鄧欣鑫 張瑤瑤 虞麗娜 朱霞琳 薛曉婷 趙 瑩

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

HPLC法測(cè)定通脈止渴膠囊中葛根素含量*

鄧欣鑫 張瑤瑤 虞麗娜 朱霞琳 薛曉婷 趙 瑩*

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

目的 建立HPLC法測(cè)定通脈止渴膠囊中葛根素的含量。方法 采用Synergi4u Hydro-RP80A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇—0.1%磷酸溶液(25∶75)為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫25 ℃。結(jié)果 HPLC法測(cè)定：葛根素溶液在0.0369～0.5529 μg/ml之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=1)；葛根素平均回收率(n=6)，分別為100.06%、100.04%、99.1%、99.4%、99.4%、100.08%，RSD為0.89%。結(jié)論 通過HPLC對(duì)葛根素含量測(cè)定的結(jié)果表明，所檢樣品符合規(guī)定。應(yīng)用上述色譜法方便且準(zhǔn)確，適用于通脈止渴膠囊中葛根素的含量測(cè)定與質(zhì)量評(píng)價(jià)。

葛根素；HPLC法；通脈止渴膠囊

通脈止渴膠囊為處方藥，處方中有十四味藥材，葛根素為方中君藥，制劑中含量較高。經(jīng)文獻(xiàn)及藥典檢索，葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等作用[1]。中醫(yī)臨床可用于治療外感發(fā)熱頭痛，項(xiàng)背強(qiáng)痛，口渴，消渴，麻疹不透，熱疾，泄瀉，眩暈頭痛，中風(fēng)偏癱，胸壁心痛，酒毒傷中[2]。葛根具有有效的HPLC指標(biāo)控制成分及方法且常作為中成藥物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC法測(cè)定葛根素含量，以利產(chǎn)品質(zhì)量控制和臨床用藥的安全有效。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(型號(hào)：島津LC-20AT SPD-20AT，生產(chǎn)廠家：日本島津)；電子分析天平(型號(hào)：XS205DU，梅特勒-托利多(上海)；紫外可見分光光度計(jì)(型號(hào)：島津UV-2700，生產(chǎn)廠家：日本島津)；數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)：KQ-300DE型，生產(chǎn)廠家：昆山市超聲儀器有限公司)；臺(tái)式電熱干燥箱(型號(hào)：202-00AB型，生產(chǎn)廠家：天津市泰斯特儀器有限公司)；純水儀(生產(chǎn)廠家：MILLIPORE)。

1.2 試劑 葛根素(批號(hào)：110752-201313，含量：95.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定院)；水：超純水(自制)；甲醇：色譜純 (默克)分析純(國(guó)藥集團(tuán))；磷酸(國(guó)藥集團(tuán))；通脈止渴膠囊(某市中醫(yī)醫(yī)院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備[3]

2.1.1 供試品溶液 取膠囊內(nèi)容物，研細(xì)后，精密稱取1 g置具塞錐形瓶中，加入50 ml的70%甲醇溶液，密塞并稱其重量，超聲0.5 h后放置至室溫，加70%甲醇適量補(bǔ)至原來重量，搖勻后過濾，精密量取3ml續(xù)濾液，置10ml容量瓶中，再加70%甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取葛根素對(duì)照品適量，加入甲醇制成36.86 μg/ml的溶液，既得。

2.2 色譜條件[4-5]色譜柱：Synergi4u Hydro-RP80A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

按照上述方法，對(duì)樣品及葛根素對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，樣品中葛根素峰分離度較好，色譜見圖1。

圖1 通脈止渴膠囊色譜(a為樣品，b為對(duì)照品)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 流動(dòng)相的篩選 由于本品是由葛根、當(dāng)歸、川穹、地龍、蜈蚣、黃芪等十四味中藥構(gòu)成的復(fù)方制劑，流動(dòng)相考察實(shí)驗(yàn)以方中葛根的質(zhì)控成分葛根素為對(duì)象進(jìn)行優(yōu)化。參照藥典[6]及相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]以葛根素分離度、保留時(shí)間、對(duì)稱因子、理論塔板數(shù)等進(jìn)行篩選。其中序號(hào)1為甲醇∶水=25∶75；序號(hào)2為甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75。結(jié)果見表1。

表1 流動(dòng)相考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：序號(hào)1出峰時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較久，且峰拖尾較嚴(yán)重，序號(hào)2的出峰時(shí)間快，分離度較好，主峰無拖尾現(xiàn)象，可以滿足檢測(cè)要求，因此選擇甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75為流動(dòng)相，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行研究。

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取葛根對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜保留時(shí)間的相同位置上，有相應(yīng)色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中無相應(yīng)色譜峰。說明處方中其他藥味對(duì)其含量測(cè)定并無干擾。

2.3.3 耐用性試驗(yàn) 按照上述所定流動(dòng)相為基礎(chǔ)，將測(cè)定條件進(jìn)行少許變動(dòng)，再對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。對(duì)主要變動(dòng)的色譜條件包括檢測(cè)波長(zhǎng)及不同色譜柱進(jìn)行了考察，以含量為依據(jù)，考察耐用性。結(jié)果見表2-3。

表2 耐用性-不同波長(zhǎng)考察

表3 耐用性-不同色譜柱考察

結(jié)果表明：采用測(cè)定條件微小波動(dòng)后的參數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下和色譜柱條件下測(cè)定結(jié)果RSD分別為：0.0955，0.0186。表明本方法耐用性良好。

2.3.4 線性范圍考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5 ml、1 ml、2.5 ml、5 ml、7.5 ml，均用甲醇稀釋至50 ml。分別量取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(A)對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量(M，μg)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：y=3918x+9956.5,相關(guān)系數(shù)R=0.99538，結(jié)果表明葛根素溶液在0.0369～0.5529 μg之間呈良好的線性。結(jié)果見圖2。

圖2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 儀器精密度試驗(yàn) 精密量取4項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算儀器精密度，RSD=0.0015。試驗(yàn)結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.3.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于3、4、5、6、7、8小時(shí)，精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，RSD=0.1755，表明供試品溶液在8 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足測(cè)定需要，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 方法重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：150415)，平行取6份。按照上述擬定的葛根素含量測(cè)定方法，制備供試品溶液。精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算葛根素的含量。結(jié)果表明，此方法測(cè)定本品中葛根素的含量，RSD=0.8289%<2%，含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考察

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，平行取6份樣品，約0.5 g，精密稱定后，置錐形瓶中，精密加入葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml、70%甲醇45 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)0.5 h，放至室溫，加70%甲醇補(bǔ)至原來重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3 ml于10 ml容量瓶中，加入70%甲醇溶液定容至刻度，即得供試品溶液。取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定18.43 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。取4項(xiàng)下對(duì)照品溶液即得(36.86 μl/ml)。精密量取上述溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表5。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

表5結(jié)果顯示：RSD=0.89%，表明此方法測(cè)定本品中葛根素的含量，加樣回收率良好。

2.3.9 樣品測(cè)定 方法學(xué)考察結(jié)果提示：該測(cè)定方法可以作為本品的含量測(cè)定方法，準(zhǔn)確可行，且操作簡(jiǎn)便。連續(xù)6批本品按供試品溶液方法制備樣品溶液，分別精密量取樣品溶液10 μl，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算葛根素的含量。結(jié)果見表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明：藥材的質(zhì)量、生產(chǎn)條件等因素一致的條件下，樣品的質(zhì)量穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)條件下，對(duì)照品及樣品中組分均能達(dá)到基線分離，其分離度大于1.5，并且峰型良好。用70%的甲醇溶液做為提取溶劑，以甲醇—0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫25 ℃。建立的HPLC法測(cè)定通脈止渴膠囊中葛根素含量的方法，經(jīng)方法學(xué)考察，達(dá)到藥物檢測(cè)要求。所以應(yīng)用上述方法，具有簡(jiǎn)便，更為準(zhǔn)確高效的特點(diǎn)，適用于中藥處方通脈止渴膠囊中葛根素的含量測(cè)定與質(zhì)量評(píng)價(jià)。

[1] 潘麗麗,江帆.高效液相色譜法測(cè)定保健食品葛枳膠囊中葛根素的含量[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào),2012,30(2):71.

[2] 趙永良,王 超,韓亞朋.中藥現(xiàn)代化研究關(guān)鍵問題與前景[J].中醫(yī)中藥,2011,9(4):124.

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[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010版.一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:272.

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HPLC method for content determination of puerarin from Pueraria lobata (wild) ohwi. of Tongmaizhike capsule

DENG Xin-xin ZHANG Yao-yao YU Li-na ZHU Xia-lin XUE Xiao-ting ZHAO Ying*

(Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Objective：To establish a HPLC method for content determination of puerarin from Pueraria lobata (wild) ohwi. of Tongmaizhike capsule. Methods：HPLC method was adopted to measure the contents of puerarin in Tongmaizhike capsule. A gilent Synergi4u Hydro-RP80AC18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm) was used. The mobile phase was methanol-1% phosphate (25∶75) with a flow rate of 1.0 ml/min, the UV detection wavelength was 250 nm and the column temperature was 25 ℃. Results: HPLC method for determination: The linear ranges of puerarin solution were 0.0369～0.5529μg/ml, the average recoveries (n=6) of puerarin were 100.06%,100.04%, 99.1%, 99.4%, 99.4% and 100.08%. RSD was 0.89%. Conclusion: The results show that the testing samples in accordance with the regulations and the applications of the chromatographic method are convenient and accurate, and suitable for the contents determination and quality evaluation of puerarin in Tongmaizhike capsule.

Puerarin; HPLC; Tongmaizhike capsule

泰山醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510439084)。

鄧欣鑫(1993—)，女，山東濰坊人，泰山醫(yī)學(xué)院在讀本科。

趙瑩，女，講師，主要從事藥物化學(xué)教學(xué)和研究工作。

R927

A

1004-7115(2017)05-0537-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.05.021

2016-12-17)