黃興琳，陸俊杏，廖冰楠，白輝揚(yáng)，管麗，張濤

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

油用牡丹脂肪酸脫氫酶基因FAD3的克隆與表達(dá)分析

黃興琳，陸俊杏，廖冰楠，白輝揚(yáng)，管麗，張濤

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

【目的】ω-3脂肪酸脫氫酶(ω-3 FAD)為植物脂肪酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，通過對(duì)油用牡丹‘鳳丹’ω-3 FAD基因結(jié)構(gòu)特征及其在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為研究FAD3在油用牡丹‘鳳丹’脂肪酸形成過程中的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肦ACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹‘鳳丹’ω-3 FAD基因，用Vector NTI Advance 11軟件進(jìn)行序列分析，BLAST進(jìn)行同源性比較，并用MEGA7.0的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用在線蛋白質(zhì)分析工具ExPASy預(yù)測(cè)FAD3蛋白的基本參數(shù)和特性，利用Phyre2預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)該基因在油用牡丹‘鳳丹’不同發(fā)育期的種子以及不同組織中的特異性表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】獲得油用牡丹‘鳳丹’脂肪酸脫氫酶FAD3，命名為FAD3（GenBank登錄號(hào)：KX906966）。序列分析表明該基因cDNA序列全長(zhǎng)1 723 bp，其中，開放閱讀框1 308 bp，編碼435個(gè)氨基酸，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)287 bp，5′末端非編碼區(qū)長(zhǎng)99 bp，預(yù)測(cè)成熟蛋白分子量為49.9 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為7.42，N端無(wú)信號(hào)肽，脂肪系數(shù)為83.08，不穩(wěn)定指數(shù)35.67，總水平親水性為-0.222。經(jīng)FAD3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，F(xiàn)AD3以α-螺旋、隨機(jī)卷曲為主，其次是延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角含量較少；多序列比對(duì)結(jié)果表明，油用牡丹FAD3氨基酸序列含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示‘鳳丹’與芍藥處于同一分支，其親緣關(guān)系最近。TMHMM和TargetP亞細(xì)胞定位分析得知，F(xiàn)AD3蛋白有3個(gè)跨膜區(qū)域，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮功能。組織特異性結(jié)果分析表明，F(xiàn)AD3在‘鳳丹’的根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊、種子中均有表達(dá)，其中，在葉中表達(dá)量最高，雌蕊次之，在雄蕊中表達(dá)量最低；不同時(shí)期種子中，10 d表達(dá)量最高，20 d次之，在60 d中表達(dá)量最低?！窘Y(jié)論】成功從油用牡丹‘鳳丹’中克隆獲得FAD3全長(zhǎng)cDNA序列，其在‘鳳丹’不同組織中呈現(xiàn)出多種表達(dá)模式。

油用牡丹；脂肪酸脫氫酶；克?。粚?shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】α-亞麻酸（ALA，C18:3）屬ω-3系列不飽和脂肪酸，為人類必需脂肪酸，是DHA和EPA的合成前體，具有促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防神經(jīng)和心腦血管疾病、降低血脂和抑制衰老等重要作用，對(duì)人體正常發(fā)育和生長(zhǎng)代謝起著至關(guān)重要的作用[1-3]。但人體由于缺乏ω-3脂肪酸脫氫酶，不能使亞油酸轉(zhuǎn)化為ALA，所以必須依靠食物來(lái)獲取[4-6]。目前，ALA的來(lái)源主要是深海魚油，但中國(guó)深海魚油資源較為貧乏，而日常食用菜籽油、豆油、葵花油等植物油雖然含有較為豐富的亞油酸，但ALA的含量卻很低（5%左右）。在正常飲食情況下，人體往往不能足量攝入所需的ALA，致使中國(guó)人群膳食中普遍缺乏ALA，因此，挖掘和開發(fā)富含ALA的植物資源具有重要的應(yīng)用價(jià)值[7-8]。牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）屬芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹種（Sect.Moutan DC.），是一種聞名世界的多年生開花植物，在中國(guó)已有超過3 000年的栽培歷史。油用牡丹是產(chǎn)籽量和出油率較高（≥22%）的牡丹統(tǒng)稱，近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)牡丹籽油不飽和脂肪酸含量達(dá)92%左右，特別是ALA含量高達(dá)40%以上，它除了具有獨(dú)特的觀賞和藥用價(jià)值外，還是一種經(jīng)濟(jì)效益較高的新興木本油料作物[9-11]?！习摺≒aeonia rockii）和‘鳳丹’（Paeonia ostii）牡丹是目前作為油料作物栽培的主要油用牡丹品種，它們不僅耐寒抗旱、適應(yīng)力強(qiáng)，而且株型高大、結(jié)實(shí)率好，主要分布于安徽銅陵、山東菏澤、四川、甘肅、陜西秦嶺、河南洛陽(yáng)等地[12-14]。分離克隆控制ALA合成積累的關(guān)鍵酶基因，深入研究油用牡丹種子高效合成積累ALA的分子機(jī)理，可為油用牡丹種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物脂肪酸合成代謝過程中，油脂合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平對(duì)合成脂肪酸的類型及數(shù)量起重要的作用。植物ALA由ω-3脂肪酸脫氫酶（FAD3、FAD7、FAD8）催化亞油酸而來(lái)，該酶是不飽和脂肪酸合成途徑的一個(gè)限速酶，通過調(diào)節(jié)該酶的過量表達(dá)，可以使植物中ALA的含量增加。植物中一般存在 2種 ω-3 FAD，一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（FAD3），另一種在質(zhì)體中（FAD7、FAD8），植物種子中的ALA主要是通過ω-3 FAD3催化合成[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥種子中過表達(dá)ω-3 FAD3基因，可使ALA含量從19%增加到39.6%[16]。在大豆種子中的異位表達(dá)擬南芥ω-3 FAD3基因可使ALA含量獲得提高[17-18]。將芝麻 FAD7質(zhì)體定位信號(hào)序列替換為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)，將其導(dǎo)入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草種子中ALA含量達(dá)4.78%—6.77%[19]。將紫蘇ω-3 FAD3基因?qū)脶劸平湍窱NVSc1中，發(fā)現(xiàn)工程菌可以將底物亞油酸轉(zhuǎn)化為 ALA，其含量占總脂肪酸的 4%左右[20]。MURAKAMI等[21]使煙草中ω-3 FAD基因沉默，導(dǎo)致突變株的ALA含量比野生型植株明顯減少，并能更好地適應(yīng)高溫環(huán)境。ZHOU等[22]發(fā)現(xiàn)ω-3 FAD基因的過量表達(dá)可顯著提高白楊的抗冷性。以上研究結(jié)果表明，ω-3 FAD基因不但能夠提高植物ALA的含量，而且還可改良植物對(duì)溫度等逆境脅迫的適應(yīng)性。近年來(lái)，人們陸續(xù)克隆了一些植物的微粒體或質(zhì)體ω-3 FAD基因，并應(yīng)用于基因工程研究，該方向已成為植物脂肪酸代謝積累調(diào)控和遺傳改良研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】油用牡丹作為目前發(fā)現(xiàn)的ALA含量最高的木本油料植物資源之一，是具有較好應(yīng)用前景的油脂工程研究對(duì)象，但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)油用牡丹的研究主要側(cè)重于其栽培技術(shù)、成分分析、藥理及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)等方面，而對(duì)油用牡丹的分子生物學(xué)研究相對(duì)較少，尤其是對(duì)ALA高效合成關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能等決定其優(yōu)異品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)缺乏相應(yīng)的研究，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于油用牡丹脂肪酸脫氫酶基因的分子作用機(jī)制等鮮有報(bào)道[10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在對(duì)油用牡丹‘鳳丹’FAD3基因進(jìn)行克隆與生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同組織中FAD3進(jìn)行表達(dá)分析，為進(jìn)一步開展FAD3在不飽和脂肪酸生物合成過程中的調(diào)控作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

油用牡丹品種‘鳳丹’（Paeonia ostii）種植于重慶師范大學(xué)牡丹試驗(yàn)基地。試驗(yàn)于2016年3月至2016 年6月在重慶師范大學(xué)油用牡丹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。分別在開花時(shí)取材根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊；授粉后以每10 d為間隔，分別取材10、20、40、60和80 d的牡丹種子，經(jīng)液氮速凍后-80℃保存，備用。

工程菌Escherichia coli DH5α為細(xì)胞與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。Premix Taq酶、T4DNA連接酶、DL2000 Marker、T/A克隆載體pGEM-T、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司。EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（DNaseⅠ）購(gòu)于北京博邁德公司。熒光定量試劑盒購(gòu)于成都百樂公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)和基因克隆

從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢獲得2條芍藥EST序列信息，GenBank登錄號(hào)分別為GBFN01008505.1和 KM575841.1。據(jù)此采用軟件Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)5′端和3′端RACE引物，上游引物PsFAD-GSP1.1：5′-GCTGCTGCCAATCCAAACACCACA-3′和PsFADGSP2.1：5′-CTCCATTAAAGCCACCACCGCCATC-3′；下游引物PsFAD-NGSP1.1：5′-CCTCACCAACCCCAT TAGTGGCATCT-3′和PsFAD-NGSP2.1：5′-GGGTTG GTGAGGAAGACGATTTTGAC-3′。按照試劑盒使用說(shuō)明提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用設(shè)計(jì)的引物，以上述cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，回收，連接克隆載體pGEM-T，然后轉(zhuǎn)化DH5α，進(jìn)行抗性篩選，PCR鑒定后挑選單克隆送測(cè)序。引物及測(cè)序均由英濰捷基有限公司完成。

1.3 FAD3組織特異性表達(dá)分析

根據(jù)已克隆的油用牡丹‘鳳丹’FAD3的cDNA序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)熒光定量 PCR引物，分別以根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊、不同時(shí)期種子的cDNA為模板，以 PUF1639（Protein of unknown function 1639 gene）為內(nèi)參基因[23]，反應(yīng)所用引物為PUF1639Forward：5′-AAACGAGTCGGTTGAAGA TGAG-3′，PUF1639Reverse：5′-TATGCGGTGGATTT CGGAG-3′。FAD3Forward：5′-TTGCTGAGATCCGAG CTGCCATTC-3′，F(xiàn)AD3Reverse：5′-GCAGCCCAATA GAATGGCCAAACAAC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FAD3在不同器官中的表達(dá)水平。RT-PCR依照SYBR? Premix Ex TaqTM II（TaKaRa公司）使用說(shuō)明在儀器CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad公司）上進(jìn)行。每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，結(jié)果用于平均數(shù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

1.4 FAD3生物信息學(xué)分析

用Vector NTI Advance 11軟件進(jìn)行序列比對(duì)、查找開放閱讀框和翻譯，ExPASy在線服務(wù)器分析FAD3蛋白的分子量、等電點(diǎn)pI、疏水性等。SignalP4.1 server分析信號(hào)肽，TMHMM Server v.2.0分析跨膜區(qū)等。利用 Phyre2在線分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域，并構(gòu)建FAD3蛋白的三維結(jié)構(gòu)。利用MEGA7.0軟件采用鄰接法對(duì)同源蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 FAD3全長(zhǎng)cDNA的克隆

分別通過RACE法，以油用牡丹葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T/A克隆和測(cè)序分析，獲得5′末端序列長(zhǎng)度約700 bp（圖1-A），獲得3′末端序列長(zhǎng)度約1 300 bp（圖1-B）。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)測(cè)大小一致。測(cè)序獲得兩末端片段后通過NCBI上BLAST比對(duì)分析確定起始密碼子AT的位置，即FAD3的5′端，3′端存在明顯的poly（A）加尾現(xiàn)象。Vector NTI Advance 11軟件分析后進(jìn)行電子拼接，成功從油用牡丹中克隆到全長(zhǎng)FAD3（GenBank登錄號(hào)為 KX906966），發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)序列共1 723 bp，其中5′非翻譯區(qū)99 bp，3′端非翻譯區(qū)共287 bp，包含1 308 bp的完整開放閱讀框。經(jīng)BLASTn序列比對(duì)表明，克隆的FAD3與芍藥（Paeonia lactiflora）FAD3 （KM575841.1）具有97%的相似性，遠(yuǎn)高于其他物種的基因。

圖1 FAD3的RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 The product of PCR amplification of FAD3 gene by RACE

2.2 FAD3蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量及二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

FAD3編碼435個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為49.9 kD，等電點(diǎn)為 7.42，帶負(fù)電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）有 40個(gè)，帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）有 40個(gè)，該蛋白脂肪系數(shù)為83.08%，不穩(wěn)定指數(shù)為35.67。分析FAD3蛋白的親疏水性發(fā)現(xiàn)，總水平親水性系數(shù)（GRAVY，grand average of hydropathicity）為-0.222，屬親水性蛋白。利用Phyre2軟件對(duì)蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)AD3蛋白主要為α-螺旋（28.51%）、隨機(jī)卷曲（37.93%）、延伸鏈（21.38%）和 β-轉(zhuǎn)角（12.18%），推測(cè)該蛋白的結(jié)構(gòu)功能域可能主要由α-螺旋構(gòu)成（圖2）。

2.3 FAD3蛋白質(zhì)的跨膜域、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

SignaIP server預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，TMHMM Server v.2.0分析具有3個(gè)跨膜域。亞細(xì)胞定位軟件WoLF PSORT預(yù)測(cè)FAD3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮功能。NetPhos2.0預(yù)測(cè)它具有18個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，主要包括10個(gè)絲氨酸（Serine）、4個(gè)蘇氨酸（Threonine）和4個(gè)酪氨酸（Tyrosine）。由此推測(cè)FAD3蛋白活性可能與其磷酸化調(diào)控有一定聯(lián)系。利用 NCBI在線分析工具CDD分析保守結(jié)構(gòu)域（CD），結(jié)果表明，F(xiàn)AD3屬于 Membrane-FADS-like蛋白超家族（圖3）。

2.4 FAD3蛋白質(zhì)與其他植物蛋白的進(jìn)化分析

圖2 Phyre2預(yù)測(cè)的FAD3三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 2 FAD3 tertiary structure predicted by Phyre2

從NCBI中查找到10種植物的FAD3蛋白序列，采用MEGA7.0鄰接法與油用牡丹FAD3蛋白序列對(duì)比并建立無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，油用牡丹‘鳳丹’與芍藥（Paeonia lactiflora，AJA36814.1）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas，NP_001295746.1）、煙草（Nicotiana tabacum，NP_001313206.1）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii，NP_001296282.1）、大豆（Glycine max，NP_001239777.1） 、 葡 萄 （ Vitis vinifera，XP_002277573.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，AAL32546.1）、甘藍(lán)（Brassica oleracea var. Oleracea，XP_013620518.1）、巨桉（Eucalyptus grandis，XP_010031203.1）、芝麻（Sesamum indicum，NP_001306619.1）等10個(gè)高等植物的FAD3蛋白序列比對(duì)顯示，11個(gè)植物FAD3氨基酸序列被聚為兩大類，‘鳳丹’與芍藥處于同一分支，其親緣關(guān)系最近，其序列一致性為98.0%，其次與麻風(fēng)樹、煙草、雷蒙德氏棉蛋白親緣關(guān)系較近，一致性分別為70.0%、73.0%和75.0%；與大豆、葡萄、擬南芥、甘藍(lán)、巨桉、芝麻等物種的FAD3蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4），推測(cè)‘鳳丹’FAD3的功能可能與芍藥屬FAD3功能相似。

2.5 FAD3實(shí)時(shí)熒光定量分析

實(shí)時(shí)熒光定量分析表明（圖 5），從其組織特異性表達(dá)來(lái)看，‘鳳丹’FAD3在不同器官中均有表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高，與其他組織的差異達(dá)到極顯著，是雌蕊中表達(dá)的3—4倍，且是根、莖的17—25倍，約是雄蕊的250倍。在不同發(fā)育時(shí)期的種子中，表達(dá)量隨著種子成熟逐漸呈下調(diào)趨勢(shì)，其中10 d的表達(dá)最高，約為60 d的25倍；20 d次之，40 d以后表達(dá)量明顯降低（圖6）。

圖3 FAD3保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Prediction of FAD3 conserved domain

圖4 ‘鳳丹’FAD3與其他植物FAD3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of FAD3 proteins from Paeonia ostii and other plants

圖5 FAD3在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 The relative expression of FAD3 gene in different tissues

圖6 FAD3在不同時(shí)期種子中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 The relative expression of FAD3 gene in seeds of different growth stages

3 討論

本研究以油用牡丹‘鳳丹’為研究對(duì)象，在已知芍藥FAD3部分片段的基礎(chǔ)上進(jìn)行RACE擴(kuò)增，克隆獲得‘鳳丹’FAD3的全長(zhǎng)cDNA序列，通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，所得目的片段與同屬植物芍藥相似性極高。‘鳳丹’FAD3編碼的蛋白質(zhì)具有植物ω-3脂肪酸脫氫酶的一般特征：在蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，主要以 α-螺旋和隨機(jī)卷曲為主，推測(cè)其三維空間結(jié)構(gòu)可能由 α-螺旋形成中心軸盤繞成螺旋狀的結(jié)構(gòu)，這表明跨膜蛋白FAD3的α-螺旋能夠與生物膜表面發(fā)生相互作用，這種互作可能在蛋白跨膜過程中發(fā)揮重要作用[24-26]。序列比較分析表明，牡丹‘鳳丹’FAD3同芍藥、麻風(fēng)樹、煙草、雷蒙德氏棉等10種高等植物的FAD3氨基酸序列同源性高達(dá)70%以上，11種植物都具有 FAD3的 1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，同屬M(fèi)embrane-FADS-like蛋白超家族，表明該結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中的穩(wěn)定性較高，這可能與其在生長(zhǎng)代謝中所具有的功能相關(guān)[27]。油用牡丹‘鳳丹’FAD3氨基酸序列進(jìn)化分析表明，‘鳳丹’FAD3與芍藥聚為一類，這說(shuō)明同科同屬相似性高的基因可能在脂肪酸合成中發(fā)揮相似的功能[28]。通過 TMHMM Server v.2.0跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和WoLF PSORT亞細(xì)胞定位分析得知，牡丹‘鳳丹’FAD3蛋白具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮功能，SignaIP server預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽。

研究發(fā)現(xiàn)，紅花ω-3脂肪酸脫氫酶基因CtFAD3在根、莖、葉、花、葉柄及種子中均能表達(dá)，且在花中的表達(dá)量最高,其次是葉片[29]。紫蘇 FAD3在紫蘇根、莖、葉、花、種子中均有表達(dá),但表達(dá)量存在明顯差異,其中在種子中的表達(dá)量最高，遠(yuǎn)高于其他組織器官，分別是花、葉、莖和根中表達(dá)量的8倍、9倍、43倍和58倍[30]。而本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD3在‘鳳丹’的7個(gè)組織器官中均能檢測(cè)到表達(dá)（圖5和圖6），但其特異性差異較顯著，其中FAD3在牡丹的葉片中表達(dá)量最高，雄蕊中表達(dá)最低，前者約為雄蕊的250倍；葉片的相對(duì)表達(dá)約為10 d幼種的14倍；在不同發(fā)育時(shí)期的種子中都有表達(dá)，結(jié)實(shí)期10 d幼種的表達(dá)積累達(dá)到峰值，是成熟期種子（60和80 d）的25倍左右；20 d種子的表達(dá)是成熟期種子（60和80 d）的15倍左右。該結(jié)果與紫蘇中有所不同，可能在牡丹種子不飽和脂肪酸形成過程中還存在其他基因的共同作用。結(jié)合LI等[10]研究來(lái)看，表明授粉后種子中不飽和脂肪酸脫氫酶迅速積累，此時(shí)正為亞油酸脫氫形成亞麻酸做準(zhǔn)備；隨著種子逐漸成熟，F(xiàn)AD3表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，而亞麻酸含量隨之增加，在此過程中該基因的去飽和作用在峰值后慢慢變小，可能FAD3的活性與底物亞油酸含量的變化相關(guān)，說(shuō)明本研究克隆得到的FAD3可能在牡丹不飽和脂肪酸合成途徑中發(fā)揮重要作用[31]。

通過對(duì)FAD3在油用牡丹‘鳳丹’中的組織特異性表達(dá)分析，表明FAD3在油用牡丹‘鳳丹’不飽和脂肪酸的積累過程中發(fā)揮重要作用，為研究脂肪酸生物合成的分子機(jī)理及利用基因工程手段來(lái)調(diào)控α-亞麻酸含量提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

成功從油用牡丹‘鳳丹’中克隆獲得FAD3全長(zhǎng)cDNA序列，其在不同組織中呈現(xiàn)出多種表達(dá)模式。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Fatty Acid Desaturase Gene FAD3 from Oil Peony

HUANG XingLin, LU JunXing, LIAO BingNan, BAI HuiYang, GUAN Li, ZHANG Tao
(College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331)

【Objective】 The Omega -3 fatty acid desaturase (ω-3 FAD) is a key enzyme in the fatty acid biosynthesis pathway of plant. Through analysis of omega-3 fatty acid desaturase gene structure and its expression in different tissues from Paeonia ostii, this study will lay a foundation for the research of regulating effects of FAD3 gene on fatty acid biosynthesis and provide a theoretical basis for the formation in the process of regulation. 【Method】 The FAD gene from Paeonia ostii (FAD3) was cloned using RT-PCR and RACE-PCR strategies. Nucleotide sequence was analyzed using Vector NTI Advance 11 software. Homology was analyzed using BLAST. A phylogenetic tree was constructed using neighbor-joining of MEGA 7.0. The secondary structure and three-dimensional model of FAD3 were predicted using ExPASy and Phyre2, respectively. Expression profiles of FAD3 at different developmental stages and in different tissues of the P. ostii were assayed using real-time quantitative PCR. 【Result】 The FAD genein P. ostii was cloned and named as FAD3 (GenBank accession number: KX906966). The full length of FAD3 cDNA is 1 723 bp, contains a 1 308 bp open reading frame (ORF) encoding a putative protein of 435 amino acids with a molecular mass of 49.9 kD and an isoelectric point (pI) of 7.42. The 3′-untranslated region of 287 bp and 5′-untranslated region of 99 bp were obtained from the FAD3 gene of P. ostii. N end without signal peptide, fat coefficient is 83.08, instability index 35.67, the grand average of hydrophobicity value of -0.222. By FAD3 protein secondary structure prediction, FAD3 mainly in the alpha helix and random coil, followed by less extended strand, beta turn content; multiple sequence alignment results showed that it contains two conserved domains of FAD3 gene. Phylogenetic tree analysis showed that the P. ostii has the closest evolutionary relationship with P. lactiflora. Subcellular localization analysis of TMHMM and Target P indicated that it might be targeted to the endoplasmic reticulum with three transmembrane regions. FAD3 gene was expressed in the root, stem, leaf, petal, pistil, stamen and seed of P. ostii by the tissue-specificity expression. The expressive content of FAD3 gene in different tissues of P. ostii was different: The highest was leaf, the next was pistil, and the lowest level was in stamen; In different periods of seeds, the highest expression was seeds of 10d, the next was 20d, in 60d expression was the lowest. 【Conclusion】 The full length cDNA sequence of FAD3 gene was successfully cloned from P. ostii, It shows a variety of expression patterns in different tissues, which laid a foundation for the further study on the function and expression regulation mechanism of FAD3 gene in the process of unsaturated fatty acid biosynthesis.

Paeonia suffruticosa Andr.; fatty acid desaturase; cloning; real-time PCR

2016-10-27；接受日期：2017-01-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（31171588）、重慶市林業(yè)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（渝林科研2015-3）、重慶市社會(huì)民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2016shmszx80051）、重慶師范大學(xué)基金（14XLB015）

聯(lián)系方式：黃興琳，Tel：18716439877；E-mail：huangxlcf@163.com。通信作者張濤，Tel：15902359879；E-mail：zht2188@126.com