蔣永紅，張曉峰，韓 萍，劉利娥，常正姣，王文寧

（鄭州大學 公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001）

雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草酸的優(yōu)化提取及含量測定

蔣永紅，張曉峰，韓 萍*，劉利娥，常正姣，王文寧

（鄭州大學 公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001）

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應面分析法優(yōu)化雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草酸的水浴提取工藝條件，并使用酶標儀-分光光度法測定蟲草酸含量。結(jié)果表明：最佳提取條件為液料比28∶1，浸提時間3 h,浸提溫度35℃，蟲草酸的含量為28.178 5 mg/g，RSD為0.81%。本研究表明該工藝條件可靠，測定方法可行。

雜糧蛹蟲草菌絲共生體；蟲草酸；響應面法；酶標儀-分光光度法

0 前言

蟲草酸，又名D-甘露醇，是冬蟲夏草和蛹蟲草的一種主要活性成分，現(xiàn)已作為人工發(fā)酵蟲草的質(zhì)控指標之一?，F(xiàn)代藥理臨床研究證明，蟲草酸具有脫水、利尿、鎮(zhèn)咳等作用。雜糧蛹蟲草菌絲共生體是將雜糧經(jīng)蛹蟲草真菌生態(tài)轉(zhuǎn)化進行成分重組的產(chǎn)物[1]，即以麥仁、糙米、大豆、奶粉為固體雜糧培養(yǎng)基，通過蛹蟲草真菌生態(tài)轉(zhuǎn)化得到的雜糧培養(yǎng)基和菌絲體共存的結(jié)構(gòu)整體。本課題組現(xiàn)已完成雜糧蛹蟲草菌絲共生體培養(yǎng)條件的工藝優(yōu)化和部分成分的測定工作[2]，為檢測菌絲共生體中蟲草酸的含量，本試驗優(yōu)化了菌絲共生體中蟲草酸的提取工藝，并采用簡便、可行的酶標儀-分光光度法測定了菌絲共生體中蟲草酸的含量，以期為雜糧蛹蟲草菌絲共生體的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

探究提取菌絲共生體中蟲草酸最優(yōu)工藝條件是檢測其蟲草酸含量的前提。文獻資料表明[3-4]，液料比、浸提時間、浸提溫度對蟲草酸提取量有較大影響，故本研究以這3個因素為優(yōu)化條件，采用響應曲面分析法[5]，設(shè)計了Box-Behnken試驗。目前用于蟲草酸含量測定的方法有多種，如高效液相色譜法[6]、旋光法[7]、分光光度法[8]等，Xiao等[9]在2009年首次報告使用酶標儀-分光光度法測定藥用蟲草中的蟲草酸含量，該方法具有高效、成本低、適合大批量測定等優(yōu)點。此后文獻中少見對該方法的重復驗證。本研究使用酶標儀-分光光度法測定了菌絲共生體中蟲草酸的含量，同時對其進行了嚴格的方法學考察。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜糧蛹蟲草菌絲共生體樣品真空干燥至恒質(zhì)量，使用高速萬能粉碎機粉碎，過篩備用。

蟲草酸標準品：上海源葉生物科技有限公司；L-鼠李糖：上海金穗生物科技有限公司；高碘酸鉀、無水乙醇、醋酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

30%乙醇溶液、0.1%L-鼠李糖溶液、0.015 mol/L高碘酸鉀溶液和Nash試劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-42數(shù)顯恒溫磁力攪拌循環(huán)水箱、T6新世紀紫外可見分光光度計、101-2BS電熱鼓風干燥箱：常州國華電器有限公司；L420臺式低速離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；BioTeK熒光酶標儀：基因工程公司；85-1恒溫磁力攪拌器；BCD-215KALM冰箱：青島海爾股份責任有限公司；JT502N電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制作

將質(zhì)量濃度為100 mg/L的蟲草酸標準溶液于350～500 nm范圍內(nèi)進行掃描，確定甘露醇的最大吸收波長。

取 1、2、3、4、5、6 mL蟲草酸標準溶液于 10 mL容量瓶中，定容至刻度線，搖勻，得到質(zhì)量濃度依次為10、20、30、40、50、60 mg/L的蟲草酸溶液。分別加入1.00 mL 0.015 mol/L的高碘酸鉀溶液，混勻，室溫靜置10 min，然后加入2.00 mL 0.1% L-鼠李糖溶液和4 mL Nash試劑，53℃恒溫水浴15 min，室溫冷卻，用蒸餾水作空白對照，使用最大吸收波長測定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制甘露醇標準曲線。

1.3.2 樣品中蟲草酸含量的測定

樣品溶液制備：準確稱取樣品0.1 g，加入適量30%乙醇溶液水浴提取，浸提2次，在4 000 r/min的條件下離心15 min，合并兩次的上清液，置于4℃冰箱中備用。

取樣品液1.00 mL于潔凈試管中，處理過程同標準曲線的制作過程，使用最大吸收波長測定吸光度。根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品蟲草酸含量。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗

考察液料比、浸提時間和浸提溫度對雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草酸提取量的影響。液料比選擇5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1 5個水平，浸提時間選擇1、1.5、2、2.5、3 h 5個水平，浸提溫度選擇20、30、40、50、60℃ 5個水平，分別進行單因素試驗。

1.4.2 響應面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以蟲草酸的提取量為指標，設(shè)計液料比（A）、浸提時間（B）和浸提溫度（C）3個因素 3個水平中心組合試驗，運用 Design-Expert 8.0.5.0軟件進行響應面分析，建立三元二次回歸方程預測模型并確定最佳的提取工藝參數(shù)，因子編碼及水平設(shè)計見表1。

1.4.3 優(yōu)化工藝驗證試驗

選取同一樣品，稱取3份各0.1 g，按照響應曲面法確定的最佳提取工藝參數(shù)制備蟲草酸待測液，再按照1.3.2的方法測定蟲草酸的含量，求其平均值，然后與響應曲面法所得的最優(yōu)預測值進行比較，計算RSD（%）值。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度試驗

取同一樣品，平行稱取6份各 0.1 g，按照

1.3.2的方法測定蟲草酸的含量。

1.5.2 穩(wěn)定性試驗

日內(nèi)穩(wěn)定性試驗：取同一樣品的蟲草酸提取液，分別在0、2、4、10、14、24 h間隔內(nèi)按照1.3.2的方法測定蟲草酸的含量。

日間穩(wěn)定性試驗：取同一樣品的蟲草酸提取液，分別在1、2、3、4、6、8 d間隔內(nèi)按照1.3.2的方法測定蟲草酸的含量。

1.5.3 加標回收率試驗

吸取蟲草酸樣品液9份，各1 mL，分別加入質(zhì)量濃度為30、50、70 mg/L的標準品溶液0.5 mL，每組3份，編號為J1、J2、J3。按照1.3.2的方法測定蟲草酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草酸標準曲線的制作

100 mg/L的蟲草酸標準溶液于 350～500 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，在414 nm處有最大吸收。蟲草酸標準液在10～60 mg/L范圍內(nèi)，其吸光度與質(zhì)量濃度有較好的線性關(guān)系（如圖1所示），其線性回歸方程為：y=0.005 0x-0.012 2，R=0.999 2。

圖1 蟲草酸標準曲線Fig.1 Standard curve of cordycepic acid

2.2 單因素試驗結(jié)果

液料比、浸提時間、浸提溫度對蟲草酸提取量的影響如圖2所示，隨著液料比的不斷增大，蟲草酸提取量先升高后逐步趨于穩(wěn)定。當液料比為35∶1時，蟲草酸提取量達到小高峰為22.47 mg/g。隨著浸提時間的延長，蟲草酸提取量呈先升高后降低趨勢，當浸提時間為2.5 h時，蟲草酸含量達到最大，為23.36 mg/g。隨著浸提溫度的提高，蟲草酸提取量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，之后趨于平穩(wěn)，當浸提溫度達到30℃時，蟲草酸的提取量達到最大值，為26.76 mg/g。

圖2 液料比、浸提時間和浸提溫度對蟲草酸提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio,extraction duration,and extraction temperature on the yield of cordycepic acid

2.3 響應曲面法試驗結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，確定了顯著影響蟲草素提取量的單因素水平。應用 Design-Expert 8.0.5.0軟件，以蟲草酸提取量為響應值，根據(jù)根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計了液料比（A）、浸提時間（B）和浸提溫度（C）3個因素3個水平共17個試驗點的響應面分析試驗。設(shè)計方案及試驗結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 響應面試驗結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

利用 Design-Expert 8.0.5.0軟件進行自變量液料比（A）、浸提時間（B）和浸提溫度（C）對菌絲共生體蟲草酸提取量（mg/g）（Y）回歸分析，建立三元二次多項回歸方程:

由表3可知，本試驗得出的二次回歸模型具有極高的顯著性（P<0.000 1），說明方程的擬合度良好，失擬項不顯著（P=0.563 2），符合模型要求，可利用該模型分析最佳提取工藝條件。其校正決定系數(shù)為0.994 8，表明約有99.48%的蟲草酸含量的變化可由此回歸模型解釋，相關(guān)系數(shù)為0.997 7，表明蟲草酸含量的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，可用于雜糧蛹蟲草菌絲共生體蟲草酸提取的分析和預測。

根據(jù)F值的大小可以判斷3個因素對菌絲共生體蟲草酸提取量的影響，其顯著性順序為B>C> A，即浸提時間>浸提溫度>液料比；三因素間兩兩交互作用對蟲草酸提取量的影響顯著性順序為：BC>AC>AB，交互作用的響應曲面如圖3所示。綜上單因素分析與多因素響應面分析可知，除一次項A達到顯著水平（P<0.05），其他一次項和二次項都達到極高度顯著水平（P<0.000 1），表明液料比、浸提時間、浸提溫度3個因素對蟲草酸提取量均具有顯著影響。

表3 試驗結(jié)果方差與分析Table 3 Variance analysis of test results

圖3 交互作用對蟲草酸含量影響的響應曲面Fig.3 Response surface plots of mutual action on the content of cordycepic acid

2.3.2 提取工藝優(yōu)化及驗證試驗（表4）

利用軟件對回歸模型進一步分析，得到水浴法提取雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草酸的最佳提取工藝為液料比27.51∶1，浸提時間3 h，浸提溫度35℃，實際操作中可將料液比設(shè)定為28∶1。在該工藝條件下蟲草酸提取量的理論值為28.481 9 mg/ g。在此最優(yōu)條件下進行3次平行驗證試驗，菌絲共生體中蟲草酸的提取量平均值為28.178 5 mg/ g，與理論預測值相比，RSD=0.81%,表明多元回歸方程具有良好的預測性，所選工藝條件重現(xiàn)性較好。

表4優(yōu)化工藝驗證試驗結(jié)果（n=3）Table 4 Results of verification test of optimized process（n=3）

2.4 方法學考察結(jié)果

2.4.1 精密度

如表5所示，蟲草酸含量測定精密度試驗的RSD值為0.86%，表明精密度較好。

表5 精密度測試Fig.5 Tests of precision

2.4.2 穩(wěn)定性

如表6和表7所示，在24 h和6 d內(nèi)測定蟲草酸含量的穩(wěn)定性均較高，RSD值分別為1.65%、1.25%。

表6 穩(wěn)定性測試（日內(nèi)）Fig.6 Tests of Stability（intra-day） mg/g

表7 穩(wěn)定性測試（日間）Fig.7 Test of stability(inter-day) mg/g

2.4.3 加標回收率

如表8所示，樣品中蟲草酸特異性較好，RSD值為0.59%。

表8 加標回收率測定Table 8 Determination results of recovery rate

3 討論與結(jié)論

液料比對蟲草酸的提取率有一定影響，提取液過少可能在達到飽和時仍然沒有完全提取。鄧黎等[10]研究認為液料比為50 mg/L時蟲草酸提取率最大，與本研究進行二次提取所得結(jié)論相近。在模型的方差分析中，液料比對蟲草酸提取量的影響并不十分顯著，可能是因為本實驗進行了兩次提取，削弱了液料比這一因素對蟲草酸的影響。浸提時間對體系中其他條件有一定的依賴性，多以整個體系的變化而變化，本研究顯示在2～2.5 h期間蟲草酸含量極速增加，這與肖建輝[11]、劉桂君等[12]研究認為浸提時間為2 h是蟲草酸的提取量最高的結(jié)論有差異。在選擇水浴提取條件中，李建平[13]研究得到的最佳浸提溫度為90℃，劉桂君等[12]研究認為對菌絲體進行提取的最佳溫度為60℃，對固體培養(yǎng)物進行提取時則為100℃，與本實驗有較大差別。而Xiao等[9]研究得到的最佳浸提溫度為40℃，與本研究結(jié)果較為接近。浸提溫度低，可減少雜質(zhì)溶出，但效率相對較低。而過高溫度可能破壞游離成分結(jié)構(gòu)。本試驗以30%乙醇為提取劑，沒有把浸提溫度設(shè)置過高也是考慮到其對提取劑的影響。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應面分析法，建立了菌絲共生體中蟲草酸提取工藝的三元二次回歸方程，經(jīng)檢驗，能夠較好地預測菌絲共生體中蟲草酸的提取量。響應面回歸分析得到優(yōu)化組合條件為：液料比28∶1，浸提時間3 h，浸提溫度35℃。在該工藝條件下蟲草酸提取量的理論值為28.481 9 mg/g。同時，本研究從方法學角度驗證了酶標儀-分光光度法測定菌絲共生體中蟲草酸含量的可靠性，為雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草酸含量的測定及其開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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OPTIMIZED EXTRACTION AND CONTENT DETERMINATION OF CORDYCEPIC ACID FROM MULTIGRAIN CORDYCEPS MILITARIS HYPHASE SYMBIONTS

JIANG Yonghong，ZHANG Xiaofeng，HAN Ping，LIU Li’e，CHANG Zhengjiao，WANG Wenning
(College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

The paper studied the optimization of water bath extraction process of cordycepic acid from Multigrain cordyceps militaris hyphase symbionts，as well as the feasibility of using microplate reader-UVS to determine the content of cordycepic acid.Based on three single factor experiments，the extraction process was optimized by response surface analysis;and the content of cordycepic acid was determined by microplate reader-UVS.Results showed that the optimum extraction conditions were as follows:liquid-to-material ratio 28∶1，extraction duration 3 hours，and extraction temperature 35℃.Under the optimum conditions，the content of cordycepic acid was up to 28.178 5 mg/g，with RSD of 0.81%.This study proved the process was reliable and the determination method was feasible.

Multigrain cordyceps militaris hyphase symbionts；cordycepic acid；response durface analysis；microplate reader-UVS

TS201.2

B

1673-2383(2017)01-0088-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170222.1117.034.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-2-22 11:17:07

2016-05-06

蔣永紅（1990—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與相關(guān)疾病。

*通信作者