鞏丹丹, 董嘉俊, 孫國祥*, 張 晶, 張玉靜, 孫萬陽

(1. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 暨南大學(xué)藥學(xué)院, 中藥及天然藥物研究所, 廣州 廣東 510632)

研究論文

用高效液相色譜組方指紋圖譜智能預(yù)測中藥質(zhì)量的新模式

鞏丹丹1, 董嘉俊1, 孫國祥1*, 張 晶1, 張玉靜1, 孫萬陽2

(1. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 暨南大學(xué)藥學(xué)院, 中藥及天然藥物研究所, 廣州 廣東 510632)

建立大黃、黃芩、黃連的高效液相色譜(HPLC)組方指紋圖譜,確定其融合模型,觀察組方融合指紋圖譜(CSF)與一清片復(fù)方樣品指紋圖譜的一致性,從而以CSF代替復(fù)方整體來智能預(yù)測復(fù)方制劑質(zhì)量。用二極管陣列檢測器(DAD)同時測定黃芩、大黃、黃連和一清片在268 nm波長下的HPLC指紋圖譜,并使用系統(tǒng)指紋定量法進(jìn)行定性、定量評價。結(jié)果CSF涵蓋各單味藥主要色譜峰信息,即CSF共有峰(55個)涵蓋一清片樣品共有峰(50個)的主要指紋圖譜信息。15批樣品的質(zhì)量除YQT-S01為5級外,其他質(zhì)量均為3級及以上。各組合模式CSF質(zhì)量除CSF-2為6級外,其余均為2級或1級。該文探討了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和中藥組方融合指紋圖譜的相關(guān)性,可以與相應(yīng)的計(jì)算機(jī)評價軟件相結(jié)合,通過組方融合指紋圖譜所代表復(fù)方制劑的整體指紋圖譜來實(shí)現(xiàn)智能預(yù)測中藥成方制劑質(zhì)量的新模式。

高效液相色譜;組方融合指紋圖譜;智能預(yù)測;中藥質(zhì)量控制

黃芩(scutellariae radix, SR)為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根;大黃(rhei radix et rhizoma, RRR)為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.exBalf.)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根和根莖;黃連(coptidis rhizoma, CR)為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖,黃芩、大黃和黃連均具有清熱燥濕,瀉火解毒的功效,用于治療濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、目赤、口瘡等疾病[1]。黃芩中含黃酮類成分黃芩素、黃芩苷和漢黃芩苷等;大黃中含蒽醌類成分大黃酚、大黃素、大黃素甲醚等;黃連中含異喹啉類生物堿成分鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀等,目前大量文獻(xiàn)[2-6]報道其中藥飲片及其復(fù)雜成分的抗炎、抗腫瘤等活性,是中醫(yī)臨床上廣泛的大宗藥材,它們是三黃瀉心湯[7]及一清片[8]復(fù)方藥的配伍成分。

一清片(Yi Qing Tablet, YQT)是由黃芩、大黃、黃連3味中藥按處方量0.273 2∶0.546 4∶0.180 3(質(zhì)量比)組方,采用現(xiàn)代制劑工藝進(jìn)行提取得浸膏制粒壓片而成,有清熱瀉火解毒之功效,用于火毒血熱所致的身熱煩躁、目赤口瘡、咽炎、扁桃體炎、牙齦炎等[9]。

中藥作為中華民族的瑰寶,迫切需要實(shí)現(xiàn)國際化和現(xiàn)代化[10]。中藥現(xiàn)代化研究的重要任務(wù)之一是建立一整套客觀有效的整體質(zhì)量控制方法用來對中藥材的炮制、加工以及中成藥的生產(chǎn)進(jìn)行規(guī)范[11]。中藥組方是以中醫(yī)理論為原則,根據(jù)一定的配伍規(guī)律將具有不同性能和功效的藥物有機(jī)結(jié)合的過程,用于病癥的綜合治療,多種成分的質(zhì)量協(xié)同作用于成方制劑的質(zhì)量,其質(zhì)量控制應(yīng)該采用多成分協(xié)同質(zhì)量控制模式[12]。中藥指紋圖譜是對中藥化學(xué)信息運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)以圖形的方式進(jìn)行表征,將質(zhì)量控制指標(biāo)圖形化、信息化,是質(zhì)量控制的一雙“眼睛”,指紋圖譜信息的綜合結(jié)果能夠成為中藥自身的“化學(xué)條形碼”[13,14]。中藥組方指紋圖譜可以從整體上定性定量反應(yīng)中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)情況[12]。當(dāng)前要實(shí)現(xiàn)對中藥質(zhì)量進(jìn)行客觀有效評價,除必須對中藥成分物質(zhì)群運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行表達(dá)外,還需要開展指紋圖譜與組方藥效的相關(guān)性研究[15,16]。戚進(jìn)等[17]在中藥質(zhì)量評價新模式——“譜效整合指紋譜”研究進(jìn)展中指出,現(xiàn)階段的譜效整合指紋譜主要是“譜”的整合而未發(fā)揮“效”的整合。所以需要建立一種能夠通過中藥組方成分的指紋圖譜預(yù)測藥效的質(zhì)量評價新模式。趙渤年等[18]提出運(yùn)用數(shù)學(xué)模型結(jié)合抑菌率進(jìn)行中藥質(zhì)量評價譜-效相關(guān)模式,但是抑菌試驗(yàn)可變因素大且僅應(yīng)用于單一指標(biāo)評價,對于復(fù)方制劑的質(zhì)量研究有待于深入。本實(shí)驗(yàn)通過得到的黃芩、大黃、黃連3味藥材HPLC指紋譜的8種組合形式進(jìn)行組方融合,得到組方融合指紋圖譜。組方融合指紋圖譜的形成類似于組方工藝過程,將實(shí)際組方過程反映在智能軟件中,將得到的各單味藥指紋圖譜通過選定的閾值按照處方比例融合,得到一張組方融合指紋圖譜(CSF,復(fù)方的預(yù)測模式指紋圖譜)。對組方指紋圖譜代表的復(fù)方制劑質(zhì)量,通過采用宏定性和宏定量相似度評價直接預(yù)測產(chǎn)品質(zhì)量,因此基于單味藥的性味特征所體現(xiàn)的化學(xué)指紋圖譜來初步建立譜-效預(yù)測指紋模式,對提高復(fù)方制劑質(zhì)量,穩(wěn)定其臨床療效及安全合理用藥具有重要意義。

孫國祥等[19,20]建立的系統(tǒng)指紋定量法(SQFM)能從物質(zhì)整體宏觀定性角度和整體定量角度對中藥進(jìn)行全方位立體量化控制,是中藥整體質(zhì)量控制的科學(xué)方法。將雙定性相似度(綜合定性相似度SF與比率定性相似度SF′)均值Sm稱為宏定性相似度,見式(1)。SF和SF′兩種定性性質(zhì)用來整體檢測化學(xué)指紋數(shù)量和分布比例。將雙定量相似度(綜合投影含量相似度C與定量相似度P)均值Pm稱為宏定量相似度,見式(2)。C和P兩種定量性質(zhì)能夠?qū)瘜W(xué)指紋整體含量進(jìn)行檢測。指紋信號均化系數(shù)γ可清楚反映化學(xué)指紋信號分布的均化程度,γ與1越接近,各指紋信號大小越趨相等。以γy為比較標(biāo)準(zhǔn),定義樣品的γx相對偏差α為指紋均化性變動系數(shù),揭示樣品與對照指紋譜的差異,樣品的γx越趨近于對照指紋圖譜的γy,則樣品與對照指紋圖譜相似度越高,見式(3)。結(jié)合Sm、Pm和α來鑒定中藥質(zhì)量的方法稱為SQFM,據(jù)此將中藥質(zhì)量劃分為8級,列于表1中。最終質(zhì)量級別決定于Sm、Pm和α中級別最低的參數(shù),如Sm=0.99(1級),Pm=87.25%(3級),α=0.024(1級),則質(zhì)量等級為3級;如Sm=0.658(6級),Pm=92.4%(2級),α=0.081(2級)則質(zhì)量等級為6級。公式(1～3)中,n為指紋峰數(shù),xi與yi為各指紋峰積分面積。

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表 1 系統(tǒng)指紋定量法鑒定中藥質(zhì)量級別

Sm: macro qualitative similarity;Pm: macro quantitative similarity;α: relative deviation of leveling coefficient.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀,配在線脫氣裝置、四元低壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器(DAD)、ChemStation工作站(美國Agilent公司); Sarturius-BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司); KDM型控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);循環(huán)水式多用真空泵(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52(上海亞榮生化儀器廠); KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)、乙腈(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)、無水乙醇(色譜純,天津市康科德科技有限公司)、磷酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。水為去離子水,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。樣品為15批市售一清片(YQT-S01～YQT-S15,規(guī)格為片重0.5 g,遼寧康博士制藥有限公司)。黃芩產(chǎn)自山東沂蒙;大黃產(chǎn)自甘肅禮縣;黃連產(chǎn)自湖北竹溪縣。

1.2 供試品溶液的制備

1.2.1 一清片供試品溶液

取5片一清片,去薄膜衣,研碎,稱取約2 g。加25 mL甲醇,回流提取1 h,漏斗濾過;殘?jiān)?5 mL甲醇,繼續(xù)回流提取30 min,過濾;合并兩次濾液,加甲醇定容至50 mL,搖勻,進(jìn)樣前用0.45 μm的微孔濾膜過濾,作為一清片供試品溶液。

1.2.2 一清片對照樣品供試溶液

取同批次的大黃、黃芩和黃連按照處方比例及輔料成分混合壓片制得一清片片劑,按1.2.1節(jié)方法得到一清片對照樣品供試溶液。

1.2.3 單味藥供試品溶液

將黃芩、大黃、黃連藥材機(jī)械粉碎,過60目篩,分別精密稱取2.5 g置于圓底燒瓶中,按1.2.1節(jié)提取方法制備各單味藥供試品溶液,搖勻即得標(biāo)示量約為50 g/L的單味藥供試品溶液,重復(fù)試驗(yàn)一次。

1.3 色譜條件

色譜柱為Arcus EP-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為5 μL;檢測波長為268 nm。流動相A為體積分?jǐn)?shù)為0.2%的磷酸(含30 mol/L磷酸二氫鈉),流動相B為乙腈-無水乙醇-水(820∶100∶77.6, v/v/v,含體積分?jǐn)?shù)為0.24%的磷酸),流速為1.0 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?0～5 min, 2%B～10%B; 5～13 min, 10%B～15%B; 13～26 min, 15%B～17%B; 26～38 min, 17%B～22%B; 38～54 min, 22%B～36%B; 54～60 min, 36%B～60%B; 60～80 min, 60%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

取5 μL YQT-S01供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,在268 nm波長處獲得54個共有指紋峰。分別在制備樣品后的0、3、6、9、12、15、18 h進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖穩(wěn)定性。平行制備6份S01樣品供試液進(jìn)行檢測,測定方法重復(fù)性。以30號峰黃芩苷為參照物峰,計(jì)算得相對保留時間的RSD不超過1.0%,相對峰面積的RSD不大于3.0%,結(jié)果表明儀器精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合中國藥典2015版[21]的要求。

2.2 組方融合指紋圖譜的建立

2.2.1 組方模型的創(chuàng)建

將1.2.3節(jié)制備的各單味藥供試品溶液分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。3種藥材的單波長組方指紋譜分別記為大黃一次試驗(yàn)供試液指紋圖譜(RRR1)、大黃二次試驗(yàn)供試液指紋圖譜(RRR4),黃芩一次試驗(yàn)供試液指紋圖譜(SR2)、黃芩二次試驗(yàn)供試液指紋圖譜(SR5)和黃連一次試驗(yàn)供試液指紋圖譜(CR3)、黃連二次試驗(yàn)供試液指紋圖譜(CR6)。用1～6代表得到的大黃、黃芩和黃連的指紋圖譜,分別與RRR1、SR2、CR3、RRR4、SR5、CR6對應(yīng)。對大黃、黃芩、黃連單味藥的指紋譜進(jìn)行組方,設(shè)定各組合模式坐標(biāo)為1:(1, 2, 3); 2:(1, 2, 6); 3:(1, 5, 3); 4:(1, 5, 6); 5:(4, 2, 3); 6:(4, 2, 6); 7:(4, 5, 3); 8:(4, 5, 6)。導(dǎo)入Origin 8.5,得圖1。按峰面積不低于20確定各單味藥的HPLC指紋峰數(shù),結(jié)果顯示,在268 nm波長下各單味藥的指紋峰數(shù)為:黃芩32、大黃46、黃連20。

圖 3 268 nm波長下3個單味藥指紋圖譜和其組方融合指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of the three Chinese herba medicines and their CSF at 268 nm CSF: compound synthesizing fingerprints.

圖 1 268 nm波長下3味中藥材的指紋圖譜組合模式Fig. 1 Fingerprints combination forms of the three Chinese herba medicines at 268 nm CR: coptidis rhizoma; RRR: rhei radix et rhizoma; SR: scutellariae radix.

圖 2 漂移時間窗對融合譜的影響Fig. 2 Effects of the shift time windows on the fusion fingerprintsm: effective number of peaks; n: total number of peaks.

2.2.2 漂移時間窗的確定

將各單味藥材積分信號*.cdf文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件,生成飄移時間窗0.1～1 min的融合指紋譜,得到對應(yīng)時間窗下的有效峰數(shù)(m)、總峰數(shù)(n)、Sm和Pm值(見圖2)。漂移時間窗為0.2 min時,m/n值較大,具有較高的匹配率,能夠在去除雜質(zhì)峰影響下保留有效峰信息;Sm和Pm值較大且相差較小,能夠整體檢測化學(xué)指紋數(shù)量和整體含量。按飄移時間窗0.2 min和處方量比例SR∶RRR∶CR=0.273 2∶0.546 4∶0.180 3(質(zhì)量比)進(jìn)行智能組方融合,結(jié)果顯示,組方融合指紋圖譜有55個峰(見圖3)。組方融合指紋圖譜峰涵蓋了各單味藥的主要色譜峰信息,是各單味藥化學(xué)成分的綜合表征,能夠整體代表由各單味藥配伍而成的復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量評價。

2.3 組方融合指紋圖譜與復(fù)方制劑指紋圖譜之間的相關(guān)性

按1.2.2節(jié)制備一清片對照樣品供試溶液,按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定,得到一清片對照樣品指紋圖譜(R),按峰出現(xiàn)率100%計(jì),確定樣品HPLC共有峰數(shù),與2.2.2節(jié)得到的組方融合指紋圖譜進(jìn)行比較,結(jié)果見圖4。3種單味藥的組方融合指紋圖譜共有峰(55個)涵蓋了一清片樣品指紋圖譜共有峰(50個)的主要譜圖信息,且色譜峰保留時間基本一致,即組方融合指紋圖譜與復(fù)方制劑指紋圖譜相關(guān)性良好,能夠代表樣品用于宏定性和宏定量相似度評價直接預(yù)測復(fù)方制劑質(zhì)量。

表 2 系統(tǒng)指紋定量法評價樣品及組方融合譜的結(jié)果

圖 4 (a)組方融合指紋圖譜與(b)一清片對照樣品指紋圖譜Fig. 4 (a) CSF and (b) the fingerprint of Yi Qing Tablet (YQT) reference sample

2.4 各組合模式組方融合指紋圖譜的建立及其對照指紋譜

以0.2 min的融合時間窗對8種組合模式進(jìn)行智能組方融合,得到各組方融合指紋圖譜CSF-1～CSF-8,以均值法生成對照指紋譜(RFP)(見圖5),各組合模式組方融合指紋圖譜之間并無明顯差異。

圖 5 268 nm波長下各組合模式組方融合指紋圖譜及其對照指紋圖譜Fig. 5 CSFs of all combination forms and the reference fingerprint (RFP) at 268 nm

2.5 SQFM評價一清片及復(fù)方預(yù)測模式指紋圖譜質(zhì)量

分別檢測15批一清片供試液,記錄268 nm波長下的色譜圖。按峰出現(xiàn)率100%計(jì),確定54個共有峰。將譜圖積分結(jié)果的*.AIA文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件,按平均值法生成準(zhǔn)對照指紋圖譜,計(jì)算Sm和Pm。用SPSS 16.0軟件以Sm和Pm為變量對15批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見圖6。YQT-S01為第一類,YQT-S02～YQT-S15為第二類。選擇第二類樣品,重新計(jì)算生成RFP(見圖7)。以此RFP為評價標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算15批樣品的Sm、Pm及α,并按表1標(biāo)準(zhǔn)劃分質(zhì)量級別(見表2),鑒別出YQT-S01為5級,其他均為3級或以上級別。以268 nm下一清片標(biāo)準(zhǔn)制劑的RFP為評價標(biāo)準(zhǔn),用SQFM計(jì)算2.4節(jié)復(fù)方預(yù)測模式指紋圖譜CSF-1～CSF-8的Sm、Pm及α,根據(jù)表1鑒定其質(zhì)量(見表2)。除CSF-2質(zhì)量為一般外,其余均為2級或1級,連續(xù)進(jìn)樣所獲得的各組方融合模式之間質(zhì)量無明顯差異。

圖 6 15批一清片宏定性和宏定量相似度聚類譜系圖Fig. 6 Hierarchical clustering analysis figure of 15 batches of YQT samples by macro qualitative and quantitative similarities 1-15: YQT-S01 to YQT-S15.

圖 7 15批一清片樣品指紋圖譜及組方融合指紋譜Fig. 7 Fingerprints of 15 batches of YQT samples and the compound synthesizing fingerprints

3 結(jié)論

組方融合指紋圖譜將各單味藥材主要指紋峰信號在同一譜圖中得到體現(xiàn),與制劑工藝中通過兩種或多種藥材按藥效比例配伍成方使藥材所含藥效成分共同發(fā)揮作用達(dá)到治療目的類似,組方融合指紋圖譜的譜量關(guān)系代表療效。由于復(fù)雜制劑工藝影響以及中藥組方藥效及化學(xué)成分的非加和性,復(fù)方樣品指紋圖譜中一些峰信號缺失或峰值減小代表有效成分含量降低,但只要主成分峰得以保留,仍能在一定程度上反映其處方成分的指紋峰特征。運(yùn)用SQFM,通過組方融合指紋圖譜的整體面貌(出峰時間、峰位、峰數(shù)以及峰面積等信息)對樣品質(zhì)量及融合預(yù)測指紋圖譜模式進(jìn)行定性定量評價,可知各預(yù)測模式指紋譜之間以及與復(fù)方制劑標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜間質(zhì)量有無明顯差異,結(jié)果預(yù)測模式指紋譜接近真實(shí)譜。單味藥成分的質(zhì)量決定成方制劑的質(zhì)量,質(zhì)量合格的藥材配伍成方后與成方質(zhì)量具有一致性,通過“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”建立的初步譜-效預(yù)測指紋模式,能夠?qū)崿F(xiàn)制劑生產(chǎn)前質(zhì)量預(yù)測評估,在藥品生產(chǎn)前及時規(guī)避低質(zhì)量藥材,調(diào)整處方含量,優(yōu)化中藥組方制劑工藝,達(dá)到配伍藥效的最優(yōu)化,提高產(chǎn)品質(zhì)量,減少不合格產(chǎn)品的生產(chǎn)與銷售,實(shí)現(xiàn)安全合理用藥。當(dāng)前中醫(yī)藥的國際化迫切需要研究可靠的質(zhì)量評價體系,開發(fā)智能預(yù)測中藥質(zhì)量的軟件有利于中醫(yī)藥領(lǐng)域的創(chuàng)新和穩(wěn)定發(fā)展。

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National Natural Science Foundation of Personnel Training Funds (No. J1103606).

A novel pattern for predicting the quality of Chinese herba preparation intelligently by high performance liquid chromatographic formula fingerprints

GONG Dandan1, DONG Jiajun1, SUN Guoxiang1*,ZHANG Jing1, ZHANG Yujing1, SUN Wanyang2

(1.CollegeofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.InstituteofTraditionalChineseMedicine&NaturalProducts,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

In order to build the fusion models, the high performance liquid chromatographic (HPLC) fingerprints of scutellariae radix (SR), rhei radix et rhizoma (RRR), coptidis rhizoma (CR) and their synthesizing fingerprints were developed in this study. After exploring the consistency between the fingerprints of compound synthesizing fingerprints (CSF) and the sample, the quality of traditional Chinese medicine preparation was predicted intelligently using CSF. HPLC coupled with diode array detector was used to obtain chromatograms of SR, RRR, CR and Yi Qing Tablet (YQT) samples at 268 nm. Meanwhile, the quality of CSF and the 15 batches of YQT samples was evaluated by systematically quantified fingerprint method (SQFM) qualitatively and quantitatively. The chromatograms showed that CSF covered the main fingerprints’ information of each herb and the 55 common peaks of CSF covered the main information of the 50 common peaks in YQT sample. The evaluation results showed that among the 15 batches of YQT samples, only YQT-S01 was grade 5 and the others were all above grade 3. Most of the CSFs were grade 2 or grade 1 except CSF-2 which was grade 6. The fingerprints of Chinese herba preparation could be replaced by CSF to achieve a novel pattern for predicting the quality of TCM preparation intelligently by studying the relationship between the standard fingerprints and the CSF, and simultaneously developing first-class evaluation software.

high performance liquid chromatographic (HPLC); compound synthesizing fingerprints (CSF); intelligent prediction; quality control of traditional Chinese medicine (TCM)

10.3724/SP.J.1123.2016.12041

2016-12-27

國家自然科學(xué)基金人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目(J1103606).

O658

A

1000-8713(2017)06-0643-07

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:gxswmwys@163.com.