王昕悅，曹少軍，趙華杰，秦靜，武曉丹，胡曉慧，陳榮榮

(恒楓食品科技有限公司，浙江 杭州，311215)

不同菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁的風(fēng)味成分變化分析

王昕悅，曹少軍，趙華杰，秦靜，武曉丹，胡曉慧，陳榮榮*

(恒楓食品科技有限公司，浙江 杭州，311215)

利用植物乳桿菌EM1L115、乳酸克魯維酵母EM1Y071發(fā)酵蘋果濃縮汁，對比分析發(fā)酵前后的揮發(fā)性香氣成分、游離氨基酸、有機(jī)酸等的成分及變化。發(fā)現(xiàn)EM1L115發(fā)酵蘋果濃縮汁風(fēng)味改變不顯著，主要貢獻(xiàn)成分為乳酸；EM1Y071單菌以及與EM1L115協(xié)同發(fā)酵蘋果濃縮汁有較明顯的風(fēng)味變化且二者差異性大，主要是發(fā)酵代謝生成的酯類、醇類，以及呈味氨基酸和有機(jī)酸變化協(xié)同改變的結(jié)果。

發(fā)酵蘋果濃縮汁；乳酸克魯維酵母；植物乳桿菌；香氣成分；游離氨基酸；有機(jī)酸

蘋果濃縮汁具有快速處理易腐果蔬、節(jié)省空間成本、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)；但因在濃縮過程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)因蒸發(fā)而逸散，營養(yǎng)物質(zhì)也有所損耗，造成其缺乏鮮榨蘋果汁的香氣、口感和營養(yǎng)成分[1]。從目前市場上看，我國蘋果濃縮汁大多只是進(jìn)行簡單的粗加工，缺乏核心競爭力[2]；針對濃縮造成的問題，一般采用香氣回填進(jìn)行改良；在發(fā)酵工藝上，主要生產(chǎn)蘋果醋和蘋果酒，而對于利用發(fā)酵改善風(fēng)味的蘋果濃縮汁研究較少。

為此，本研究通過乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)單菌及混菌發(fā)酵蘋果濃縮汁，利用菌株生長代謝生成的氨基酸類、有機(jī)酸類、醇類、酯類等豐富蘋果濃縮汁的風(fēng)味和口感，并分析發(fā)酵前后風(fēng)味成分的變化，以期獲得具有不同方向的獨(dú)特風(fēng)味、多元化的發(fā)酵蘋果濃縮汁。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

植物乳桿菌EM1L115(LactobacillusplantarumEM1L115)、乳酸克魯維酵母EM1Y071(Kluyveromyceslactis)；均由宏勝飲料集團(tuán)有限公司食品研發(fā)中心保藏提供。

1.1.2 蘋果濃縮汁的制備

將脫色蘋果濃縮汁(山東佳美食品工業(yè)有限公司，70°Brix)用二級水稀釋到25°Brix，95 ℃巴氏殺菌10 min，冷卻至30 ℃待用。

1.1.3 主要試劑

2-辛醇(2-Octanol)(99%，內(nèi)標(biāo)，比利時(shí)Acros公司)；乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸：色譜純,美國Sigma-Aldrich公司；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液,和光純藥工業(yè)株式會社；甲醇：色譜純,西班牙Scharlau公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Quintix513-1CN型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)；ML1602電子天平，梅特勒托利多；YXQ-LS50SⅡ自動溫控高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-cj-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Agilent 7890A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；L-8900氨基酸自動分析儀，日立集團(tuán)；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵蘋果濃縮汁的制備

以菌種作為本試驗(yàn)中唯一單因素變量，其余發(fā)酵條件一致進(jìn)行發(fā)酵；將EM1L115、EM1Y071單菌以及1∶1混合的菌粉(后文均分別用A、B、C代替)，以0.01%接種量接種于上述處理好的蘋果濃縮汁中，以不接種的蘋果濃縮汁作為對照，同時(shí)在30 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，發(fā)酵完畢后將其在85 ℃滅菌5 min冷卻后在12 000 r/min下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾離心獲得上清液，測其揮發(fā)性香氣成分、游離性氨基酸、有機(jī)酸含量。

1.3.2 揮發(fā)性香氣成分的測定

1.3.1.1 預(yù)處理?xiàng)l件

采用固相微萃取法(solid-phasemicroextraction,SPME)，樣品用量0.5 g，內(nèi)標(biāo)2-辛醇0.005～0.008 g，萃取頭：DVB/CAR/PDMS，50/30μm；吸附溫度50 ℃，吸附時(shí)間30 min，解吸時(shí)間5 min。

1.3.1.2 氣相條件

色譜柱：HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；進(jìn)樣口250 ℃，分流比40∶1，載氣流速1.0 mL/min；升溫程序：50 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，以12 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

1.3.1.3 質(zhì)譜條件

離子化能量70 eV；MSD傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃；四級桿溫度150 ℃；MS掃描范圍m/z30～500。

1.3.3 游離氨基酸的測定

使用日立L-8900氨基酸分析儀，采用GB/T5009.124—2003 食品中氨基酸的測定的方法[3]測定。

1.3.4 有機(jī)酸的測定

色譜柱：CAPECELL PAK MG S5 C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測器檢測波長210 nm，流動相：用V(0.1%磷酸溶液)∶V(甲醇)=97.5∶2.5的流動相等度洗脫10 min，然后用較短的時(shí)間梯度讓甲醇相達(dá)到100%并平衡5 min，再將流動相調(diào)整為V(0.1%磷酸溶液)∶V(甲醇)=97.5∶2.5，平衡5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁香氣成分測定結(jié)果及比較

不同菌種在發(fā)酵過程中由于菌種代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會對果汁風(fēng)味有較明顯的影響。以蘋果酒為例，蘋果原料自身固有香氣在長時(shí)間發(fā)酵過程中被分解，而長時(shí)間發(fā)酵過程中，酵母種類和發(fā)酵條件是造成蘋果酒風(fēng)味獨(dú)特性的主要因素，尤其是高級醇和酯類的種類含量占主導(dǎo)地位[4]。乳酸克魯維酵母是一種非釀酒酵母屬酵母，發(fā)酵性能較差，乙醇生成含量低；但合理的利用，可以有效地豐富乳酒或果酒中風(fēng)味物質(zhì)[5]。

通過氣象色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析EM1L115(A)、EM1Y071(B)、二者混合(C)發(fā)酵蘋果濃縮汁以及未發(fā)酵蘋果濃縮汁的香氣成分，圖1是分析所得的相應(yīng)質(zhì)譜總離子流色譜圖，表1是數(shù)據(jù)分析結(jié)果；其中2-辛醇和2-辛酮是為內(nèi)標(biāo)及內(nèi)標(biāo)衍生物。從表1可以清楚地看出植物乳桿菌發(fā)酵在香氣上貢獻(xiàn)并不大，除糠醛外均無顯著性變化；糠醛具有苦杏仁味，EM1L115發(fā)酵后可以降低其含量，但沒有EM1Y071發(fā)酵降低的幅度大。

表1 不同發(fā)酵蘋果濃縮汁的香氣成分

注：A-植物乳桿菌EM1L115發(fā)酵蘋果汁;B-乳酸克魯維酵母EM1Y071發(fā)酵蘋果汁;C-兩菌種混合發(fā)酵。(以下各圖、表與此注相同)。

圖1 不同發(fā)酵蘋果濃縮汁香氣成分的總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatograms of aroma components in different fermented apple juice concentrate

對比表1中未發(fā)酵和B的香氣成分，乳酸克魯維酵母單菌發(fā)酵能大大增加蘋果濃縮汁中的揮發(fā)性香氣成分。EM1Y071發(fā)酵產(chǎn)生6種酯類物質(zhì)；乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯都具有醚香、甜的果香，乙酸異戊酯具有強(qiáng)烈的如香蕉、生梨等甜的水果香氣；發(fā)酵使糠醛大量降低同時(shí)，乙酸糠酯會給濃縮汁帶來堅(jiān)果和焦糖香氣；乙酸苯乙酯會提供果香、花香、蜜糖及熱帶水果香氣、帶有酵母香的味道；這些酯類大大豐滿了寡淡的蘋果濃縮汁的香氣。EM1Y071代謝還產(chǎn)生了正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等高級醇，這些高級醇幾乎全部是在酵母的氨基酸合成途徑中形成，適量的高級醇可以提高蘋果濃縮汁香氣的層次感和濃郁度；異戊醇帶有醇香、醚香、香蕉香，而苯乙醇具有玫瑰花甜香。在蘋果酒香氣的研究中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇均是影響蘋果酒香氣的重要因素[6-7]，還有研究表明乙酸乙酯是蘋果濃縮汁發(fā)酵蘋果酒的特有香氣組分[8]；EM1Y071發(fā)酵蘋果汁主導(dǎo)香氣成分為：乙酸乙酯、異戊醇、乙酸苯乙酯，與蘋果酒香氣成分研究吻合，由于發(fā)酵時(shí)間短，含量上有所相差。

EM1L115與EM1Y071協(xié)調(diào)發(fā)酵與EM1Y071單菌發(fā)酵有較大的變化。主要體現(xiàn)在乙醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯在發(fā)酵過程中降低，丙酸乙酯、乙酸丙酯升高；并且生成了2-乙?；秽Ｔ撐镔|(zhì)具有甜香、堅(jiān)果香、煙熏香的香氣特征，有研究表明乳酸菌能分解蘋果酒中的檸檬酸生成雙乙酰及其衍生物，提高蘋果酒的風(fēng)味復(fù)雜度，起到修飾作用[9]；由于發(fā)酵時(shí)間短，雙乙酰及其衍生物含量低，并不會對香氣造成負(fù)面影響。

2.2 不同菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁游離氨基酸測定結(jié)果及比較

不同菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁的氨基酸分析圖譜見圖2，不同菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁的游離氨基酸含量分析見表2。可以看出，3種發(fā)酵蘋果濃縮汁的游離氨基酸變化各有不同，其中天冬氨酸含量最高，是蘋果濃縮汁的主要氨基酸。

表2 不同發(fā)酵蘋果濃縮汁的游離氨基酸成分

注：*表示必需氨基酸。

圖2 不同發(fā)酵蘋果濃縮汁的氨基酸分析圖譜Fig.2 Free amino acid profiles of different fermented apple juice concentrate

對比EM1L115發(fā)酵蘋果濃縮汁(A)和未發(fā)酵的蘋果濃縮汁，可以發(fā)現(xiàn)除羥基脯氨酸外，其余成分均有不同比例的下降，造成了濃縮蘋果汁風(fēng)味略單薄、清淡。

EM1L115與EM1Y071協(xié)同發(fā)酵中游離氨基酸的變化能較好的反映2株菌株在蘋果濃縮汁中的代謝情況。例如蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸在雙菌協(xié)同發(fā)酵中的含量處于A和B之間，這4種氨基酸在EM1L115發(fā)酵中被消耗，在EM1Y071發(fā)酵中有所生成；從側(cè)面的反映了酵母菌代謝可以給乳酸菌提供氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)乳酸菌的生長。酵母菌可以將苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭掖迹粚Ρ華、B、C三者，苯丙氨酸未發(fā)酵>B>A/C，但從香氣成分看，苯乙醇在混菌發(fā)酵中并沒有檢測出；有研究表明蘋果酒在生物降酸過程中，隨著乳桿菌等的蘋果酸-乳酸(malolactic fermentation, MLF)發(fā)酵過程，苯乙醇也會隨之降低[12]。從呈味氨基酸來看，協(xié)同發(fā)酵纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸雙菌發(fā)酵降幅高于酵母菌發(fā)酵，苦味氨基酸下降使協(xié)同發(fā)酵蘋果濃縮汁更為甜醇。

2.3 不同菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁有機(jī)酸測定結(jié)果及比較

表3是發(fā)酵蘋果濃縮汁有機(jī)酸測定結(jié)果，由于酒石酸均未檢測出，因此表中未顯示。植物乳桿菌是同型發(fā)酵乳酸菌，有機(jī)酸中乳酸增長較為明顯，由于發(fā)酵溫度處于30 ℃，且蘋果濃縮汁酸度較高，乳酸的增長速率并不大。EM1Y071單菌發(fā)酵中主要是檸檬酸的上升，酵母在三羧酸循環(huán)中會生成檸檬酸中間產(chǎn)物；但酵母菌代謝并不產(chǎn)生乳酸，而B中乳酸有所上升，此情況與湯云成在研究釀酒酵母在葡萄汁發(fā)酵中代謝流構(gòu)建中一致，其中酵母-乳酸關(guān)系原理依然不明[13]。C的有機(jī)酸含量對比A、B，乳酸、乙酸進(jìn)一步增加，檸檬酸和蘋果酸含量降低。分析認(rèn)為一方面取決于雙菌協(xié)同發(fā)酵有促進(jìn)作用，促使代謝活動增強(qiáng)；另一方面得益于EM1L115的MLF過程。蘋果酸-乳酸發(fā)酵在果酒發(fā)酵中有重要的意義，可以使得果酒酸澀、粗糙等特點(diǎn)消失，提高酒體穩(wěn)定性，整體風(fēng)味呈現(xiàn)柔和、豐滿、醇香增強(qiáng)的效果[14]。主要是由于乳桿菌等可以利用蘋果酸-乳酸酶催化蘋果酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?；伴隨此過程中，還會分解濃縮汁中的糖、檸檬酸等成分，生成乙酸及微量雙乙酰及其衍生物。因此C中乳酸、乙酸的增加，蘋果酸的降低也符合代謝規(guī)律。

表3 不同發(fā)酵蘋果濃縮汁的有機(jī)酸成分

3 討論

選用植物乳桿菌、乳酸克魯維酵母短時(shí)間發(fā)酵蘋果濃縮汁，一方面保證蘋果濃縮汁乙醇含量較低，使其可以廣泛應(yīng)用在酒類、甜品、飲料等多方面領(lǐng)域；另一方面菌種發(fā)酵后能很好的改善蘋果濃縮汁風(fēng)味寡淡的缺點(diǎn)，利用發(fā)酵形成多風(fēng)味方向的蘋果濃縮汁。

植物乳桿菌EM1L115發(fā)酵對蘋果濃縮汁風(fēng)味物質(zhì)影響主要是有機(jī)酸的改變；乳酸克魯維酵母EM1Y071的發(fā)酵蘋果濃縮汁，乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、異戊醇等是香氣成分的主體骨架，在發(fā)酵過程中消耗了大部分苦味氨基酸，對蘋果濃縮汁風(fēng)味有大大的改善；2株菌株協(xié)同發(fā)酵后，香氣成分和有機(jī)酸成分的變化是造成酵母單菌和協(xié)同發(fā)酵風(fēng)味迥異的原因，一方面是菌株代謝存在協(xié)同促進(jìn)，另一方面得益于EM1L115蘋果酸-乳酸發(fā)酵。雖然發(fā)酵蘋果濃縮汁中香氣成分是痕量上的變化，但感官上差異明顯。發(fā)酵蘋果濃縮汁的游離氨基酸變化與菌株代謝活動密切。

本研究主要初步探討了不同菌種短時(shí)發(fā)酵蘋果濃縮汁中風(fēng)味物質(zhì)的變化，但由于是短時(shí)發(fā)酵，一部分痕量香氣成分有可能未分析檢測到但對風(fēng)味有所影響，而氨基酸、有機(jī)酸的含量一直處于動態(tài)變化中，對于不同菌株發(fā)酵過程，并沒有進(jìn)行動態(tài)變化跟蹤和代謝監(jiān)控。后期試驗(yàn)既可以深入研究不同發(fā)酵條件對單一菌種發(fā)酵蘋果濃縮汁風(fēng)味的影響，還能延長發(fā)酵時(shí)間，深入分析酵母菌、乳酸菌、多菌協(xié)同發(fā)酵的氨基酸、有機(jī)酸等代謝機(jī)理和關(guān)鍵酶類，對果汁加工業(yè)、果酒加工業(yè)中起到理論指導(dǎo)作用。

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Analysis on flavor compounds of concentrated apple juice fermented by different strains

WANG Xin-yue, CAO Shao-jun, ZHAO Hua-jie, QIN Jing, WU Xiao-dan, HU Xiao-hui, CHEN Rong-rong*

(Ever Maple Food Science & Technology Co., Ltd., Hangzhou 311215, China)

The aroma components, free amino acids, and organic acids of concentrated apple juice and corresponding changes before and after fermentation byLactobacillusplantarumstrain EM1L115 orKluyveromyceslactisstrain EM1Y071 were comparatively analyzed. Results showed that flavor compounds of concentrated apple juice fermented withL.pEM1L115 had no significant change, except that more lactic acid was detected. When the concentrated apple juice was fermented with single strainK.lactisEM1Y071 or cooperative fermentation withK.lactisEM1Y071 andL.pEM1L115, significant changes of volatile flavor compounds were detected due to changes of ester, alcohols, amino acids and organic acids after fermentation. This article provides the basic theory for flavor control and metabolic regulation on fermentation of fruit and vegetables.

fermented apple juice concentrate;Kluyveromyceslactis;Lactobacillusplantarum; aroma components; free amino acids; organic acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704038

碩士研究生(陳榮榮高級工程師為通訊作者，E-mail：rongrong.chen@h-shgroup.com)。

2016-10-24，改回日期：2017-01-04