汪芳芳，孫建宏，葉建斌，馬 科，毛多斌，楊雪鵬*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250000）

靜息細(xì)胞降解葉黃素生產(chǎn)香味物質(zhì)的條件優(yōu)化

汪芳芳1，孫建宏2，葉建斌1，馬 科1，毛多斌1，楊雪鵬1*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250000）

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）A20的靜息細(xì)胞降解葉黃素生產(chǎn)香味物質(zhì)進(jìn)行條件優(yōu)化。確定最佳轉(zhuǎn)化條件為：培養(yǎng)時(shí)間120 min，溫度31.14℃，pH值為4.98，細(xì)胞濃度為17.64%，底物質(zhì)量濃度為70 mg/L，此時(shí)葉黃素降解率為71.37%，與軟件預(yù)測值71.54%相吻合，表明優(yōu)化方案達(dá)到了預(yù)期效果，且具有良好的穩(wěn)定性。對靜息細(xì)胞降解葉黃素的發(fā)酵液中的主要成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，得到其主要產(chǎn)物為8-甲基-α-紫羅蘭酮和3-氧化-α-紫羅蘭酮。

靜息細(xì)胞；葉黃素降解率；Box-Behnken設(shè)計(jì)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

0 引言

葉黃素又名植物黃體素，是含氧類胡蘿卜素的一種，兩端成環(huán)。葉黃素在自然界中分布較廣，富含于多種蔬菜 、花卉 、水果等植物中[1]。在一定條件下，葉黃素可以發(fā)生降解產(chǎn)生一系列香味物質(zhì)，是重要的香料前體物[2]，因碳碳雙鍵斷裂位置的不同，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成多種重要的香味物質(zhì)，如環(huán)氧紫羅蘭酮、氫化異佛爾酮、茶香螺酮和二氫彌猴桃內(nèi)酯等[3]，這些香味物質(zhì)的閾值較低，具有一定的生物學(xué)意義和商業(yè)價(jià)值[4]。

目前關(guān)于葉黃素降解的報(bào)道主要有化學(xué)降解、物理降解和生物降解法[5]。生物法降解葉黃素由于其反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、成本低、副產(chǎn)物少、分離純化較容易等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的重視[6]。在前期工作中，主要是使用試驗(yàn)室篩選出的能高效降解葉黃素的菌株——霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）A20直接發(fā)酵葉黃素生產(chǎn)香味物質(zhì)，然而這種生物降解方法為后期產(chǎn)香物質(zhì)的提取增加了很大難度，因此作者利用霍氏腸桿菌A20的靜息細(xì)胞作為催化劑，生物降解葉黃素。靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化是將菌體生長與產(chǎn)物形成過程分開，是以整個(gè)細(xì)胞作為反應(yīng)催化劑,對外源底物進(jìn)行修飾的生物轉(zhuǎn)化[7]。它除具有正常細(xì)胞發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)外，還具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢：如可排除底物、產(chǎn)物對細(xì)胞生長的影響；可排除培養(yǎng)基中的成分對產(chǎn)物的干擾；可人為控制細(xì)胞與底物的加量；可有效地實(shí)現(xiàn)循環(huán)生物轉(zhuǎn)化[8]。作者以霍氏腸桿菌靜息細(xì)胞作為催化劑，研究其降解葉黃素的整體過程，為生物法高效降解葉黃素制備香味物質(zhì)提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍氏腸桿菌A20：前期篩選出的能高效降解葉黃素的菌株，本實(shí)驗(yàn)室保存。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度> 90%）：鄭州利研有限公司。

葉黃素溶液用200 mg的葉黃素分散在2 g吐溫80中，溶解在400 mL二氯甲烷中，將溶劑減壓蒸出，溶解在10 mL乙醇中[9]。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母5 g、NaCI 1 g、蒸餾水1 L、pH=7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8 g、酵母10 g、蛋白胨5 g、K2HPO40.72 g、蒸餾水1 L、pH=7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫振蕩器：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1260 infinity液相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫科技公司；GR85DA高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：德國Herolab公司。

1.3 方法

1.3.1 靜息細(xì)胞的制備

挑選單菌落接種到種子液培養(yǎng)基中，放置于25℃、200 r/min的搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，反應(yīng)至菌液濃度測得OD600值為2～2.5時(shí)，得到種子液，放置在4℃冰箱中備用。將培養(yǎng)好的種子液按1.5%的接種量接入裝液量為 100 mL的三角瓶中，在25℃、200 r/min條件下避光培養(yǎng)42 h后，在4℃、6 500 r/min下離心30 min，棄上清液，再用無菌生理鹽水洗滌2遍，離心收集細(xì)胞使其懸浮于生理鹽水中（V生理鹽水:V原培養(yǎng)液=1∶20），放在 4℃下備用[10]。

1.3.2 葉黃素降解率測定方法

1.3.2.1 發(fā)酵液預(yù)處理方法

在避光條件下，將發(fā)酵液在4℃下6 500 r/min離心30 min，將離心后的上清液用二氯甲烷進(jìn)行分離萃取，得到的萃取液加無水Na2SO4干燥過夜，再進(jìn)行真空濃縮，蒸干溶劑后，再加2 mL甲醇，過0.45 μm的有機(jī)系膜，待HPLC分析，并用等體積不加靜息細(xì)胞作為對照。

1.3.2.2 HPLC分析的條件

色譜柱選擇C18柱（4.6 mm×250 mm，直徑為5 μm），柱溫為30℃，流動(dòng)相為甲醇（體積比為1∶99），流速為0.6 mL/min，波長為460 nm，進(jìn)樣量為5 L。

1.3.2.3 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別以甲醇配制20、40、80、120、160、200 mg/L的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)建立的色譜條件進(jìn)行HPLC分析后，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），橫坐標(biāo)（X）代表質(zhì)量濃度，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中：C試驗(yàn)為試驗(yàn)組中葉黃素的質(zhì)量濃度，mg/L；

C對照為對照組中葉黃素的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.3 靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

將適量A20靜息細(xì)胞懸液于不同pH值的0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，加入適量底物葉黃素溶液，100 mL搖瓶裝液量為30 mL于不同溫度下，150 r/min振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間，測定葉黃素降解率[11]。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇對葉黃素降解有顯著影響的4個(gè)因素，即溫度、pH值、細(xì)胞濃度、底物質(zhì)量濃度為自變量，以葉黃素降解率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)出四因素三水平的試驗(yàn)方案[12]，見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定

1.3.5.1 樣品的處理

在避光的條件下，將發(fā)酵液進(jìn)行離心、萃取、干燥、真空濃縮至1 mL后，過0.45 μm的有機(jī)系膜，進(jìn)行GC-MS定性分析，并用等體積不加靜息細(xì)胞作為對照。

1.3.5.2 GC-MS分析條件

氣相條件：色譜柱：HP-5（30 m×0.25 mm；0.25 mm)；升溫程序：初始溫度45℃，保持5 min，以4℃/min升到110℃，保留5 min，以1℃/min升到150℃，保留5 min，以3℃/min升到200℃，以5℃/min升到280℃，保留5 min；進(jìn)樣口溫度：270℃；傳輸線溫度：270℃；分流比：1∶1；載氣：He；流速：1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離電壓70 eV；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍：30～550 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照色譜條件測定，結(jié)果如圖1所示。峰面積（Y）與濃度（X）的回歸方程為 Y=43.135X+ 57.84，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，表明在0～200 mg/L濃度范圍內(nèi)，葉黃素濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.l Lutein standard curve

2.2 靜息細(xì)胞降解葉黃素的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度對葉黃素降解率的影響

固定濃度為20%的靜息細(xì)胞懸浮于pH為7.0的緩沖液中，添加60 mg/L葉黃素溶液，100 mL搖瓶裝液量為30 mL于不同溫度150 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，測定葉黃素降解率。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)溫度在20～30℃時(shí)，隨著溫度的升高，加速酶的產(chǎn)生，葉黃素降解率明顯提高，達(dá)到了46.2%；當(dāng)溫度超過30℃后降解率明顯降低，這可能是由于反應(yīng)溫度過高降低了酶的活性，故靜息細(xì)胞的催化受到一定程度的限制[13]。因此，溫度過高或者過低都不利于靜息細(xì)胞降解葉黃素，故選擇30℃較好。

圖2 不同溫度對葉黃素降解率的影響Fig.2 Effects of temperature on degradation rate of lutein

2.2.2 pH值對葉黃素降解率的影響

固定濃度為20%的靜息細(xì)胞懸浮于不同pH值的緩沖液中，添加60 mg/L葉黃素溶液，100 mL搖瓶裝液量為30 mL于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，測定葉黃素降解率。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，葉黃素的降解率最高達(dá)到60.8%。這表明靜息細(xì)胞降解葉黃素的最適 pH值為 4.5～5.5，過酸或過堿環(huán)境都不利于酶的活性[14]。因此，選擇的最適pH值為5.0。

圖3 不同pH值對葉黃素降解率的影響Fig.3 Effects of pH value on degradation rate of lutein

2.2.3 細(xì)胞濃度對葉黃素降解率的影響

分別將不同濃度的靜息細(xì)胞懸浮于pH值5.0的緩沖液中，添加60 mg/L葉黃素溶液，100 mL搖瓶裝液量為30 mL于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，測定葉黃素降解率。結(jié)果如圖4所示，細(xì)胞是降解葉黃素的酶系載體，其濃度直接決定著該酶系的酶活力和轉(zhuǎn)化效果[15]。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到15% 時(shí)，葉黃素降解率達(dá)到最高68.8%；此時(shí)繼續(xù)增加細(xì)胞濃度，葉黃素降解率反而有所降低，這可能是由于過高的靜息細(xì)胞濃度造成了細(xì)胞膜的破裂，影響了酶的活性，從而降低了葉黃素降解率[13]。因此，選擇靜息細(xì)胞濃度為15%。

圖4 不同細(xì)胞濃度對葉黃素降解率的影響Fig.4 Effects of cell concentration on degradation rate of lutein

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

固定濃度為15%的靜息細(xì)胞懸浮于pH值5.0的緩沖液中，分別添加不同質(zhì)量濃度葉黃素溶液，100 mL搖瓶裝液量為30 mL，于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，測定葉黃素降解率。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)葉黃素質(zhì)量濃度低于80 mg/L時(shí)，隨著葉黃素質(zhì)量濃度的增加，葉黃素的降解量快速增加；此后繼續(xù)增加葉黃素質(zhì)量濃度時(shí)，葉黃素的降解量卻有所下降，這可能是由于高質(zhì)量濃度葉黃素對靜息細(xì)胞中的酶活有底物抑制作用，從而導(dǎo)致葉黃素的降解量降低[11]。因此，選擇葉黃素質(zhì)量濃度為80 mg/L。

圖5 不同底物質(zhì)量濃度對葉黃素降解率的影響Fig.5 Effects of substrate concentration on degradation rate of lutein

2.2.5 時(shí)間對靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

固定濃度為15%的靜息細(xì)胞懸浮于pH值5.0的緩沖液中，添加80 mg/L葉黃素溶液，100 mL搖瓶裝液量為30 mL，于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間，測定葉黃素降解率。由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，葉黃素的降解率達(dá)到59.5%，之后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長葉黃素的降解率達(dá)到平衡狀態(tài)幾乎不再增加。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為120 min。

圖6 轉(zhuǎn)化時(shí)間對葉黃素降解率的影響Fig.6 Effects of transformation time on degradation rate of lutein

2.3 靜息細(xì)胞降解葉黃素的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件，試驗(yàn)結(jié)果見表2。對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為：

葉黃素降解率=-212.55+12.765A-88.284B-0.985C-51D-0.02AB+0.041AC+0.07AD+0.97BC+ 6.699BD-0.289CD-0.219A2-12.883B2-0.116C2-0.033D2。

對該回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，回歸模型非常顯著（P<0.000 1），模型失擬項(xiàng)影響不顯著（P=0.076 5> 0.05），決定系數(shù)R2=0.962，說明回歸方程的擬合度較好，能夠正確反映因變量與考察的自變量之間之間的關(guān)系；由F值判斷，在選擇范圍內(nèi)，這4個(gè)因素對葉黃素降解率的影響順序?yàn)镈>C>A>B。綜上所述，使用該模型可以較好地對響應(yīng)值（葉黃素降解率）進(jìn)行分析和預(yù)測[16]。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖分析

通過 Design Expert軟件對4個(gè)因素分別兩兩交互，作出響應(yīng)曲面，如圖7所示。由圖7可知，pH值與細(xì)胞濃度對葉黃素降解的交互作用最強(qiáng)。應(yīng)用Design Expert軟件得到葉黃素降解最優(yōu)條件為溫度31.14℃，pH值4.98，細(xì)胞濃度17.64%，底物質(zhì)量濃度 70 mg/L，葉黃素降解率的預(yù)測值為71.54%。對優(yōu)化后的最佳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，平行試驗(yàn)3次，得到的葉黃素降解率平均為71.37%，與理論預(yù)測值基本吻合，說明該回歸方程能比較真實(shí)地反映各因素對葉黃素降解率的影響，因此，使用該回歸模型優(yōu)化靜息細(xì)胞降解葉黃素的培養(yǎng)條件是可行的。而初始培養(yǎng)條件得到的降解率為39.8%，說明優(yōu)化后的降解率提高了79.32%。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.4 葉黃素降解產(chǎn)物的鑒定

對靜息細(xì)胞降解葉黃素的發(fā)酵液中的主要成分進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如圖8所示，葉黃素降解的主要產(chǎn)物為8-甲基-α-紫羅蘭酮和3-氧化-α-紫羅蘭酮。

根據(jù)GC-MS分析檢測結(jié)果，對靜息細(xì)胞降解葉黃素的降解路徑進(jìn)行推測，結(jié)果如圖9所示。葉黃素在雙加氧酶作用下，斷裂9’-10’位得到3-羥基-α-紫羅蘭酮，3-羥基-α-紫羅蘭酮迅速氧化成3-氧化-α-紫羅蘭酮。3-氧化-α-紫羅蘭酮再經(jīng)過轉(zhuǎn)化得到8-甲基-α-紫羅蘭酮，但具體的轉(zhuǎn)化過程并不知曉，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model

圖7 各因素交互作用對葉黃素降解影響的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface plots of impacts of interaction effect of factors on degradation of lutein

圖8 葉黃素降解產(chǎn)物GC-MS分析Fig.8 GC-MS chromatograms of degradation products of lutein

圖9 葉黃素降解路徑Fig.9 Biodegradation route of lutein

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)合的方法對靜息細(xì)胞降解葉黃素的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳轉(zhuǎn)化條件為：培養(yǎng)時(shí)間120 min，溫度31.14℃，pH值為4.98，細(xì)胞濃度17.64%，底物質(zhì)量濃度70 mg/L，最終得到葉黃素降解率為71.37%，比優(yōu)化前提高了79.32%。葉黃素在靜息細(xì)胞的作用下裂解產(chǎn)生8-甲基-α-紫羅蘭酮和3-氧化-α-紫羅蘭酮。

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OPTIMIZATION OF LUTEIN DEGRADATION PROCESS FOR PRODUCING AROMA COMPONENTS BY USING RESTING CELLS

WANG Fangfang1，SUN Jianhong2，YE Jianbin1，MA Ke1，MAO Duobin1，YANG Xuepeng1
(1.Food and Bioengineering College，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China；2.Technology Center of Shandong China Tobacco Industry Co.，Ltd.，Jinan 250000，China)

Based on single factor experiments，the Box-Behnken response surface design was conducted to optimize the degradation conditions of lutein for producing aroma components by using resting cells of Enterobacter hormaechei A20.The optimized conditions were as follows:incubation time 120 min，temperature 31.14℃，pH 4.98，cell concentration 17.64%，and substrate concentration 70 mg/L.Under the optimum conditions，the degradation rate of lutein was up to 71.37%，consistent with the software prediction value 71.54%，which indicated that the optimized scheme reached the expected effect and had good stability.The main components in fermentation broth of lutein degraded by resting cells were detected by GC-MS，and were identified as 8-methyl-α-ionone and 3-oxo-α-ionone.

resting cells；degradation rate of lutein；Box-Behnken design；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS201.3

B

1673-2383(2017)01-0094-07

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-2-22 11:17:11

2016-06-21

汪芳芳（1992—），女，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

*通信作者