張鳳春，費(fèi)英敏，黃巧莉

(1.鐵力市四寶生物科技有限公司，黑龍江鐵力152500；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150066；3.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150025)

林蛙皮膠原蛋白酸法提取工藝及性質(zhì)研究

張鳳春1，費(fèi)英敏2，黃巧莉3

(1.鐵力市四寶生物科技有限公司，黑龍江鐵力152500；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150066；3.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150025)

以林蛙皮為原料，研究其膠原蛋白的酸法提取工藝條件, 通過單因素試驗(yàn)及Design Expert軟件分析預(yù)測(cè)，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際優(yōu)化調(diào)整提取膠原蛋白最優(yōu)工藝條件為：料液比1∶18，鹽酸濃度為0.16mol/L，浸提時(shí)間為5h，膠原蛋白提取最大量為28.20%。同時(shí)，對(duì)林蛙皮膠原蛋白產(chǎn)品進(jìn)行傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描圖譜顯示，通過酸法提取的膠原蛋白保存有比較完整的螺旋結(jié)構(gòu)。DSC差熱掃描得到酸溶膠原的變性溫度為52.4℃，高于豬皮和牛皮膠原的變性溫度37℃。

林蛙皮；酸法提取；膠原蛋白

東北林蛙(RanadybowskiiGuenther)[1-2]，俗稱田雞、哈什蟆，屬于兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬(Rana)[3-5]，主要分布于我國(guó)東北地區(qū)。東北林蛙平均蛋白質(zhì)占總量的56.3%左右，另外，還含有蛙醇、多糖類、磷脂及多種激素等?，F(xiàn)有研究除有關(guān)林蛙油的藥用及食用等功效外，多偏于對(duì)林蛙的保健功能的研究。膠原蛋白是一種天然蛋白質(zhì)，是由3條肽鏈擰成的螺旋型纖維狀蛋白質(zhì)，是一種糖蛋白，分子含糖及甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等，是體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，在人體中約占總蛋白質(zhì)含量的四分之一，存在于幾乎所有組織中。酸法提取即利用酸在一定的外界環(huán)境條件下提取膠原蛋白，主要采用低離子濃度酸性條件破壞分子間的鹽鍵，而引起纖維膨脹、溶解，作為溶劑使用的酸，主要有鹽酸、醋酸、檸檬酸和甲酸等，采用酸法提取的膠原蛋白通常稱為酸溶性膠原蛋白。酸溶解法可將沒有交聯(lián)的膠原分子溶解出來，也可溶解含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原纖維。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法[6-11]。

本研究選取最佳酸種類，通過單因素實(shí)驗(yàn)選取對(duì)酸法提取膠原蛋白影響顯著的因素水平，利用響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)得到林蛙皮酸溶膠原蛋白最佳提取工藝條件。通過紫外掃描、傅立葉紅外掃描、變性溫度和氨基酸組成分析等對(duì)原蛋白性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

經(jīng)過預(yù)處理的林蛙皮：實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鈉、鹽酸、草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、冰乙酸，均為分析純?cè)噭?。HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；721-型紫外可見分光光度計(jì) 756P：spectrum；日立835-50型氨基酸分析儀：日本日立公司；凱氏定氮器：上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司；TDL-80-2B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸種類的選擇

1.2.2 林蛙皮膠原蛋白工藝流程。稱取適量經(jīng)預(yù)處理的林蛙皮→恒溫浸酸→打漿→均質(zhì)→水洗→抽濾→離心→干燥

1.2.3 操作要點(diǎn)。首先，選擇適量林蛙皮，進(jìn)行清洗篩選備用。然后，將清選后的林蛙皮加入酸溶液，用保鮮膜封口，在20℃恒溫水浴振蕩48h，在此期間，每間隔12h更換一次酸溶液以保證酸提取效果。將浸酸后的林蛙皮經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，經(jīng)真空抽濾去除蛙組織，即得粗酸提膠原蛋白溶液，將粗酸提膠原蛋白溶液置于燒杯內(nèi)不斷攪拌，以2.5mol/L NaCl進(jìn)行鹽析1h，經(jīng)10000r/min高速離心機(jī)離心20min，除去上清液，取沉淀于表面皿中，在50℃條件下烘干12h。最終得到的乳白色固體即為酸溶膠原蛋白。

1.2.4 料液比對(duì)林蛙皮膠原蛋白提取率的影響。稱取適量經(jīng)預(yù)處理的林蛙皮，以不同料液比加入0.1mol/L 的酸溶液，在20℃恒溫水浴振蕩6h，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，進(jìn)行抽濾，得到粗酸提膠原溶液，以膠原蛋白提取率作為指標(biāo)確定料液比。

1.2.5 酸濃度對(duì)林蛙殘?bào)w膠原蛋白提取率的影響。稱取適量經(jīng)預(yù)處理的林蛙皮，選取不同濃度的酸溶液，在20℃恒溫水浴振蕩6 h，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，進(jìn)行抽濾，得到粗酸提膠原溶液，以膠原蛋白提取率作為指標(biāo)確定酸濃度。

1.2.6 酸提時(shí)間對(duì)林蛙殘?bào)w膠原蛋白提取率的影響。稱取適量經(jīng)預(yù)處理的林蛙皮，在20℃恒溫水浴振蕩不同時(shí)間，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，進(jìn)行抽濾，得到粗酸提膠原溶液，以膠原蛋白提取率作為指標(biāo)確定提取時(shí)間。

1.2.7 響應(yīng)曲面試驗(yàn)分析。應(yīng)用Design-Expert 7.0.0 Trial軟件，以每組試驗(yàn)中林蛙皮酸法提取的膠原蛋白提取率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。得到酸法提取林蛙皮膠原蛋白的最佳工藝條件。響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平及編碼表見表1。

表1 酸法提取林蛙皮膠原蛋白實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼表

1.3 酸法提取林蛙皮膠原蛋白性質(zhì)研究

1.3.1 紫外掃描(UV spectra)分析。采用紫外分光光度計(jì)在190～400nm進(jìn)行掃描0.3g/L的膠原乙酸溶液。

1.3.2 傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析。將一定量干燥的KBr和膠原蛋白凍干品至于瑪瑙研缽中，研磨均勻，成粉末狀，裝樣，手動(dòng)壓片，取出樣品小心放入樣品室。采用Nicolet-SX-170傅立葉紅外光譜儀對(duì)樣品在400cm-1～4000cm-1掃描，掃描信號(hào)累加200次，分辨率為4cm-1。

1.3.3 變性溫度的測(cè)定。將裝有0.3g/L的膠原乙酸溶液的烏氏粘度計(jì)浸入水浴中[7],測(cè)定膠原溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間。水浴溫度自15℃上升至188℃，每個(gè)測(cè)定溫度穩(wěn)定2min。

相對(duì)黏度(Relative viscosity)= ηr= 樣品流動(dòng)時(shí)間 / 空白流動(dòng)時(shí)間

增比黏度(Specific viscosity)= ηsp= (η-η0) / η0= ηr-1以變性溫度變化對(duì)增比黏度作圖，在增比黏度變化曲線上取其變化一半的溫度作為膠原的變性溫度。

1.3.4 氨基酸組成分析。取適量提取得到的膠原蛋白樣品，在減壓充氮條件下用6mol/L HCl于110℃水解24h。采用日立835-50型氨基酸分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，茚三酮顯色，對(duì)生成紫色化合物的常規(guī)氨基酸在570nm檢測(cè)；對(duì)形成黃色產(chǎn)物的脯氨酸和羥脯氨酸在440nm檢出。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸種類的選擇

圖1 不同種類酸溶液對(duì)林蛙皮膠原蛋白的提取效果比較

由圖1可知，在上所述操作條件下，鹽酸對(duì)林蛙皮中膠原蛋白的提取效果最佳，膠原含量明顯高于其他酸種類，因此，選取鹽酸作為酸法提取林蛙皮膠原蛋白的提取劑。

2.2 酸法提取林蛙皮膠原蛋白工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)林蛙皮膠原提取率的影響

圖2 不同料液比的林蛙皮膠原蛋白提取率

從圖2知，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)林蛙殘?bào)w膠原蛋白提取率最高，隨著料液比的增大，羥脯氨酸含量降低，這是由于料液比越大，溶液中的羥脯氨酸濃度則越低的緣故，并不能說明此時(shí)OD值大提取效果就好。應(yīng)通過計(jì)算酸粗提液中的膠原含量，并計(jì)算得出該料液比下的膠原蛋白提取率，通過提取率的大小確定1∶20為酸法提取林蛙殘?bào)w膠原蛋白的最佳料液比。

2.2.2 酸濃度對(duì)林蛙皮膠原提取率的影響

圖3 不同酸濃度的林蛙皮膠原蛋白提取率

從圖3中可知，隨著鹽酸濃度的增加，林蛙皮中膠原蛋白的溶出量明顯增多，從而膠原蛋白的提取率不斷增加，但酸濃度不可過高，否則會(huì)影響所提取的膠原蛋白的纖維結(jié)構(gòu)。當(dāng)鹽酸濃度由0.15mol/L升至0.20mol/L過程中，膠原蛋白提取率明顯增加，繼續(xù)加大濃度，則膠原蛋白提取率增加平緩，因此選取0.20mol/L作為提取林蛙皮膠原蛋白的適宜鹽酸濃度。

2.2.3 酸提時(shí)間對(duì)林蛙皮膠原提取率的影響

圖4 酸提時(shí)間的林蛙皮膠原蛋白提取率

從圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽酸溶液對(duì)林蛙皮膠原蛋白的提取率明顯遞增，在4～5 h內(nèi)增加最明顯，5h后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽酸溶液對(duì)林蛙皮膠原蛋白的提取率繼續(xù)增加，但增加趨勢(shì)低于5h，因此，選取5h為鹽酸溶液提取林蛙皮膠原蛋白的適宜時(shí)長(zhǎng)。

2.2.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]，確定鹽酸提取林蛙皮膠原蛋白最優(yōu)工藝條件。利用Design Expert軟件，采用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案[13]，以料液比、鹽酸濃度、浸提時(shí)間對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

表2 響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)點(diǎn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

設(shè)該模型通過最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程可表達(dá)為：

Y = C0+ C1A + C2B + C3C + C12AB + C13AC + C23BC + C11A2+ C22B2+ C33C2

(1)

式中，Y為預(yù)測(cè)相應(yīng)值，C0為常數(shù)項(xiàng)，C1、C2、C3分別為線性系數(shù)，C12、C13、C23為交互項(xiàng)系數(shù)，C11、C22、C33為二次項(xiàng)系數(shù)。為了確立二次多項(xiàng)方程(1)，利用Design Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，獲得酸法提取林蛙皮膠原蛋白提取率對(duì)編碼自變量料液比、鹽酸濃度、浸提時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y = 27.46-3.52A-2.20B + 0.62C-0.12AB-1.07AC-2.15BC-10.21A2-3.26B2-7.84C2

表3為二次多項(xiàng)模型方差分析表。

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表

其模型的F值為44.14，說明該模型有意義。其中A、B、BC、A2、B2、C2這幾項(xiàng)為顯著性的模型項(xiàng)。而此概率大于0.1即說明該模型項(xiàng)對(duì)于模型影響不顯著，可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行分析調(diào)整。

失擬項(xiàng)的F值為30.82，說明失擬項(xiàng)相對(duì)于誤差項(xiàng)來講不顯著，該失擬項(xiàng)說明模型的擬合性非常好，可以用于模型分析。其中預(yù)測(cè)系數(shù)為0.7333，相對(duì)于校正決定系數(shù)的0.9604而言擬合度好，決定系數(shù)為0.98277，說明該模型的擬合性非常好，可以用于模型分析。本模型的信噪比達(dá)到8.99，說明該模型可以用于生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中。

通過Design Expert軟件分析，得出最優(yōu)條件為：料液比1∶18，鹽酸濃度為0.16mol/L，浸提時(shí)間為5～10h，該條件下酸法提取林蛙皮膠原蛋白提取率的預(yù)測(cè)值為28.20%?？紤]實(shí)際生產(chǎn)條件，將此條件優(yōu)化為：料液比1∶18，鹽酸濃度為0.16mol/L，浸提時(shí)間為5h。

2.3 林蛙皮酸溶膠原蛋白的性質(zhì)研究

2.3.1 傅立葉紅外掃描。林蛙皮酸溶膠原的傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描圖譜見圖5～6。酰胺A出現(xiàn)于3400cm-1左右，是N-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，表明氫鍵的存在。酰胺B出現(xiàn)于3080cm-1，這是膠原在掃描中通常出現(xiàn)的波長(zhǎng)[17]。酰胺I出現(xiàn)在1640cm-1，酰胺II在1585cm-1，酰胺III在1257cm-1，它們各自表示C=O的伸縮振動(dòng)，N-H的彎曲振動(dòng)和 C-H的伸縮振動(dòng)[18]。酰胺I和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，酰胺III證明了螺旋結(jié)構(gòu)的存在[19-20]。因此，傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描證明了實(shí)驗(yàn)制取的林蛙皮酸溶膠原保存有比較完整的螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 酸溶膠原的傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描圖譜

2.3.2 變性溫度的測(cè)定。如圖6所示，鹽酸提取林蛙皮中的膠原蛋白的變性溫度為52.40℃，高于豬皮和牛皮膠原變性溫度37℃，這表明提取林蛙油后的剩余林蛙皮具有替代高等陸生脊椎動(dòng)物作為膠原蛋白來源潛力[21]。

圖6 酸溶膠原熱變性曲線

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及DesignExpert軟件分析，酸法提取林蛙殘?bào)w膠原蛋白優(yōu)化條件為：料液比1∶18，鹽酸濃度為0.16mol/L，浸提時(shí)間為5h，該條件下膠原蛋白提取最大量為28.20%。

傅立葉紅外掃描發(fā)現(xiàn)提取得到的膠原中，酰胺I和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，酰胺III證明了螺旋結(jié)構(gòu)的存在。因此，傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描證明了實(shí)驗(yàn)制取的林蛙殘?bào)w酸溶膠原保存有比較完整的螺旋結(jié)構(gòu)。經(jīng)測(cè)定，林蛙殘?bào)w的變性溫度為52.40℃，這表明提取林蛙油后的剩余林蛙殘?bào)w具有替代高等陸生脊椎動(dòng)物作為膠原蛋白來源的潛力。

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Study on Extraction Technology and Properties of Collagen fromRanachensinensis

Zhang Fengchun1, Fei Yingmin2, Huang Qiaoli3

(1. Tieli City Sibao Biological Technology Co. LTD., Tieli 152500; 2. Heilongjiang Vocational College for Nationalities,Harbin 150066; 3. Heilongjiang Vocational College Of Biology Science And Technology , Harbin 150025)

This thesis is to extract collagen from the remainingRanachensinensisskin, and to study the collagen by acid extraction and enzymatic extraction process. Through analyzing and forecasting by the single-factor test and Design Expert software, according to the actual , the optimum process condition of products are: solid-liquid ratio 1∶18, hydrochloric acid concentration of 0.16mol/L, extraction time of 5h , the maximum amount of collagen extraction was 28.2%. Fourier transformation infrared scan patterns showed that acid extraction of the products, the experiments proved the system to take the acid-soluble collagen is the preservation of the original spiral structure completely. DSC scanning results showed that the acid-soluble collagen of original protein denaturation temperature is 52.4℃,which is more than the skin and cowhide collagen denaturation temperature of 37℃.

Ranachensinensisskin; Acid extraction; Collagen protein

2017-03-16

黑龍江省省院科技合作項(xiàng)目(hz201309)

張鳳春(1972-)，男，經(jīng)濟(jì)師，研究方向?yàn)榱滞墚a(chǎn)品的開發(fā)研究，E-mail：tlsibao@126.com。

S966.3+5;R284.2

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.001