneous Abortion Etiology Diagnosis[J]. Reproduction and Contraception, 2013,24(3):133-142.

[10] Yakut S,Toru HS,cetin Z, et al. Chromosome abnormalities identified in 457 spontaneous abortions and their histopathological findings[J]. Turk Patoloji Derg, 2015,31(2): 111-118.

[11] Kumar V, Abbas AB, Fausto N, et al. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, Professional Edition: Expert Consult-Online[J/OL]. Saunders, 2009,New York, USA .

[12] Benirschke K, Burton GJ, Baergen RN. Pathology of the human Placenta[J]. Mayo Clinic Proceedings,2000,66(5):674-675.

[13] Micale M, Insko J, Ebrahim SA, et al. Double trisomy revisited-a multicenter experience[J]. Prenat Diagn, 2010,30(2):173-176.

[14] Huijsdens-van AK, Barge-Schaapveld DQ,Mathijssen IB,et al. Prenatal diagnosis of a trisomy 7/trisomy 13 mosaicism[J]. Mol Cytogenet, 2012, 5(1):8.

[責任編輯：張亞光]

Genetical Value of Spontaneous Abortion by High-through Sequencing Technology

YANG Xiao-feng, GUO Ting-ting, GUI Jing, WANG Ya-li

(ZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouHenan,450007,China)

Objective To perform high throughput sequencing diagnosis of chromosome by detecting natural abortion villus, explore the effects of genetic factors on abortion and provide clinical guidance for next pregnancy.Methods 91 patients with spontaneous abortion, gestational age among 6-29 weeks were chosen, follow the principle of informed consent, take abortion group (villi and fetal tissues), extract DNA, using high-through sequencing technologies to analyze samples of genome information interpretation. And the authors carried on the contrast analysis with traditional karyotype analysis, statistical type and proportion of chromosomal abnormalities. Results In 33 cases out of 91 spontaneous abortion or embryonic tissue villus, high-through sequencing technology revealed abnormalities, 24 cases of abnormal number of chromosomes, 100Kb above fragment deletion / duplication nine cases, including six cases of multi-state coverage area; the successful analysis of the traditional karyotype 89 cases, high-through gene sequencing results were consistent with the results of 82 cases in which, in line with the rate of 92% (82/89).Conclusion With the traditional “gold standard”-karyotype analysis technology, compared to the high-through sequencing technology has higher sensitivity, efficiency, specificity and has clinical application value.

spontaneous abortion; villus; high-through sequencing; chromosome abnormality

2016-12-05

自然流產(chǎn)組織染色體檢測的臨床研究(20140451)。

楊小風(1976-)，女，河南省孟津縣人，碩士，副主任醫(yī)師，從事婦產(chǎn)科臨床工作。

△通信作者：王雅莉，E-mail: zxyyfuchanke@163.com。

R 719.3

A

1008-9276(2017)02-0110-04