徐小民, 張京順, 蔡增軒, 張 晶, 黃百芬, 許嬌嬌, 陳 苘

(浙江省疾病預防控制中心, 浙江 杭州 310051)

研究論文

在線液相色譜-二極管陣列檢測器-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測野生菌中鵝膏毒肽和鬼筆毒肽

徐小民*, 張京順, 蔡增軒, 張 晶, 黃百芬, 許嬌嬌, 陳 苘

(浙江省疾病預防控制中心, 浙江 杭州 310051)

建立了在線液相色譜-二極管陣列檢測器-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-DAD-MS/MS)同時測定野生菌中多肽類蘑菇毒素(鵝膏毒肽和鬼筆毒肽)的分析方法。樣品經(jīng)甲醇提取,水稀釋后,在堿性條件下用XBridgeTMBEH C18柱(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm)分離,并先后用DAD和MS/MS檢測。使用堿性流動相能夠?qū)崿F(xiàn)5種多肽類蘑菇毒素在15 min內(nèi)達到基線分離,同時又能有效抑制質(zhì)譜加鈉峰[M+Na]+的響應(yīng)信號,保證檢測的穩(wěn)定性和靈敏度。5種蘑菇毒素在0.05～500 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.99;檢出限為0.005～0.02 mg/kg。通過實際樣品檢測,證明該法操作簡單、快速，靈敏度高,寬的定量檢測線性范圍能滿足實際樣品中蘑菇毒素含量變化大的特點。

在線液相色譜-二極管陣列檢測器-串聯(lián)質(zhì)譜法;寬線性范圍定量;蘑菇毒素;鵝膏毒肽;鬼筆毒肽；野生菌

鵝膏毒肽(amanitins)和鬼筆毒肽(phallotoxins)屬于致命的環(huán)狀多肽類蘑菇毒素,小鼠半數(shù)致死量(LD50)分別為0.3～0.7 mg/kg和1.5～3 mg/kg[1],前者主要包括α-鵝膏毒肽(α-amanitin)、β-鵝膏毒肽(β-amanitin)和γ-鵝膏毒肽(γ-amanitin),后者主要包括羧基二羥鬼筆毒肽(phallacidin)和二羥鬼筆毒肽(phalloidin)。我國野生菌資源豐富,已報道的有3 800種以上,而有毒的有435種[2]。近年來,我國因有毒蘑菇引起的突發(fā)中毒事件頻繁發(fā)生,2004～2014年的病死率高達21.24%[3],主要由能引起肝腎功能衰竭的多肽類蘑菇毒素引起。

圖 1 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的結(jié)構(gòu)式和MS/MS碎裂途徑Fig. 1 Structures and MS/MS collision ways of amanitins and phallotoxins

多肽類蘑菇毒素主要存在于鵝膏菌和褐鱗傘等野生菌中[4,5],但不同野生菌中毒素含量水平差異較大,同一野生菌中不同毒素異構(gòu)體的含量也存在較大差異。陳作紅等[4]采用液相色譜-紫外檢測法(LC-UV)檢測發(fā)現(xiàn)灰花紋鵝膏菌Amanitafuliginea中不同毒素的含量范圍可達9～9 311 μg/g(干重)。目標化合物含量水平的差異需要檢測方法具有較寬的線性范圍,以實現(xiàn)單針進樣滿足不同含量的毒素異構(gòu)體的定量要求。文獻報道的多肽類蘑菇毒素的定性定量檢測方法主要有LC-UV[4,5]、液相色譜-二極管陣列檢測法(LC-DAD)[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7-9]和液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法(LC-TOF MS)[10,11]。LC-UV或LC-DAD對含量較高的蘑菇毒素的定量有優(yōu)勢,但含量較低時容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果,不利于毒素異構(gòu)體的檢出,而此類異構(gòu)體對于多肽類蘑菇毒素的生物合成或代謝研究意義重大。LC-MS/MS適用于低含量水平的蘑菇毒素的定量檢測,但對于高濃度且異構(gòu)體含量差異較大的樣品,需要多步稀釋才能得到準確的結(jié)果。本研究基于在線LC-DAD-MS/MS聯(lián)用技術(shù),建立了一種寬線性范圍的野生菌中多肽類蘑菇毒素的定性定量檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-MS 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和SPD-M30A 二極管陣列檢測器(日本島津公司);超純水裝置(美國Millipore公司); T25組織勻漿機(德國IKA公司); HC-3018高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司); KQ-500E超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)。

甲醇為色譜純(德國Merck公司);氨水為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽標準品純度均大于90%(美國Alexis公司),具體化學結(jié)構(gòu)式見圖1。野生菌樣品由杭州及周邊地區(qū)自行采集得到。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取5種蘑菇毒素標準品于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備液,于-20 ℃避光保存;分別移取1 mL標準儲備液,用甲醇稀釋并配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準使用液;移取適量混合標準使用液,用25%(v/v)甲醇水溶液配制質(zhì)量濃度為0.001～25 mg/L的系列混合標準溶液。

1.3 分析條件

色譜柱:XBridgeTMBEH C18柱(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,美國Waters公司);流動相:(A)0.03%(v/v)氨水(pH 10.7)和(B)甲醇。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 5%B～35%B; 4.0～6.0 min, 35%B; 6.0～9.0 min, 35%B～90%B; 9.0～11.0 min, 90%B; 11.0～11.5 min, 90%B～5%B; 11.5～15.0 min, 5%B。流速:0.35 mL/min;進樣量:5.0 μL。 DAD檢測掃描范圍:200～450 nm(各毒素的具體定量檢測波長見表1);閥切換時間:0～4.0 min,洗脫液通過切換閥排入廢液槽,4.0～15.0 min,洗脫液切換至質(zhì)譜儀。

離子源:電噴霧離子(ESI)源;正離子模式;離子源接口電壓:4.5 kV;霧化氣:氮氣,3.0 L/min;干燥氣:氮氣,10 L/min;加熱氣:空氣,10 L/min;碰撞氣:氬氣;脫溶劑管溫度:250 ℃;加熱塊溫度:350 ℃;接口溫度:250 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。5種多肽類蘑菇毒素的其他質(zhì)譜條件見表1。

表 1 5種多肽類蘑菇毒素的保留時間(tR)、母離子、子離子和其他分析參數(shù)

CE: collision energy; DAD: diode array detector; *quantitation ion.

1.4 樣品前處理

將新鮮野生菌切成小塊,組織勻漿機勻漿后,置于-20 ℃保存。準確稱取勻漿后的試樣約2 g(精確至0.01 g),置于15 mL聚丙烯刻度離心管中,加入8 mL甲醇,渦旋混勻1 min,超聲提取15 min,待冷卻至室溫后,用甲醇定容至10 mL,混勻,以4 000 r/min離心2 min,移取1 mL上清液,加入3 mL純水,渦旋混勻,過0.22 μm濾膜,供檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜碎裂途徑

電噴霧技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)的定量檢測[12,13]。多肽類蘑菇毒素的二級質(zhì)譜碎裂途徑見圖1。鵝膏毒肽類物質(zhì)通過碎裂途徑1可以得到相對豐度較強的質(zhì)譜峰(m/z86.1);通過碎裂途徑2可以得到相對豐度強的α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽質(zhì)譜峰(m/z259.1)和γ-鵝膏毒肽質(zhì)譜峰(m/z243.1)。其中,γ-鵝膏毒肽相較另兩種鵝膏毒肽少一個氧原子,其質(zhì)譜圖如出現(xiàn)相差1個氧原子的質(zhì)譜峰,則可以佐證碎裂途徑2的存在。羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽存在共同的碎裂途徑3和4,可得到相同的碎片離子峰(m/z157.1和m/z330.1)。

2.2 DAD定量檢測波長的選擇

鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的DAD特征檢測波長由結(jié)構(gòu)式中共同的吲哚母核(苯并吡咯結(jié)構(gòu))產(chǎn)生(見圖1),而取代基的不同使兩者的最大特征吸收波長不同,分別為308 nm和290 nm,羥基和亞砜取代基的存在使得鵝膏毒肽類的最大特征吸收波長比鬼筆毒肽類高18 nm。本文在308 nm和290 nm波長下分別定量檢測鵝膏毒肽和鬼筆毒肽,標準溶液的DAD色譜圖見圖2,鵝膏毒肽和鬼筆毒肽在各自的最大吸收波長下表現(xiàn)出更高的響應(yīng)值;同時,對于出峰最早的β-鵝膏毒肽,在308 nm的檢測波長下,抗干擾能力比在290 nm波長下強,能夠保證定量檢測的準確性。

圖 2 蘑菇毒素標準溶液在290 nm和308 nm波長下的LC-DAD色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the mushroom toxins in standard solutions analyzed by LC-DAD at 290 nm and 308 nm1. β-amanitin; 2. α-amanitin; 3. phallacidin; 4. γ-amanitin; 5. phalloidin.

2.3 色譜條件的優(yōu)化

基于DAD檢測的液相色譜方法需要被測物與干擾物、樣品基質(zhì)完全分離。多肽類蘑菇毒素多采用C18柱在酸性流動相條件下分離,為得到最佳的分離效果,文獻[5]采用規(guī)格為250 mm×4.6 mm(5 μm)的色譜柱,分析時間通常需要30～60 min。本文嘗試采用規(guī)格為150 mm×3.0 mm(2.5 μm)的色譜柱進行分離，并采用堿性流動相分離野生菌中的多肽類蘑菇毒素,考察不同體積分數(shù)(0.020%、0.025%、0.030%和0.035%)的氨水對5種蘑菇毒素分離效果的影響。結(jié)果表明,當氨水的體積分數(shù)高于0.025%時,5種蘑菇毒素能在15 min內(nèi)達到基線分離?？紤]到氨水的揮發(fā)性與堿性,本文采用0.030%(v/v)的氨水作為流動相中的水相,此時流動相的pH值為10.7。XBridgeTMBEH C18色譜柱的容許pH范圍為1～12,完全能承受本文所選擇的流動相條件。

2.4 堿性條件下質(zhì)譜檢測

文獻[14,15]報道在酸性流動相條件下,多肽類蘑菇毒素的質(zhì)譜檢測存在[M+Na]+峰,會導致[M+H]+峰的比例降低,從而影響檢測的靈敏度。本文在多肽類蘑菇毒素的檢測中同樣發(fā)現(xiàn)了[M+Na]+和[M+K]+峰(見圖3),相對于[M+H]+峰,[M+Na]+峰的m/z增加了22,[M+K]+峰的m/z增加了38。對比分析流動相中pH值為5.0和10.7時各蘑菇毒素母離子的全掃描質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)在弱酸性(pH 5.0)條件下,α-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽存在強[M+Na]+峰(m/z941.35和m/z925.35),使得[M+H]+峰(m/z919.35和m/z903.35)的響應(yīng)強度極弱。而在本文所選擇的弱堿性(pH 10.7)條件下,這兩種物質(zhì)[M+H]+峰的響應(yīng)強度得到極大增強,其他3種組分的[M+H]+峰也有所改善。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

蘑菇毒素作為劇毒物質(zhì),發(fā)生急性中毒時需要以最快的速度進行定性和定量檢測,所以此類物質(zhì)不宜采用固相萃取等前處理時間較長的凈化方法。而野生菌中蘑菇毒素的含量分布較寬,采用二極管陣列檢測器和串聯(lián)質(zhì)譜檢測時,前者易受基質(zhì)的影響產(chǎn)生干擾峰,后者易產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)，從而影響定量分析。

本文將單個樣品的前處理時間控制在20～30 min內(nèi),并通過下列措施減少因基質(zhì)產(chǎn)生的定量不準確的問題:1)參考文獻[16]的報道,將樣品稀釋20倍以降低質(zhì)譜檢測的基質(zhì)效應(yīng),此時DAD檢測的線性上限可達500 mg/kg,使方法的線性范圍滿足野生菌中多肽類蘑菇毒素含量范圍大的要求;2)閥切換在線去除易干擾質(zhì)譜離子化效率的水溶性基質(zhì),如鹽、蛋白質(zhì)、糖類和氨基酸等;3)將β-鵝膏毒肽的保留時間控制在5 min之后,以盡可能地降低DAD檢測時的基質(zhì)干擾;4)通過堿性色譜洗脫條件改善[M+H]+峰的離子化效率。

圖 3 在pH 5.0和pH 10.7的流動相條件下5種多肽類蘑菇毒素的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of the five polypeptide mushroom toxins under pH 5.0 and pH 10.7 of mobile phases

本文考察了空白樣品提取液添加0.1 mg/kg標準物質(zhì)時的基質(zhì)效應(yīng)(見圖4)。采用pH 5.0的流動相分離時,α-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽的質(zhì)譜檢測存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng);采用pH 10.7的流動相分離時,質(zhì)譜檢測的基質(zhì)效應(yīng)能控制在15%以內(nèi)。且樣品采用二極管陣列檢測器檢測時基本未見干擾峰(見圖2)。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性范圍和檢出限

5種蘑菇毒素采用二極管陣列檢測器檢測時,在2～500 mg/kg范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9985～0.9998;采用MS/MS檢測時,5種蘑菇毒素在0.05～2 mg/kg范圍內(nèi)線性良好,r為0.9961～0.9997(見表2)。目標化合物經(jīng)色譜分離后先經(jīng)過DAD檢測,再進入MS/MS檢測,含量低于2 mg/kg的可以采用質(zhì)譜定量,高于2 mg/kg的采用DAD定量。以定性離子3倍信噪比對應(yīng)的含量為檢出限,其中二羥鬼筆毒肽的檢出限為0.005 mg/kg,其他4種蘑菇毒素的檢出限均為0.02 mg/kg。

表 2 5種多肽類蘑菇毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖 4 不同流動相條件下5種多肽類蘑菇毒素的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)Fig. 4 Matrix effects of the five polypeptide mushroom toxins under different pH values of mobile phase (n=6)

2.6.2 回收率和精密度

采用MS/MS和DAD檢測時,分別在空白野生菌樣品中添加0.05、0.2、2 mg/kg和5、20、200 mg/kg的混合標準物質(zhì),每個水平做6個平行試驗,考察方法的準確度(回收率)和精密度,結(jié)果見表3和表4。其中,MS/MS檢測時,空白野生菌樣品的加標回收率為72.4%～111.8%,相對標準偏差(RSD)為4.8%～10.2%; DAD檢測時，空白野生菌樣品的加標回收率為77.1%～117.5%, RSD為5.0%～10.6%。

2.7 實際樣品測定

采集杭州及周邊地區(qū)的86份野生菌,包括鵝膏菌、褐鱗傘、牛肝菌、環(huán)柄菇、白乳菇等,只有1份白鵝膏菌和1份小褐鱗傘(Lepiotabrunneo-incarnata)檢出了多肽類蘑菇毒素,結(jié)果見表5。小褐鱗傘中只檢測出γ-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和α-鵝膏毒肽,含量分別為0.203 mg/kg(MS/MS)、54.3 mg/kg(DAD)和148 mg/kg(DAD);白鵝膏菌中同時檢出3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽,含量范圍為0.142～47.9 mg/kg。陽性高濃度毒素可以通過DAD直接定量,而低濃度毒素則通過MS/MS測定。建立的在線LC-DAD-MS/MS法能實現(xiàn)寬含量范圍的蘑菇毒素的定量檢測。LC-MS/MS檢測陽性白鵝膏菌中多肽類蘑菇毒素的色譜圖見圖5。

表 3 MS/MS檢測5種多肽類蘑菇毒素在3個加標水平下的回收率和相對標準偏差(n=6)

表 5 實際樣品中多肽類蘑菇毒素的檢測結(jié)果

ND: not detected; a: dilution folds.

圖 5 LC-MS/MS檢測陽性白鵝膏菌中多肽類蘑菇毒素的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of the polypeptide mushroom toxins in a positive Amanita sample by LC-MS/MS Peaks 1-5 were the same as in Fig. 2.

3 結(jié)論

本研究建立了在線LC-DAD-MS/MS檢測野生菌中鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的分析方法。該方法適用于不同含量的多肽類蘑菇毒素的定性、定量檢測,也適用于野生菌中毒事件中相關(guān)毒素的快速篩選和確證。

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Science Research Foundation Program of Zhejiang Provincial Medicine and Health (No. 2015DTA006).

Determination of amanitins and phallotoxins in wild mushrooms by online liquid chromatography-diode array detector-tandem mass spectrometry

XU Xiaomin*, ZHANG Jingshun, CAI Zengxuan, ZHANG Jing,HUANG Baifen, XU Jiaojiao, CHEN Qing

(ZhejiangProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310051,China)

A fast and wide linear range method was established for the determination of mushroom toxins amanitins (α-amanitin,β-amanitin andγ-amanitin) and phallotoxins (phallacidin and phalloidin) in wild mushrooms by online liquid chromatography-diode array detector-tandem mass spectrometry (LC-DAD-MS/MS). The mushroom toxins were extracted with methanol, and diluted with water. The extracts were separated on an XBridgeTMBEH C18column (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm) under pH 10.7, measured by DAD and then analyzed by MS/MS. Basic mobile phase conditions were applied to improve the ionization efficiency of hydrogen ion adducts. The baseline separation of the analytes was obtained within 15 min. The limits of detection (LODs) of the sample matrix were 0.005-0.02 mg/kg. The toxins were quantified by the results measured by MS/MS when the toxin contents less than 2 mg/kg, and quantified by the results obtained from DAD when the contents more than 2 mg/kg. The linear range was 0.05-500 mg/kg for the whole method in one injection. The method was successfully applied to the analyses of amanitins and phallotoxins inLepiotabrunneoincarnataand whiteAmanita.

online liquid chromatography-diode array detector-tandem mass spectrometry (LC-DAD-MS/MS); wide linear range quantification; mushroom toxins; amanitins; phallotoxins; wild mushrooms

10.3724/SP.J.1123.2017.02008

2017-02-09

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2015DTA006).

O658

A

1000-8713(2017)06-0613-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0571)87115265,E-mail:chemxuxm@163.com.