韓 坤，鄭亞萍

漯河醫(yī)學高等?？茖W校生理教研室(河南 漯河 462002)

百令膠囊影響糖尿病腎病大鼠Caveolin-1蛋白表達機制探討

韓 坤，鄭亞萍

漯河醫(yī)學高等?？茖W校生理教研室(河南 漯河 462002)

目的 探討百令膠囊影響糖尿病腎病大鼠Caveolin-1蛋白表達機制。方法 30只SD大鼠，隨機分為對照組(n=10) 、模型組(n=20)，模型組給予高脂飲食，喂養(yǎng)8周后，模型組大鼠應用鏈脲佐菌素(STZ)按40 mg/kg腹腔注射，對照組給予等體積枸櫞酸鈉；72 h測定兩組大鼠隨機血糖、體質(zhì)量及24 h尿蛋白定量，將成模的 16只大鼠隨機平分成2組：糖尿病腎病模型對照組(DN組，n=8)、百令膠囊組(n=8)，DN組及正常對照組均給予等量蒸餾水灌胃，百令膠囊組給予百令膠囊(2.5 g/kg·d-1)灌胃，4周后測定各實驗組大鼠血糖、24 h尿蛋白定量及Caveolin-1蛋白表達量。結(jié)果 DN組Caveolin-1蛋白表達量較對照組升高了(112.8±2.76)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而百令膠囊組較對照組升高了(61.2±4.31)%，較DN組下降了(51.6±3.48)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 百令膠囊可能通過調(diào)節(jié)Caveolin-1蛋白表達發(fā)揮對糖尿病腎病腎臟損傷的保護作用。

糖尿病腎病;一氧化氮合酶;百令膠囊; Caveoline-1

在中國，糖尿病患病率呈逐年上升趨勢[1]，隨著醫(yī)療技術的不斷提高，糖尿病的急性并發(fā)癥死亡率大大下降，但糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)做為糖尿病的慢性并發(fā)癥，其發(fā)生率卻明顯增高，并嚴重影響患者的生活質(zhì)量，其發(fā)病機制復雜，遺傳、代謝、血流動力學等多種因素參與其中。其中，一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases, eNOS)調(diào)控血管通透性以及緊張度[2]，對糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。Caveolin-1是一種整合膜蛋白, 可溶性Caveolin-1主要存在于胞漿、線粒體以及分泌小泡。Caveolin-1多種存在形式的特性提示了它生物功能的多樣性，在多條細胞傳導信號中起重要作用[3]。eNOS對一氧化氮(NO)的調(diào)控主要通過結(jié)合Caveolin-1的CSD區(qū)域，并受其直接調(diào)節(jié)從而起負調(diào)控作用[4]。Caveolin-1 在DN中的報道較少。臨床上百令膠囊在DN的治療中效果明顯，本實驗主要研究Caveolin-1在DN中的作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物 30只成年SD大鼠(2月齡，體質(zhì)量180～250 g)雄性，SPF級，由河南省實驗動物中心提供(許可證號：SCXK豫2015-0011，合格證號：0008146)。于本實驗室動物房分籠飼養(yǎng)，室溫18～25 ℃，濕度40%～60%,白/夜12 h，自由飲食水。

1.2 主要儀器及試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國sigma 公司，百令膠囊購自杭州中美華東制藥有限公司，血糖測定儀購自強生公司，尿微量白蛋白測定試劑盒購自北京北方生物技術研究所。兔Caveolin-1受體-抗購自美國Cell Signaling公司；小鼠Beta-actin單克隆抗體購自美國sigma公司，Blottinggradegoat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自美國Bio-Rad公司，Blottinggrade Affinity Purifiedgoat Anti-Mouse IgG(H+L) 購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組和動物模型制作：30只SD大鼠，給予普通飼料喂養(yǎng) 1 周，隨機分為對照組(n=10) 、模型組(n=20)，對照組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后，禁食12 h，模型組大鼠應用STZ按40 mg/kg單次腹腔注射(STZ溶解在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，配制成pH4.5液體使用)，對照組給予等體積0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射；觀察72 h，接下來連續(xù)3 d測定兩組大鼠隨機血糖、體質(zhì)量，留取24 h 尿液測定尿量，并檢測24 h尿蛋白定量，隨機血糖≥16.7 mmol/L；24 h尿量>原尿量150%；尿蛋白排泄>30 mg/24 h，則提示2型糖尿病腎病模型造模成功。模型組共有16只大鼠造模成功。

1.3.2 將造模成功的16只糖尿病腎病大鼠隨機平分成2組：糖尿病腎病模型對照組(DN組，n=8)、百令膠囊組(n=8)，DN組及正常對照組均給予等量蒸餾水灌胃，百令膠囊組給予百令膠囊(2.5 g/kg·d-1)灌胃，4周后測定各實驗組大鼠血糖及24 h尿蛋白定量，然后處死各組大鼠，取腎臟組織并提取蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法(western-blot)檢測Caveolin-1蛋白在各組中的表達量。

2 結(jié)果

2.1 造模后兩組基本數(shù)據(jù)比較 造模后，模型組大鼠體質(zhì)量較前下降，隨機血糖、24 h尿量、24 h尿蛋白均顯著升高(P<0.05)，模型構(gòu)建成功，見表1。

表1 造模后兩組基本數(shù)據(jù)比較±s)

注：VS對照組，*：P<0.05

2.2 對照組、DN組、百令膠囊組血糖和24 h尿蛋白定量比較 與對照組比較，DN組、百令膠囊組隨機血糖、24 h尿蛋白量均明顯增加(P<0.05)；較DN組，百令膠囊組隨機血糖無明顯差異，24 h尿蛋白量下降有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 對照組、DN組、百令膠囊組血糖、24h尿蛋白定量比較

注：VS對照組，*P<0.05；VS DN組，▲P<0.05

2.3 對照組、DN組、百令膠囊組Caveolin-1蛋白表達量變化 DN組Caveolin-1蛋白表達量較對照組升高了(112.8±2.76)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而百令膠囊組較對照組升高了(61.2±4.31)%，較DN組下降了(51.6±3.48)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：VS對照組，*P<0.05；VS DN組，▲P<0.05 圖1 對照組、DN組、百令膠囊組Caveolin-1蛋白表達量變化

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的常見慢性并發(fā)癥之一，隨著病情進展，多數(shù)患者會出現(xiàn)蛋白尿，嚴重時會因為腎衰竭而危及患者生命。

eNOS調(diào)控血管通透性以及緊張度[5]，在糖尿病腎病中的發(fā)生發(fā)展中有重大意義[6]。 它對NO的調(diào)控主要通過結(jié)合Caveolin-1的CSD區(qū)域，并受其直接調(diào)節(jié)從而起負調(diào)控作用。Caveolin-1的CSD可以和eNOS結(jié)合抑制NOS活性[7]； Akt誘導的eNOS磷酸化或者Ca2+/calmodulin的提高[8]可以使該抑制作用被阻斷。在敲除Caveolin-1基因小鼠的研究表明，導致乙酰膽堿誘導性的血管舒張功能隨著NOS的基礎水平提高而加強，血管收縮功能因?qū)Ζ?-腎上腺素的反應而降低[9]，血管通透性隨之增加，而eNOS的抑制劑L-NAME則可以發(fā)揮相反的作用。在Drab和Razanil的研究中，利用Caveolin-1基因敲除的小鼠[10]，通過離體大動脈血管收縮緊張度測量，發(fā)現(xiàn)在Caveolin-1的缺乏時，eNOS活性水平及血管彈性均降低，這一現(xiàn)象在動脈血管也已經(jīng)被證實。該項研究進一步表明Caveolin-1在NO信號通路中發(fā)揮重要作用。因此，Caveolin-1可能在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本實驗研究結(jié)果表明：DN組Caveolin-1蛋白表達量較對照組升高了(112.8±2.76)%，差異有統(tǒng)計學意義，提示Caveolin-1參與糖尿病腎病發(fā)病，與上述Caveolin-1可能在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的結(jié)論基本符合。在本實驗中，DN組Caveolin-1蛋白表達量較對照組升高，糖尿病腎病作為一種常見的糖尿病微小血管并發(fā)癥，其引起的糖尿病血管病變，可能與其誘導血管內(nèi)皮細胞上Caveolin-1的表達有關[11]。多項研究證實，Caveolin-1改善缺血部位的血液供應可能通過激活 Akt 信號通路，從而調(diào)節(jié)Akt/NO的生成而介導血管生成，本實驗中DN組Caveolin-1蛋白表達量的升高提示在該過程中Caveolin-1發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，與以往的研究中Caveolin-1多發(fā)揮負性調(diào)控作用的結(jié)論不一致，考慮Caveolin-1參與眾多的信號傳導途徑，其負性調(diào)控作用并非在所有的信號轉(zhuǎn)導途徑適用[12]，同時，Caveolin-1 在血管形成中的具體功能本身仍存在爭議，有研究推測在高血糖狀況下，Caveolin-1的促進缺血組織中的血管形成的作用只有在Caveolin-1表達水平達到一定程度才能發(fā)揮，其詳細機制仍有待進一步研究[13]。

在糖尿病腎病的治療過程中，控制尿蛋白和降糖要同時進行[14]。百令膠囊是采用生物工程方法分離的冬蟲夏草菌種經(jīng)低溫發(fā)酵精心研制而成的純中藥制劑，臨床研究提示百令膠囊在抑制腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化、延緩慢性腎衰竭進展等多種腎臟疾病的治療中起重要作用[15]，但是有關百令膠囊在DN治療中的詳細作用機制有待進一步研究。

本實驗在糖尿病腎病大鼠成功造模的基礎上，觀察百令膠囊對DN大鼠血糖、蛋白尿的影響及Caveolin-1蛋白表達量的變化。研究結(jié)果表明：百令膠囊組較DN組隨機血糖無明顯差異，24 h尿蛋白量下降有統(tǒng)計學意義，Caveolin-1蛋白表達量百令膠囊組較對照組升高了(61.2±4.31)%，較DN組下降了(51.6±3.48)%，差異均有統(tǒng)計學意義，表明百令膠囊降低尿蛋白、改善腎功能有可能通過對Caveolin-1蛋白表達量的調(diào)控發(fā)揮作用。

綜上，本研究提示百令膠囊可能通過調(diào)節(jié)Caveolin-1蛋白表達，從而對DN腎臟損傷起到一定的保護性作用，為臨床治療DN提供出新的理論依據(jù)，其治療DN的具體機制及Caveolin-1蛋白在其他信號轉(zhuǎn)導的作用尚有待于進一步研究。

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責任編輯：牟冬生

Effect of Bailing Capsule on Caveolin -1 Protein Expression of Diabetic Nephropathy Rats

Han Kun，Zheng Yaping

(TheDepartmentofPhysiology，LuoheMedicalColloge,Luohe462002,China)

Objective To investigate the effect of Bailing capsule on caveolin-1 protein expression of diabetic nephropathy rats. Methods 30 SD rats were randomly divided into control group (n=10) and model group (n=20).The model group was injected Streptozotocin (40 mg/kg) into abdominal cavity after 8 weeks'high-fat diet and the control group was given same dosage of sodium citrate. After 72 hours, the random blood glucose, weight and 24-hour urine protein were detected. The 16 model rats were randomly divided into diabetic nephropathy group(DN group, n=8)and Bailing capsule group(n=8). The DN group and control group were given the same amount of distilled water, and the bailing capsule group was given Bailing Capsule (2.5 g/kg·d-1). After 4 weeks, the random blood glucose, 24-hour urine protein and Caveolin-1 protein expression were observed. Results Compared with the control group, the Caveolin-1 protein expression of the DN group was up by (112.8±2.76) % and that of the Bailing capsule group was up by (61.2±4.31) %. Compared with the DN group, the Caveolin-1 protein expression of the Bailing capsule group decreased by 51.6±3.48%.The difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion The Bailing capsule may protect the renal injury of diabetic nephropathy by adjusting the Caveolin-1 protein expression.

diabetic nephropathy;endothelial nitric oxide synthases;bailing capsule;caveolin-1

韓坤，男，碩士，講師，主要研究方向：神經(jīng)生理和內(nèi)分泌學。

R285

A

1008-8164(2017)02-0021-03

2017-03-31