曾 明,杜曉云,吳美華,王彥波

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江西 南昌 330200)

江西柿屬種質(zhì)資源遺傳多樣性的IRAP標記分析

曾 明,杜曉云*,吳美華,王彥波

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江西 南昌 330200)

利用逆轉(zhuǎn)座子間擴增多態(tài)性(Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism, IRAP)分子標記對收集的49份江西柿屬種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析。從26個IRAP引物中篩選出擴增條帶清晰且多態(tài)性豐富的10個引物,PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)得到清晰的指紋圖譜。將418條清晰條帶(多態(tài)性100%)轉(zhuǎn)換為0/1矩陣,聚類分析結(jié)果表明：供試的江西柿屬種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.69～0.92之間,分屬柿、油柿、野柿三個種,遺傳多樣性豐富;明晰了幾個分類關(guān)系模糊的柿種質(zhì)資源的種屬關(guān)系。

江西;柿屬;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;IRAP

柿屬(Diospyrosspp.)植物包含近500個種[1],廣泛分布于溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū),我國有近70個種和變種[2]。柿(DiospyroskakiL.)作為柿屬中最具代表性的栽培樹種,經(jīng)濟價值大,品種繁多,我國經(jīng)過鑒定、整理統(tǒng)計的原產(chǎn)柿品種資源有1058個[3]。江西柿屬植物資源豐富[4],各傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)有許多地方栽培種以及實生野生資源[5]；因未系統(tǒng)地對這些資源進行遺傳多樣性研究,多數(shù)資源的分類地位和親緣關(guān)系不清楚,不利于柿屬種質(zhì)資源的鑒定、保護和利用。

分子標記因其多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好,成為植物種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性研究最常用的方法[6-8]。目前,柿屬植物中已報道的DNA分子標記涉及五大類13種[9],其中基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標記因具有靈敏度高、基因覆蓋度廣和多態(tài)性豐富等特點,尤其適用于種質(zhì)資源遺傳多樣性研究和品種鑒定[10]。由Kalendar開發(fā)的逆轉(zhuǎn)座子間擴增多態(tài)性(IRAP)標記技術(shù),可以揭示基因組中逆轉(zhuǎn)座子之間序列的多樣性[11],相對于其他逆轉(zhuǎn)座子分子標記如RBIP、SSAP、REMAP,其操作步驟簡化，靈敏度更高[12]。杜曉云等(2006)成功建立了柿屬IRAP標記,并進行了部分柿屬植物指紋圖譜構(gòu)建和遺傳關(guān)系分析[13]。

我們分析了49份江西柿屬種質(zhì)資源的IRAP分子標記,通過比瓊脂糖凝膠電泳分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)得到清晰的指紋圖譜，通過聚類分析明晰了各種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,確定了部分分類模糊的資源的種屬關(guān)系,可為江西柿屬種質(zhì)資源的鑒定、保護和利用提供可靠的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試柿屬種質(zhì)資源材料見表1,其中49份材料是對江西本地資源調(diào)查后通過異位嫁接保存于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柿資源圃的樣本;陽豐(Youhou)、君遷子(D.lotus)、浙江柿(D.glaucifolia)、油柿(D.oleifera)、金棗柿(D.zhejiangensis)、老鴨柿(D.rhombifolia)采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柿種質(zhì)資源圃。引物由Invitrogen公司(上海)合成,2×Easy Taq PCR Super Mix試劑購自TRANSGEN公司,其它藥品主要來自Solarbio公司。

表1 供試的柿屬種質(zhì)資源樣本及來源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 基因組總DNA的提取參考Luo Z R, et al.(1995)[14]的方法。使用微量核酸儀檢測DNA的質(zhì)量及濃度,A260/A280比值在1.8左右,將終濃度稀釋至20 ng/μL,在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增和引物篩選 PCR擴增體系參考Du X Y, et al.(2009)[15]，在20 μL反應(yīng)體系中含模板DNA(20 ng/μL)4 μL、引物(10 μmol/L)3.2 μL、2×Easy Taq PCR Super Mix 10 μL、水2.8 μL。擴增程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min ramp+0.6 ℃/s,72 ℃ 2 min,42個循環(huán);72 ℃延伸8 min,4 ℃終止。

通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測IRAP擴增情況，進行引物篩選,26條引物序列參考Du X Y, et al(2008)[16]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 用篩選出的引物對所有樣本進行擴增,擴增產(chǎn)物變性后進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳[16],用數(shù)碼相機拍照記錄電泳圖譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將電泳圖譜中清晰的條帶按1(有)、0(無)記錄,通過NTSYSpc v2.10e軟件[17]進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

根據(jù)各引物所擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測情況,篩選擴增片段在200～500 bp且條帶清晰、多態(tài)性良好的引物。最后選出10條引物:PPT1、PPT3、PPT6、PPT7、PPT8、SAF2、SAF5、SAR1、SAR6、SAR10。部分引物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。

序號1～55代表的基因型詳見表1；M: 100 bp DNA Ladder。

2.2 IRAP標記的指紋圖譜

擴增產(chǎn)物變性后經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)得到指紋圖譜,其條帶較瓊脂糖凝膠電泳更豐富且清晰度更高,部分引物的指紋圖譜如圖2。

序號1～55代表的基因型詳見表1； M: 100 bp Plus ⅡDNA Ladder。

2.3 PAGE條帶的統(tǒng)計結(jié)果

PAGE圖譜顯示的條帶大多分布在100～600 bp,過小或過大的片段在6%聚丙烯酰胺凝膠中不易識別,最佳范圍是200～500 bp,條帶清晰易辨。10個引物共擴增出418條PAGE清晰條帶,多態(tài)比例達100%(見表2)。

表2 10個引物擴增的PAGE條帶統(tǒng)計分析結(jié)果

2.4 遺傳多樣性聚類結(jié)果

基于418條譜帶的UPGMA聚類圖見圖3。所有供試樣本的遺傳相似系數(shù)在0.58～0.92之間,根據(jù)相似系數(shù)將它們劃分成4個群體:柿種群(Ⅰ)、油柿種群(Ⅱ)、野柿種群(Ⅲ)和其他種群(Ⅳ)。在0.718處,可將柿和柿屬其他種(油柿、野柿、老鴉柿、金棗柿、君遷子及浙江柿)區(qū)分開;4個油柿樣本聚類關(guān)系較近,與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相符;野柿3號(YES3)和宜豐5號(YES2)聚類關(guān)系相近,且不在柿種之內(nèi),表明兩者同歸屬野柿種。在柿種樣本中,與其他柿樣本相似性最小的是宜豐10號(相似系數(shù)0.740),表明它與其他柿樣本的親緣關(guān)系較遠;其次是日本完全甜柿品種陽豐(0.745),表明完全甜柿和澀柿之間差異明顯。野柿4號(YES4)、宜豐4號(YES1)和棗柿(疑似君遷子類型)在聚類圖中與柿種聚在一起,與非柿種的樣本相距很遠,所以在此聚類中應(yīng)劃歸為柿種。總的來看,柿種樣本有少數(shù)顯示地域性親緣相近(如高安的方柿1號與方柿2號相近;宜豐的宜豐7號、宜豐9號、宜豐4號相近;宜豐6號與宜豐8號相近;金溪2號與金溪3號相近;鄱陽5號與鄱陽7號相近),但并不絕對(如臨川1號和上饒鳥柿最相近)。

3 討論

3.1 IRAP分子標記特別適合于研究種質(zhì)資源遺傳多樣性和品種鑒定

在本研究的UPGMA聚類圖中,所有供試柿樣本被劃分成4個群體:柿種群、油柿種群、野柿種群和其他種群,這與鄧立寶[18](2014)的研究結(jié)果相似。供試樣本中的油柿類型雖然在果實大小和形狀上有較大不同,但聚類關(guān)系很近,說明它們有相同的起源。油柿和柿的親緣關(guān)系較野柿、老鴉柿、金棗柿、君遷子、浙江柿更近,這與耿攀等[19](2010)的研究結(jié)果相似。贛方1號是由高安方柿選育出來的少核品種,在聚類圖中和高安方柿1號、方柿2號相距較遠,可能為枝(芽)變選育而來,形成新品種。杜曉云等(2011)已證明了用IRAP分子標記進行柿品種鑒定的高效性[20],本研究繼續(xù)支持這一結(jié)論。在現(xiàn)有研究報道中,IRAP檢測普遍采用瓊脂糖凝膠檢測,所得指紋圖譜的分辨率不高,條帶信息量少。本研究通過篩選擴增片段在200～500 bp且多態(tài)性好的引物,結(jié)合分辨率更高的PAGE檢測,提高了條帶的分辨率和信息量,指紋圖譜更加精細。鑒于本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果的吻合性,我們認為在篩選合適引物的基礎(chǔ)上,PAGE凝膠指紋圖譜揭示的信息含量更高,更能發(fā)揮IRAP分子標記的優(yōu)勢。

3.2 江西柿屬資源的遺傳多樣性豐富

根據(jù)文獻記錄，江西柿屬植物有8個種和1個變種[4]。我們資源圃目前收集的江西柿屬種質(zhì)資源共計49份,分屬柿、油柿、野柿3個種,遺傳相似系數(shù)在0.69～0.92之間,表明這些資源具有豐富的遺傳多樣性。樣本中有一些是無核枝(芽)變種,如于都餅柿存在無核枝變,贛方1號為高安方柿少核變異品種,這些均可作為今后新品種選育和基礎(chǔ)研究的理想材料。

江西油柿資源很豐富,果形多樣,有圓形(油柿1號)、橢圓形(油柿2號)、紡錘形(油柿3號)、扁圓形(最近發(fā)現(xiàn)的永修小油柿)等;果個、果重迥異,在我們的調(diào)查中,會昌油柿1號果大,果重近200.0 g,而永修的小油柿只有6.5 g左右。聚類分析顯示油柿樣本間的相似系數(shù)在0.695～0.740之間,種內(nèi)差異比較明顯。這些特點為油柿進一步作為單寧專用品種篩選提供了基本材料。

3.3 宜豐10號的原始性

宜豐10號是宜豐縣天寶鄉(xiāng)的一棵古柿樹,據(jù)相關(guān)部門考證至少有940年樹齡。在柿種之中宜豐10號與其它樣本的相似性最低(0.740),說明它與其他柿的親緣關(guān)系較遠,其在進化上相對原始。我們對宜豐10號生物學(xué)特性的觀察發(fā)現(xiàn),在其雄花中雜有少量雌花,進一步佐證了其具有相對原始的特性。關(guān)于宜豐10號以及其他的江西古柿資源在進化過程中的作用擬進一步開展研究。

圖3 供試柿樣本的UPGMA聚類分析結(jié)果

3.4 江西許多野生柿資源尚未見系統(tǒng)的遺傳學(xué)研究,有些資源的分類地位模糊,命名不科學(xué)

宜豐4號(YES1)和野柿4號(YES4)兩個樣本,它們和柿種聚類較近而與野柿種相距很遠,應(yīng)該為野生的實生柿種,故不宜編名為野柿種。高安棗柿曾疑為君遷子或與之很相近,但聚類研究表明它與君遷子親緣關(guān)系相距很遠,因此,在本研究中應(yīng)歸于柿種,其小果多籽特性在砧木的開發(fā)利用方面非常有潛力。

4 結(jié)論

IRAP標記技術(shù)非常適合于種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析,通過篩選擴增片段在特定范圍且多態(tài)性好的引物,并結(jié)合PAGE凝膠電泳,能得到分辨率高、信息量更為豐富的指紋圖譜,充分發(fā)揮IRAP標記的技術(shù)優(yōu)勢。

江西柿屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富,有很多地方特色品種,品質(zhì)優(yōu)良,如于都盒柿、無核餅柿、高安方柿等。適合的地理位置和地理環(huán)境使江西成為柿屬資源的重要分布區(qū)域,有很多特異的柿種質(zhì)資源有待進一步調(diào)查、挖掘、保護和利用。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Genetic Diversity Analysis ofDiospyrosspp. Germplasm Resources in Jiangxi by Using IRAP Molecular Marker

ZENG Ming, DU Xiao-yun*, WU Mei-hua, WANG Yan-bo

(Institute of Horticultural Science, Jiangxi Academy of Agricultural Science, Nanchang 330200, China)

The genetic diversities of 49 germplasm resources inDiospyrosin Jiangxi were analyzed by using IRAP (Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism) molecular marker. Ten primers which had clear bands and polymorphism in PCR amplification were screened out from 26 IRAP primers, and the PCR-amplified products presented clear fingerprint by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The 418 clear bands (100% diversity) were transformed into 0/1 matrix, and the clustering analysis showed that the genetic similarity coefficients among the tested 49 germplasm resources varied from 0.69 to 0.92, and these germplasm resources belonged to 3 species (DiospyroskakiThunb.,DiospyrosoleiferaCheng, andDiospyroskakivar.silvestisMakino), which revealed abundant genetic diversity. In addition, the species taxonomic relationships among severalDiospyrosspp. germplasm resources were clarified.

Jiangxi;Diospyros; Germplasm resource; Genetic diversity; IRAP

2016-12-23

江西省自然科學(xué)基金項目(20151BAB204031);江西省杰出青年科學(xué)家資助計劃項目(20162BCB23054);江西省科技 支撐計劃重點項目(20151BBF60009);江西省農(nóng)科院創(chuàng)新基金項目(2013CQN003);江西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科研協(xié)同創(chuàng)新專項 (JXXTCX2015006-003);江西省農(nóng)科院科技創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化基金項目(優(yōu)勢創(chuàng)新團隊)(2015CJJ001)。

曾明(1975─),男,助理研究員,碩士,從事果樹資源與遺傳育種研究。*通訊作者:杜曉云。

S665.2

A

1001-8581(2017)06-0029-06