李慧園，田春育，鄭玉瑩，武濤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030）

黃瓜耐鎘相關(guān)基因CsNAC019的克隆及表達(dá)分析

李慧園，田春育，鄭玉瑩，武濤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030）

【目的】研究黃瓜耐鎘（Cd）分子機制，結(jié)合生物信息學(xué)分析獲得一個 NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因CsNAC019，對其進行克隆和表達(dá)分析，為進一步將該基因用于黃瓜耐Cd品種的改良與選育提供試驗基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^PCR技術(shù)擴增CsNAC019全長；利用NCBI和DNAMAN進行序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析；利用Expasy、TMHMM等在線軟件進行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)分析；通過 PlantCARE在線工具進行啟動子序列分析；采用MEGA 6.0軟件根據(jù)NJ方法，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；采用qRT-PCR技術(shù)檢測Cd脅迫后黃瓜CsNAC019在葉中的表達(dá)情況，并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行方差及顯著性分析?！窘Y(jié)果】CsNAC019含有典型的NAC保守結(jié)構(gòu)域。通過BLAST分析比對，該基因在氨基酸序列上與擬南芥NAC019存在60%的同源性，兩者在從N端到C端有A、B、C、D、E 5個氨基酸相對保守區(qū)的序列高度一致。該基因CDS序列全長為960 bp，編碼319個氨基酸，編碼蛋白質(zhì)分子量為35.66 kD，理論等電點為8.72，不穩(wěn)定系數(shù)為68.18，平均親水系數(shù)為-0.483。啟動子分析表明，除含有真核生物啟動子固有的TATA和CAAT 元件外，CsNAC019的啟動子序列還存在G-box、ABRE、W-box、P-box、TCA-element、TC-richrepeats、HSE等多種響應(yīng)逆境脅迫的順式元件。系統(tǒng)進化分析表明，CsNAC019與甜瓜、桃、蘋果、柑桔、葡萄、大豆等15種植物NAC轉(zhuǎn)錄因子有64%—96%的同源性，其中與甜瓜的NAC蛋白同源性最高，為96%。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與對照相比，CsNAC019在Cd脅迫條件下表達(dá)量明顯上調(diào)（8.2倍）。【結(jié)論】CsNAC019為黃瓜Cd脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因，推測其可能通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)調(diào)控黃瓜對Cd脅迫的應(yīng)答。

黃瓜；Cd；CsNAC019；基因克??；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativus L.）是中國設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的主要栽培作物之一，由于溫室大棚內(nèi)化肥、農(nóng)藥等的連年使用，黃瓜易受到重金屬的毒害，其中，鎘（Cd）污染較為嚴(yán)重。近些年，Cd污染事件頻發(fā)，例如，2009年8月在湖南瀏陽以及2012 年1月在廣西龍源出現(xiàn)的Cd污染事件等。Cd是生態(tài)系統(tǒng)中危害最大的重金屬之一[1]，具有分解周期長、移動性大、毒性高、難降解等特點，在生產(chǎn)活動中容易被作物吸收富集，不僅嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且可以通過食物鏈在人體中積累危害人體健康[2]。黃瓜對重金屬敏感、運輸效率高，是研究重金屬污染的可行材料[3]。近幾年，隨著工業(yè)進程的快速發(fā)展，Cd進入生態(tài)系統(tǒng)危害人類健康的現(xiàn)象日益嚴(yán)重[4]，直接危害人類的健康。就中國而言，受污染區(qū)域已多達(dá)11個省市的 25個地區(qū)[5]。因此，有效提高黃瓜的耐Cd能力、培育出耐Cd品種、減少Cd的危害對食品安全問題具有重大意義。此外，國家有關(guān)食品中 Cd限量指標(biāo)包括黃瓜在內(nèi)的蔬菜標(biāo)準(zhǔn)是 0.05 mg·kg-1（GB 2762—2005），因此，耐Cd黃瓜品種除了要在Cd污染環(huán)境下保持較好的生長勢和產(chǎn)量之外，還需要保證黃瓜果實內(nèi)Cd含量低于0.05 mg·kg-1，以保證食品安全?！厩叭搜芯窟M展】目前關(guān)于植物耐 Cd機制的研究表明，植物可通過區(qū)域化、固定鈍化及形成金屬硫蛋白、植物螯合肽、應(yīng)急作用、排外作用等來抵抗或減弱Cd的毒害程度[6]。WEBER等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AtPME3的過表達(dá)能夠顯著增強擬南芥對Zn、Cd離子的敏感性。BHUIYAN等[8]、SHIGAKI等[9]和ARAZI 等[10]研究發(fā)現(xiàn)ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族基因、擬南芥中的CAX、煙草中的NtCBP4等。目前已鑒定的金屬陽離子運載蛋白家族主要有CDF家族、ZIP家族、NRAMP家族、重金屬ATPases家族、ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族等[6]。此外研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子是至今發(fā)現(xiàn)的植物基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物的多個生長發(fā)育過程如種子萌發(fā)、頂端分生組織的形成、細(xì)胞次生根的合成、次生壁的合成、開花、衰老、側(cè)根形成等，還參與植物對生物以及非生物脅迫的響應(yīng)[5,11-17]。NAC轉(zhuǎn)錄因子直接參與或通過調(diào)控參與干旱、高鹽應(yīng)答基因的表達(dá)，在植物抗干旱、高鹽等非生物逆境脅迫中起重要作用。前人研究證明，水稻SNAC1、OsNAC6/SNAC2、OsNAC5、OsNAC10、OsNAC045以及擬南芥ATAF1、ANAC019、ANAC055 和ANAC072/ RD26均能夠響應(yīng)干旱、高鹽、高溫脅迫[18-20]。NAC019在番茄中同源轉(zhuǎn)錄因子為LeJA2和SlNAC019，LeJA2作為一個保衛(wèi)細(xì)胞特異定位的轉(zhuǎn)錄因子，通過直接調(diào)控脫落酸（ABA）合成相關(guān)基因的表達(dá)參與番茄的抗逆反應(yīng)[21]；而SlNAC019則作用于番茄茉莉酸信號通路中，作為一個次級轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控抗蟲和抗病相關(guān)基因的表達(dá)[22]?！颈狙芯壳腥朦c】為了研究黃瓜耐Cd脅迫分子機制，前期對擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族耐逆基因進行分析[23-26]，根據(jù)基因表達(dá)模式以及與黃瓜基因組同源比對結(jié)果，對潛在的黃瓜耐Cd相關(guān)基因進行篩選，結(jié)果表明，NAC019可能參與Cd脅迫響應(yīng)。通過同源比對得知，CsNAC019與NAC019蛋白有較高的同源性，推測CsNAC019在功能上與NAC019具有一定的相似性。雖然NAC019 等NAC轉(zhuǎn)錄因子的抗逆性研究已有報道，但是NAC轉(zhuǎn)錄因子參與 Cd等重金屬脅迫響應(yīng)的相關(guān)研究的報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對黃瓜CsNAC019進行分離，獲得該基因全長CDS序列，并闡述該基因的蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化情況及對啟動子序列進行分析，并研究其在 Cd脅迫下基因的表達(dá)情況，對CsNAC019參與Cd脅迫下的機理提出假說，為研究黃瓜耐Cd的分子機制和耐Cd的黃瓜新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設(shè)計

供試材料為黃瓜 649。大腸桿菌 DH5α菌株、pEASY-T1克隆載體、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和Taq DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購自東洋紡（TOYOBO）公司；測序由北京金唯智生物科技有限公司完成；其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

浸種催芽后，黃瓜種子于人工氣候室（晝夜溫度為26℃/18℃，光周期為16 h/8 h，平均濕度為60%—70%）中進行播種培養(yǎng)，使用全蛭石為基質(zhì)，澆灌營養(yǎng)液栽培。待其播種后5 d（子葉展平）時進行水培，用含有CdCl2（300 μmol·L-1）的營養(yǎng)液進行處理，基礎(chǔ)營養(yǎng)液配方（1.512 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O、0.257 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O、1.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O、4 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、6 mmol·L-1KNO3、8.6 μmol·L-1C10H12FeN2NaO8·3H2O、10.3 μmol·L-1MnSO4、1 μmol·L-1CuSO4·5H2O、30 μmol·L-1H3BO3、24 nmol·L-1Na6Mo7O24·4H2O和130 nmol·L-1CoCl2·6H2O）參考文獻[27]，用KCl和KNO3調(diào)整營養(yǎng)液中K+和Ca2+的平衡。在播種后12 d采摘第1片真葉，取5株長勢一致的黃瓜作為重復(fù)，液氮速凍后，存放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用Trizol法提取各部位總RNA，用分光光度計檢測吸光度及濃度；cDNA第一鏈的合成使用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作按照說明書進行。

1.3 引物設(shè)計與合成

以黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中序列號為Csa3M852470.1的基因CDS序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計克隆引物和qRT-PCR引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in the study

1.4 CsNAC019的克隆與序列分析

以649黃瓜葉片cDNA為模板，利用PCR技術(shù)進行 CsNAC019的克隆，20 μL反應(yīng)體系包括10×TaqBuffer 2 μL、dNTP Mix 2 μL、CsNAC019-F（10 μmol·L-1）和CsNAC019-R（10 μmol·L-1）各0.5 μL、TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、模板cDNA（約200 ng·μL-1）2 μL和ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件為96 ℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，28個循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行目的條帶的回收，與pEASY-T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌液鋪平板37℃培養(yǎng)過夜，挑斑，搖菌。再進行質(zhì)粒提取，酶切鑒定后送陽性樣本測序。

利用NCBI在線Blast下載不同植物中NAC蛋白序列，進行多重序列比對后導(dǎo)入 MEGA 6.0（http:// www.megasoftware.net/history.php），根據(jù)NJ方法（執(zhí)行參數(shù)：Bootstrap method 1000；Poissonmodel；Pairwise deletion）分析，進而構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用DNAMAN、DNAStar進行序列比對和分析。利用在線軟件Expasy、TMHMM等進行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等分析。

1.5 CsNAC019的啟動子序列分析

從黃瓜基因數(shù)據(jù)庫中獲取CsNAC019的啟動子區(qū)域，即開放閱讀框上游的1 500 bp，使用在線工具 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）分析啟動子區(qū)域的順式作用元件。

1.6 Cd脅迫條件下的表達(dá)分析

以300 μmol·L-1Cd處理的植株葉cDNA為模板，進行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、CsNAC019-qF（10 μmol·L-1）和CsNAC019-qR（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA（約150 ng·μL-1）1 μL和ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為96℃ 1 min；95℃ 15 s；56℃ 15 s；72℃ 45 s，45個循環(huán)，以CsEF1α作為參照基因（表1）。

采用 2-ΔΔCT相對定量分析方法計算出基因的相對表達(dá)量，并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的獲得

通過對前期擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族耐逆基因進行分析，根據(jù)基因表達(dá)模式以及與黃瓜基因組同源比對結(jié)果，對潛在的黃瓜耐Cd相關(guān)基因進行篩選，同時確保與重金屬相關(guān)的該基因功能沒有被報道，初步確定了擬南芥 NAC轉(zhuǎn)錄因子 NAC019作為研究對象。然后利用 DNAMAN軟件，對CsNAC019和NAC019的氨基酸序列進行比對，同源性為60%。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點，即蛋白的N端含有高度保守約150個氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)域從N端到C端包含5個保守的亞結(jié)構(gòu)域A、B、C、D、E。兩者序列比對結(jié)果分析顯示A、B、C、D、E 5個亞結(jié)構(gòu)域氨基酸相對保守區(qū)的序列高度一致（圖 1）。由于序列的相似性可推斷功能也具有一定的相似性，最終確定NAC019在黃瓜中的同源基因 CsNAC019作為試驗研究對象。

2.2 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的克隆

以300 μmol Cd處理的黃瓜葉片cDNA為模板，CsNAC019-F和CsNAC019-R為引物進行PCR擴增，擴增出1條約960 bp的亮帶（圖2），回收目標(biāo)條帶，并與pEASY-T1克隆載體連接，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫Csa3M852470.1基因編碼區(qū)序列完全一致。

圖1 CsNAC019與NAC019保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸比較Fig. 1 Alignments of NAC domain between CsNAC019 and NAC019

2.3 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的序列分析

CsNAC019的cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸組成如圖3所示，共編碼319個氨基酸。利用NCBI對該基因的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白屬于NAM superfamily超基因家族之一（圖4）。經(jīng)過在線軟件Expasy-ProtParam（http://www.expasy.org/）分析該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，預(yù)測的CsNAC019蛋白的分子量為35.66 kD，理論等電點為8.72，不穩(wěn)定系數(shù)為 68.18，平均親水系數(shù)為-0.483，因此其屬于不穩(wěn)定型的疏水蛋白。利用 TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測表明：CsNAC019蛋白不具有跨膜蛋白結(jié)構(gòu)。

圖2 CsNAC019的擴增Fig. 2 Amplification of the CsNAC019 gene

圖3 CsNAC019的CDS序列及其氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and amino acid sequence of CsNAC019

圖4 CsNAC019蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 4 Conserved domain of CsNAC019 protein

2.4 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019啟動子順式元件分析

利用Plantcare 對 CsNAC019起始密碼子上游1 500 bp的啟動子區(qū)域進行分析（表2），結(jié)果表明，除含有真核生物啟動子固有的TATA和CAAT元件外，還包含1個G-box光響應(yīng)元件、1個ABREABA響應(yīng)元件、2個W-box真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件、1個P-box赤霉素響應(yīng)元件、3個TCA-element水楊酸響應(yīng)元件、2個TC-richrepeats、2個HSE熱脅迫響應(yīng)元件等多種響應(yīng)逆境脅迫的順式元件。

表2 CsNAC019啟動子區(qū)的順式作用元件分布及功能Table 2 Distribution and function of cis-acting elements in CsNAC019 promoter

2.5 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN 8.0軟件翻譯獲得CsNAC019的氨基酸序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）蛋白數(shù)據(jù)庫中比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與梅花、桃、蘋果等15種植物NAC轉(zhuǎn)錄因子有64%—96%的同源性，其中與甜瓜的 NAC蛋白同源性最高，為 96%。將CsNAC019與這 15條轉(zhuǎn)錄因子序列進行多重比較并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。這16條蛋白序列明顯地聚類為2組，CsNAC019與甜瓜、大豆為第一類，其中，黃瓜與甜瓜同屬葫蘆科甜瓜屬作物，親緣關(guān)系最近；而梅花和桃等則為第二類（圖5）。

2.6 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對CsNAC019在Cd脅迫條件下葉片中的表達(dá)情況進行分析（圖 6）。結(jié)果表明，與對照相比，CsNAC019在Cd脅迫條件下的表達(dá)量上調(diào)明顯，提高了8.2倍。

3 討論

圖5 CsNAC019蛋白與其他植物NAC蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig. 5 Phylogentic tree of CsNAC019 and some other NAC proteins

圖6 CsNAC019在Cd脅迫誘導(dǎo)后的相對表達(dá)量Fig. 6 The relative expression of CsNAC019 under Cd stress

本研究利用生物信息學(xué)方法得到NAC019在黃瓜中的同源基因 CsNAC019。通過對 Cd脅迫下黃瓜CsNAC019表達(dá)的分析，該基因的表達(dá)受Cd脅迫的誘導(dǎo)，這些耐Cd基因是植物在逆境下增強耐性的重要分子基礎(chǔ)。利用PCR克隆技術(shù)，成功獲得Cd相關(guān)基因CsNAC019的CDS全長。通過保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白是植物NAM superfamily超基因家族蛋白；在啟動子序列分析中，發(fā)現(xiàn)多個與逆境響應(yīng)有關(guān)的重要元件，如ABRE、ARE、HSE等。ABRE、G-box都是ABA誘導(dǎo)啟動子表達(dá)的順式作用元件[28-29]。該基因其氨基酸序列與其他植物 NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸序列同源性較高，其中，與同屬葫蘆科的甜瓜同源性最高。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，目前已在擬南芥、水稻、小麥等20多種植物中發(fā)現(xiàn)了NAC轉(zhuǎn)錄因子[30]，NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點，即蛋白的N端含有高度保守的約150個氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域。同時，NAC結(jié)構(gòu)域包含5個保守的亞結(jié)構(gòu)域A、B、C、D、E，其中亞結(jié)構(gòu)域的功能可能與結(jié)合 DNA和參與發(fā)育時期調(diào)控等有關(guān)[31-32]。NAC基因家族中的很多成員在植物對非生物逆境脅迫反應(yīng)中存在差異表達(dá)特征，這種在非生物逆境脅迫反應(yīng)中的差異表達(dá)可能反映了 NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗非生物脅迫中具有一定的生物學(xué)功能。當(dāng)植物處于干旱、高鹽的脅迫下，植物細(xì)胞會感知外界的脅迫信號，通過一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑如ABA信號途徑，把信號傳遞到脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，由各類轉(zhuǎn)錄因子啟動脅迫應(yīng)答反應(yīng)基因表達(dá)，從而激活植物抗逆反應(yīng)，降低或消除干旱、高鹽逆境所造成的傷害。干旱、高鹽等逆境脅迫或ABA能誘導(dǎo)NAC019編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[6]。此外，NAC蛋白還會與其他蛋白發(fā)生互作，在擬南芥中NAC019能在體外或者體內(nèi)特異地與CATGTG序列結(jié)合，并激活報告基因 GUS的轉(zhuǎn)錄。同時，NAC019能與ZFHD1蛋白直接結(jié)合，這種結(jié)合是激活下游基因轉(zhuǎn)錄所必需的[33-34]。

現(xiàn)有研究表明，植物通過不同的機制，例如區(qū)域化、固定鈍化及形成金屬硫蛋白、植物螯合肽、應(yīng)急作用、排外作用等來抵抗或減弱 Cd的毒害程度[6]。目前，盡管NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同作物中已有了較為廣泛的研究，但是關(guān)于該基因?qū)χ亟饘夙憫?yīng)的研究尚不明確。本研究對CsNAC019在Cd脅迫條件下的表達(dá)進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在 300 μmol·L-1Cd脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)，這說明該基因是響應(yīng)Cd脅迫后上調(diào)表達(dá)的基因。CsNAC019通過激活A(yù)BA通路來抵抗干旱、高鹽等逆境脅迫的機理已研究的比較清楚，也暗示 Cd脅迫可能激發(fā)了CsNAC019的上調(diào)表達(dá)，從而激活了一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑如ABA信號途徑，把信號傳遞到脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，由各類轉(zhuǎn)錄因子啟動脅迫應(yīng)答反應(yīng)基因表達(dá)，從而激活植物抗逆反應(yīng)，降低或消除Cd逆境所造成的傷害。

目前，關(guān)于黃瓜耐 Cd相關(guān)基因的報道較少。本研究通過克隆獲得CsNAC019，在Cd脅迫條件下，與對照相比，該基因表達(dá)顯著上調(diào)，這一結(jié)論將為后續(xù)研究黃瓜耐 Cd生理及分子機制提供思路和線索，也將為下一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育黃瓜耐 Cd新品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從黃瓜Cd脅迫條件下的葉片中分離出NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因CsNAC019，全長為960 bp，編碼319個氨基酸，編碼蛋白質(zhì)分子量為35.66 kD。該基因為一個新的Cd脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因，推測其可能通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來調(diào)控黃瓜對Cd脅迫的應(yīng)答。

[1] CHRISTENSEN T H. Cadmium soil sorption at low concentrations: V. Evidence of competition by other heavy metals. Water Air & Soil Pollution, 1987, 34(3): 293-303.

[2] 李婧, 周艷文, 陳森, 高小杰. 我國土壤Cd污染現(xiàn)狀、危害及其治理方法綜述. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2015, 21(24):104-107. LI J, ZHOU Y W, CHEN S, GAO X J. Actualities, damage and management of soil cadmium pollution in China. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2015, 21(24):104-107. (in Chinese)

[3] MORENO-CASELLES J, MORAL R, PéREZ-ESPINOSA A, PéREZ-MURCIA M D. Cadmium accumulation and distribution in cucumber plant. Journal of Plant Nutrition, 2000, 23(23): 243-250. [4] 和莉莉, 李冬梅, 吳鋼. 我國城市土壤重金屬污染研究現(xiàn)狀和展望.土壤通報, 2008, 39(5): 1210-1216. HE L L, LI D M, WU G. Current status and prospect of heavy metal pollution in urban soils of China. Chinese Journal of Soil Science, 2008, 39(5): 1210-1216. (in Chinese)

[5] GONG W Q, PAN G X. Issues of grain Cd uptake and the potential health risk of rice production sector of China. Science and Technology Review, 2006, 24(5): 43-48.

[6] 劉明浩, 陳光輝, 王悅. 植物耐鎘機制研究進展. 作物研究, 2015(1): 101-105. LIU M H, CHEN G H, WANG Y. Research progress on mechanisms of plant resistance to cadmium. Crop Research, 2015(1): 101-105. (in Chinese)

[7] WEBER M, DEINLEIN U, FISCHER S, ROGOWSKI M, GEIMER S,TENHAKEN R, CLEMENS S. A mutation in the Arabidopsis thaliana cell wall biosynthesis gene pectin methylesterase 3 as well as its ab-errant expression cause hypersensitivity specifically to Zn. The Plant Journal, 2013, 76(1): 151-164.

[8] BHUIYAN M S U, MIN S R, JEONG W J, SULTANA S, CHOI K W, LEE Y, LIU J R. Overexpression of AtATM3 in Brassica juncea confers enhanced heavy metal tolerance and accumulation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2011, 107(1): 69-77.

[9] SHIGAKI T, SREEVIDYA C, HIRSCHI K D. Analysis of the Ca2 +domain in the Arabidopsis H+/Ca2+antiporters CAX1 and CAX3. Plant Molecular Biology, 2002, 50(3): 475-483.

[10] ARAZI T, SUNKAR R, KAPLAN B, FROMM H. A tobacco plasma membrane calmodulin-binding transporter confers Ni2+tolerance and Pb2+hypersensitivity in transgenic plants. The Plant Journal, 1999, 20(2): 171-182.

[11] VROEMEN C W, MORDHORST A P, ALBRECHT C, KWAAITAAL M A, VRIES S C.The CUP-SHAPED COTYLEDON3 gene is required for boundary and shoot meristem formation in Arabidopsis. The Plant Cell, 2003, 15: 1563-1577.

[12] KIM Y S, KIM S G, PARK J E, PARK H Y, LIM M H, CHUA N H, PARK C M. A membrane-bound NAC transcription factor regulates cell division in Arabidopsis. The Plant Cell, 2006, 18: 3132-3144.

[13] HAO Y J, WEI W, SONG Q X, CHEN H W, ZHANG Y Q, WANG F, ZOU H F, LEI G, TIAN A G, ZHANG W K, MA B, ZHANG J S, CHEN S Y. Soybean NAC transcription factors promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants．The Plant Journal, 2011, 68: 302-313.

[14] JENSEN M K, KJAERSGAARD T, NIELSEN M M, GALBERG P, PETERSEN K, OSHEA C, SKRIVER K. The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor family: structure-function relationships and determinants of ANAC019 stress signaling. Biochemical Journal, 2010, 426(2) : 183-196.

[15] ZHAO Q, GALLEGO-GIRALDO L, WANG H, ZENG Y, DING S Y, CHEN F, DIXON R. An NAC transcription factor orchestrates multiple features of cell wall development in Medicago truncatula. The Plant Journal, 2010, 63(1): 100-114.

[16] 申玉華, 徐振軍, 楊曉坡, 相吉山, 文靜, 黃文婕. 紫花苜蓿NAC轉(zhuǎn)錄因子 MsNAC1基因的克隆、生物信息學(xué)分析及非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析. 植物遺傳資源學(xué)報, 2014, 15(6): 1312-1319. SHEN Y H, XU Z J, YANG X P, XIANG J S, WEN J, HUANG W J. Cloning and bioinformatics analysis of an novel NAC transcription factor MsNAC1 from Medicago sativa L．a(chǎn)nd detection of its expression under abiotic stresses. Journal of Plant Genetic Resources, 2014, 15(6): 1312-1319. (in Chinese)

[17] 李小蘭, 胡玉鑫, 楊星, 于曉東, 李秋莉. 非生物脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)及功能. 植物生理學(xué)報, 2013, 49(10): 1009-1017. LI X L, HU Y X, YANG X, YU X D, LI Q L. Structure and functions of NAC transcription factors involved in abiotic stress. Plant Physiology Journal, 2013, 49(10): 1009-1017. (in Chinese)

[18] 孫利軍, 李大勇, 張慧娟, 宋鳳鳴. NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病和抗非生物脅迫反應(yīng)中的作用. 遺傳, 2012, 34(8): 993-1002. SUN L J, LI D Y, ZHANG H J, SONG F M. Functions of NAC transcription factors in biotic and abiotic stress responses in plants. Hereditas, 2012, 34(8): 993-1002. (in Chinese)

[19] TAKASAKI H, MARUYAMA K, KIDOKORO S, ITO Y, FUJITA Y, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI S K, NAKASHIMA K. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice. Molecular Genetics and Genomics, 2010, 284(3): 173-183.

[20] JEONG J S, KIM Y S, BAEK K H, JUNG H, HA S H, CHOI D Y, KIM M, REUZEAU C, KIM J K. Root-specific expression of OsNAC10 improves drought tolerance and grain yield in rice under field drought conditions. Plant Physiology, 2010, 153(1): 185-197.

[21] 杜敏敏, 鄧?yán)? 李傳友. 番茄中兩個高度同源的 NAC類轉(zhuǎn)錄因子通過不同的機制調(diào)控病原菌誘導(dǎo)的氣孔子關(guān)閉和重新開張. 遺傳, 2014, 36(8): 847. DU M M, DENG L, LI C Y. Two highly homologous NAC transcription factors in tomato are regulated by different mechanisms to regulate pathogen-induced stomatal closure and reopening. Hereditas, 2014, 36(8): 847. (in Chinese)

[22] ZHU M, HU Z , ZHOU S, WANG L, DONG T. Molecular characterization of six tissue-specific or stress-inducible genes of NAC transcription factor family in tomato (Solanum lycopersicum). Journal of Plant Growth Regulation, 2014, 33(4): 730-744.

[23] JENSEN M K, KJAERSGAARD T, NIELSEN M M, GALBERG P, PETERSEN K. The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor family: Structure-function relationships and determinants of ANAC019 stress signalling. Biochemical Journal, 2010, 426(2): 183-196.

[24] BU Q, JIANG H, LI C B, ZHAI Q, ZHANG J. Role of the Arabidopsis thaliana NAC transcription factors ANAC019 and ANAC055 in regulating jasmonic acid-signaled defense responses. Cell Research, 2008, 18(7): 756-767.

[25] JIANG H, LI H, BU Q, LI C. The RHA2a-interacting proteins ANAC019 and ANAC055 may play a dual role in regulating ABA response and jasmonate response. Plant Signaling & Behavior, 2009, 4(5): 464-466.

[26] WELNER D H, ERNST H A, OLSEN A N, GROSSMANN J G, HELGSTRAND C. Structural characterization of ANAC019, a member of the NAC family of plant transcription factors. Acta Crystallographica, 2001, 64(a1): C306-C307.

[27] FUJIWARA T, HIRAI M Y, CHINO M, KOMEDA Y, NAITO S. Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes in transgenic petunia. Plant Physiology, 1992, 99(1): 263-268.

[28] 何訪, 梅文莉, 郭冬, 李輝亮, 彭世清. 植物激素應(yīng)答元件研究進展. 熱帶作物學(xué)報, 2015, 36(1): 211-218. HE F, MEI W L, GUO D, LI H L, PENG S Q. Advancement of phytohormone response cis-elements. Chinese Journal of Tropical Crops, 2015, 36(1): 211-218. (in Chinese)

[29] 張毅, 尹輝, 李丹, 朱巍巍, 李秋莉. 植物啟動子的化學(xué)因素誘導(dǎo)元件. 植物生理學(xué)報, 2007, 43(4): 787-794. ZHANG Y, YIN H, LI D, ZHU W W, LI Q L. The Cis-elements of plant chemic inducible promoters. Plant Physiology and Molecular Biology, 2007, 43(4): 787-794. (in Chinese)

[30] RIECHMANN J L, HEARD J, MARTIN G, REUBER L, JIANG C Z, KEDDIE J, ADAM L, PINEDA O, RATCLIFFE O J, SAMAHA R R, CREELMAN R, PILGRIM M, BROUN P, ZHANG J Z, GHANDEHARI D B, SHERMAN K, YU G L. Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 2000, 290: 2105-2110.

[31] ERNST H A, OLSEN A N, SKRIVER K, LARSEN S, LEGGIO L L. Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors. EMBO Reports, 2004, 5(3): 297-303.

[32] JENSEN M K, RUNG J H, GREGERSEN P L, GJETTING T, FUGLSANG A T, HANSEN M, JOEHNK N, LYNGKJAER M F, COLLINGE D B. The HvNAC6 transcription factor: A positive regulator of penetration resistance in barley and Arabidopsis. Plant Molecular Biology, 2007, 65 (1/2): 137-150.

[33] TRAN L S P, NAKASHIMA K, SAKUMA Y, SIMPSON S D, FUJITA Y, MARUYAMA K, FUJITA M, SEKI M, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress -inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter. Plant Cell Online, 2004, 16(9): 2481-2498.

[34] 李偉, 韓蕾, 錢永強, 孫振元. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的種類、特征及功能. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2011(4): 596-606. LI W, HAN L, QIAN Y Q, SUN Z Y. Characteristics and functions of NAC transcription factors in plants. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2011(4): 596-606. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Cadmium Tolerance Related Gene CsNAC019 in Cucumber

LI HuiYuan, TIAN ChunYu, ZHENG YuYing, WU Tao
(Horticultural and Landscape Architecture College, Northeast Agricultural University/Key Laboratory of Biology and Germplasm Creation for Horticultural Crops, Harbin 150030)

【Objective】 To understand the molecular mechanism of Cd tolerance in cucumber, a NAC transcription factor CsNAC019 was obtained by using bioinformatics analysis. CsNAC019 was cloned and its expression was analyzed under Cd stress. The results of the present study will provide an experimental foundation for breeding of cucumber cultivars with high capacity for Cd tolerance.【Method】The full length sequence of CsNAC019 was cloned by PCR. Sequence comparison and conserved domain were analyzed by NCBI and DNAMAN. Amino acid composition, stability coefficient, and hydrophilic coefficient were analyzed by online software Expasy and TMHMM. The promoter region was analyzed by online software PlantCARE. Phylogenic tree was constructed by MEGA 6.0 according to the NJ method. The real-time PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression pattern of CsNAC019 under Cd treatments. The variance and significance were analyzed by DPS 7.05.【Result】CsNAC019 contained a typical conserved NAC domain. BLAST analysis revealed that CsNAC019 had 60% homology with NAC019 in the amino acid sequence, and the five relatively conserved regions of its amino acid sequences, A, B, C, D and E, were highly consistent between them from the N-terminal to the C-terminal. The full-length CDS of CsNAC019 was 960 bp, which encoded 319 amino acids with a molecular weight of 35.66 kD. The theoretical isoelectric point is 8.72, the instability coefficient is 68.18, and the average hydrophilic coefficient is -0.483. Besides the eukaryotic promoter TATA and CAAT natural elements, promoter analysis showed that the promoter sequence of CsNAC019 also had cis elements in response to stress, such as G-box, ABRE, W-box, P-box, TCA-element, TC-richrepeats, and HSE, etc. Phylogenetic analysis showed that CsNAC019 had 64%-96% homology with NAC transcription factors of other 15 plants (melon, peach, apple, citrus, grape and soybean, etc). CsNAC019 had the highest homology, 96%, with the NAC sequence of melon. qRT-PCR analysis revealed that the expression of CsNAC019 was significantly increased (8.2 folds) compared with the control under Cd tolerance condition.【Conclusion】CsNAC019 is a Cd tolerance induced gene. It was speculated that CsNAC019 may regulate the cucumber to response to Cd tolerance by regulating the expression of downstream genes.

cucumber; Cd; CsNAC019; gene clone; expression analysis

2016-11-25；接受日期：2017-03-06

國家自然科學(xué)基金青年基金（31101545）、黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃（UNPYSCT-201500）、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“青年才俊”項目（14QC07）、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)術(shù)骨干”項目（16XG05）

聯(lián)系方式：李慧園，E-mail：tarasland@163.com。通信作者武濤Tel：0451-55190214；E-mail：wutao@neau.edu.cn