曾 理，唐澤飛，李春鳴

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

臨床醫(yī)學(xué)研究

重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP載體的構(gòu)建及鑒定

曾 理，唐澤飛，李春鳴

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

目的 構(gòu)建攜帶有NM23的重組腺病毒載體并觀察其對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC-823凋亡的影響。方法 以質(zhì)粒NM23-PIRES2-EGFP為模版，采用PCR擴(kuò)增NM23基因，克隆至腺病毒載體pCMV-MCS-IRES-EGFP上，形成重組腺病毒載體pCMV-NM23-IRES-EGFP并酶切鑒定及基因測(cè)序。將人胃癌細(xì)胞株BGC-823分為實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組，感染pCMV-NM23-IRES-EGFP)、空白組(Ctrl組)，陰性對(duì)照組(NC組，感染pCMV-MCS-IRES-EGFP)；Real Time PCR和Western Blot分別檢測(cè)3組細(xì)胞中NM23mRNA和蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定和基因測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP；經(jīng)擴(kuò)增后，重組腺病毒的滴度為4.0×1010ifu/mL ；RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組的NM23的mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于其他兩組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞的凋亡率也顯著高于其他兩組(P<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建了過表達(dá)NM23的重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP載體，通過上調(diào)NM23基因的表達(dá)，可觀察到胃癌細(xì)胞株BGC-823的凋亡水平有明顯升高，為后續(xù)研究NM23基因?qū)θ宋赶侔┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

NM23；載體；BGC-823；腺病毒；凋亡

NM23基因最早發(fā)現(xiàn)于1988年，是由美國國立癌癥研究所的Steeg等[1]用消減雜交分離的方法從7個(gè)K-1735小鼠黑色素瘤細(xì)胞株中分離出來并克隆成功。作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，NM23基因在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)[2-3]，而這種表達(dá)的缺失對(duì)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移起重要作用。Radovic等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜相比NM23基因在胃腺上皮細(xì)胞癌中呈現(xiàn)低表達(dá)。孫端[5]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NM23基因表達(dá)的缺失可導(dǎo)致臨床TMN分期的加重。

作為目前應(yīng)用最為廣泛的載體之一，腺病毒載體具有宿主范圍廣、感染率高、安全性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)采用AdMax系統(tǒng)的第三代腺病毒，通過構(gòu)建攜帶NM23基因的重組腺病毒載體并感染人胃癌細(xì)胞株BGC-823，從而獲得穩(wěn)定過表達(dá)NM23基因的人胃癌細(xì)胞株BGC-823，為后續(xù)研究NM23基因?qū)θ宋赶侔┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 質(zhì)粒NM23-PIRES2-EGFP、人低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC-823為本實(shí)驗(yàn)室保存。人胚腎細(xì)胞系HEK293購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。腺病毒載體pCMV-MCS-IRES-EGFP和Anti-Hexon一抗、HRP標(biāo)記二抗購自上海和元生物技術(shù)有限公司。內(nèi)切酶EcoR I-HF和BamH I-HF酶、T4 DNA連接酶購自上海碧云天生物技術(shù)公司代理Fermentas MBI(美國)產(chǎn)品；PCR相關(guān)試劑購自Takara公司；兔抗人Flag一抗購自Sigma公司；兔抗人NM23A一抗購自Abcam公司；內(nèi)參Actin抗體及GAPDH抗體均購自Beyotime公司；ECL+plusTMWestern blotting system試劑盒購自Amersham公司；引物合成由上海和元生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 主要儀器 JB-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)；GHP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TDZ4-WS型低速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；MHG-100B型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf 公司)；3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)；4200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Fisher)。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增NM23基因 收集正常的人胃黏膜并用Trizol法提取RNA，根據(jù)NM23基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：上游引物：5′-AGCTTGGGCTGCAGGAATTCGCCACCATGGTGCTACTG-3′；下游引物：5′-TCATCCTTGTAGTCGGATCCTTCATAGATCCAGTTCTGAGCAC-3′；劃痕為酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增程序：98 ℃ 10 s；55 ℃ 5/15 s；72 ℃ 1 min；30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用TaKaRa MiniBEST瓊脂糖凝膠DNA抽提試劑盒(Ver.3.0)回收擴(kuò)增片段。

1.3.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 將真核表達(dá)載體pCMV-MCS-IRES-EGFP與上述NM23擴(kuò)增片段回收產(chǎn)物分別經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別回收酶切后片段，回收產(chǎn)物在T4DNA 連接酶的作用下于16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α的感受態(tài)細(xì)菌，于LB 中搖床孵育1.5 h，再在含有100 μg/mL Ampicillin(Amp)的固體LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，Amp+固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)12 h，挑取菌落，克隆于LB(Amp +) 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。抽提質(zhì)粒并用EcoR I和BamH I雙酶切鑒定，送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果后得到正確的重組腺病毒質(zhì)粒pCMV-NM23-IRES-EGFP。

1.3.3 重組腺病毒的包裝 將待轉(zhuǎn)染的病毒載體質(zhì)粒4 μg，溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為250 μL；將8μL 輕混腺病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為250 μL；將腺病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加于質(zhì)粒稀釋液中，混勻后室溫靜置20 min。在細(xì)胞培養(yǎng)板加入剛配好的DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體，將其做好標(biāo)記并放回培養(yǎng)箱孵育6 h；更換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；每3天補(bǔ)液1次，14d左右出現(xiàn)病毒空斑，待完全病變后收集上清液。

1.3.4 重組腺病毒的擴(kuò)增 將HEK293細(xì)胞接種于30～40個(gè)10 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度至70%～80%時(shí)，每塊板加入病毒(約107～108PFU/mL)10 μL進(jìn)行感染，待2～3d后細(xì)胞全部病變，每塊板中加入約500 μL 10% Nonidet P 40(NP40)以裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解物，12 000 rpm離心10 min，棄細(xì)胞碎片收集上清。每100 mL上清加入50 mL病毒沉淀液(20% PEG8 000，2.5 mol/LNaCl)，冰上靜置1 h以沉淀病毒。12 000 rpm離心上述混合物20 min，棄上清，將沉淀物懸浮在10 mL密度為1.10 g/mL的CsCl溶液中(溶劑為20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)4°C 7 000 rpm離心5 min，收集病毒懸浮液分裝后置-80 ℃冰箱中保存。

1.3.5 重組腺病毒滴度測(cè)定 將5.0×105個(gè)/mL的HEK293細(xì)胞接種于24孔板，1 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)14～18 h。加入不同稀釋濃度的病毒樣品(10-5～10-8)，每孔加入100 μL。37°C、5% CO2培養(yǎng)48 h。輕輕的去除培養(yǎng)液，沿著24孔板側(cè)壁緩緩加入預(yù)冷的甲醇500 μL，-20°C固定20 min。使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。加入200μL 1%BSA 37 ℃封閉1 h。每孔加入200 μL的Anti-Hexon一抗溶液，37 ℃孵育1 h。使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5 min。每孔加入200 μL的HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h。使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5 min。每孔加入200 μL新配置的工作液，室溫孵育5～10 min。棄工作液，使用PBS清洗2次，每孔加入1 mL PBS。每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，使用光學(xué)顯微鏡10×物鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。計(jì)算每孔陽性細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)和病毒滴度。

病毒滴度(ifu/mL)=陽性細(xì)胞平均數(shù)×每孔視野數(shù)×稀釋倍數(shù)/0.1mL。

1.3.6 重組腺病毒感染人胃癌細(xì)胞株BGC-823 本實(shí)驗(yàn)所用BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，靜置貼壁常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL的青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞BGC-823分組：感染重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP載體的實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)、空白組(Ctrl組，不做任何處理)和感染pCMV-MCS-IRES-EGFP的陰性對(duì)照組(NC組)，每組3個(gè)孔。

按每孔5×105的細(xì)胞數(shù)將BGC-823細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，加入pCMV-NM23-IRES-EGFP病毒液作為NM23-OE組及pCMV-MCS-IRES-EGFP病毒液作為NC組進(jìn)行感染，同時(shí)以無病毒感染的細(xì)胞作為Ctrl組。取新鮮的DMEM培養(yǎng)基按照最佳感染復(fù)數(shù)(MOI值)為80來稀釋病毒原液，棄廢舊培養(yǎng)基，將不含NM23的陰性腺病毒稀釋液加到陰性對(duì)照組中，含有NM23基因的重組腺病毒液稀釋液加到實(shí)驗(yàn)組中，輕搖混勻后，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。病毒感染48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基；72 h后通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光EGFP表達(dá)，確定腺病毒感染胃癌細(xì)胞BGC-823成功以及感染效率。將NC組和NM23-OE組的細(xì)胞消化并用無菌PBS洗滌2次，收集BGC-823細(xì)胞上流式細(xì)胞儀(FCM)篩選EGFP陽性細(xì)胞。將兩組篩選獲得的BGC-823細(xì)胞繼續(xù)在培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)大培養(yǎng)4周。

1.3.7 BGC-823細(xì)胞NM23基因過表達(dá)檢測(cè)

1.3.7.1 RT-PCR 檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中NM23的mRNA 根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書進(jìn)行提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：NM23上游引物：5′-GATCTTCTCAAGGAACACTAC-3′，NM23下游引物：5′-CCGTCTTCACCACATTCA-3′，內(nèi)參Actin上游引物：5′-TTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物：5′-CTCAAACATGATCTGGGTC-3′。設(shè)定程序?yàn)閮刹椒?Real-TimePCR定量。預(yù)變性95°C，30 s，之后每一步變性95°C，5 s，退火延伸60°C，34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。采用2-ΔΔCt對(duì)目的基因的mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.7.2 Western blot檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中NM23蛋白水平 提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，電泳時(shí)每孔上樣蛋白量為5 μL，經(jīng)分離后，使用垂直電泳裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液4 ℃封閉過夜；洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min；以GAPDH為內(nèi)參室溫下孵育PVDF膜2 h；洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min；采用ECL+plusTMWestern blotting system試劑盒進(jìn)行顯色；天能4200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光，根據(jù)所用的蛋白Marker分析圖片。

1.3.7.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC-823細(xì)胞凋亡 準(zhǔn)備3組BGC-823細(xì)胞，樣品收取都使用預(yù)冷的PBS洗滌2次，500 rpm離心5 min，棄上清；用90 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5 mL流式管里，每管細(xì)胞數(shù)量5×105～1×106之間；加5 μL的PE Annexin V和5 μL 7-AAD。將細(xì)胞混勻后室溫避光孵育15 min；每管加400μL的1×Binding Buffer到500μL體積。在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1NM23擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定NM23經(jīng)PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析觀察，可見一條約577 bp 的特異性條帶，大小與目的片段相符(見圖1)。

1：PCR產(chǎn)物；2：DL2000 DNA Marker。圖1 NM23 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組腺病毒載體的鑒定 經(jīng)EcoR I-HF和BamH I-HF酶進(jìn)行雙酶切的產(chǎn)物可見5888bp的條帶(見圖2)；菌落PCR鑒定結(jié)果可見835bp左右的條帶(見圖3)。將腺病毒重組載體pCMV-NM23-IRES-EGFP進(jìn)行測(cè)序分析，與Genbank記錄的NM23序列一致。圖4所示為重組質(zhì)粒測(cè)序部分序列圖。

1：載體酶切后片段；2：1 kb DNA Marker。圖2 腺病毒載體酶切電泳圖

1：DL2000 DNA Marker；2～7：挑取的6個(gè)轉(zhuǎn)化子。圖3 菌落PCR鑒定結(jié)果

圖4 重組質(zhì)粒pCMV-NM23-IRES-EGFP部分序列圖

2.3 BGC-823細(xì)胞NM23mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá) 利用實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)中目的基因攜帶Flag標(biāo)簽，通過WB實(shí)驗(yàn)使用目的抗體NM23檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)感染BGC-823的細(xì)胞樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示能觀察到清晰的目的條帶(見圖5)，證實(shí)實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)在BGC823細(xì)胞中有表達(dá)。各組細(xì)胞灰度分析結(jié)果(見表1)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，空白組(Ctrl組)與陰性對(duì)照組(NC組)中NM23的表達(dá)水平并無差異；而實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)NM23表達(dá)水平相較于其他兩組均顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

M：Maker；1：空白組(Ctrl組)；2:陰性對(duì)照組(NC組)；3:實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)。圖5 BGC-823細(xì)胞中NM23基因的蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)目的基因?yàn)镹M23，與3Flag融合后預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)蛋白大小約為19 kDa；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Marker15-25 kDa之間處有條帶出現(xiàn)，證實(shí)實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組)在BGC823細(xì)胞中有表達(dá)。

RT-PCR檢測(cè)BGC-823細(xì)胞過表達(dá)NM23效率 RT-PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE)BGC-823細(xì)胞的NM23mRNA表達(dá)量與空白組、陰性對(duì)照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組別NM23蛋白水平NM23mRNA水平Ctrl0.25±0.090.83±0.04NC0.31±0.171.00±0.03NM23-OE1.27±0.13*#2.59±0.06*#

*：與Ctrl組比較，P<0.05；#：與NC組比較，P<0.05；Ctrl組與NC組比較，P>0.05。

2.4 過表達(dá)NM23促進(jìn)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率結(jié)果見圖6和表2。NM23-OE組細(xì)胞凋亡率12.87%，明顯高于NC組的1.90%和Ctrl組的1.74%(P<0.05)。而NC組和Ctrl組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖6 各組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

表2 穩(wěn)定過表達(dá)NM23各組細(xì)胞凋亡比例

組別細(xì)胞凋亡率(%)Ctrl1.74±0.98NC1.90±1.35NM23-OE12.87±3.02*#

*：與Ctrl組比較，P<0.05；#：與NC組比較，P<0.05；Ctrl組與NC組比較，P>0.05。

3 討論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[7-8]。由于早期胃癌無明顯臨床癥狀，導(dǎo)致患者就診時(shí)多為進(jìn)展期胃癌，而進(jìn)展期胃癌的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移使得傳統(tǒng)的治療方法療效十分有限。隨著胃癌分子機(jī)制研究的不斷深入，胃癌基因治療成為當(dāng)代胃癌治療研究中的熱點(diǎn)[9]。基因治療是在基因調(diào)節(jié)水平上進(jìn)行操作以殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，是一種對(duì)患者損傷性低、對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性高的理想方法[10]。

有研究報(bào)道，在腫瘤動(dòng)物模型中NM23的穩(wěn)定高表達(dá)可以明顯降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[11-12]。有觀點(diǎn)認(rèn)為NM23可能是通過調(diào)節(jié)其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能產(chǎn)生影響[13]。因此在腫瘤細(xì)胞中重新激活NM23可能會(huì)成為一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的新途徑。但現(xiàn)今腫瘤的基因治療在臨床的應(yīng)用中成效并不顯著，究其原因與缺少有效的基因傳遞系統(tǒng)密不可分[14]。病毒載體作為一種較為理想的基因介導(dǎo)載體，在基因治療領(lǐng)域中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了攜帶有NM23的重組腺病毒載體并觀察其對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞凋亡的影響。我們采用PCR法從課題組前期成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒NM23-PIRES2-EGFP中擴(kuò)增出NM23基因，并將其克隆至腺病毒載體pCMV-MCS-IRES-EGFP上，從而獲得重組腺病毒載體pCMV-NM23-IRES-EGFP。此次，我們選用Admax系統(tǒng)的第三代腺病毒，不僅去除了載體自身所包含的結(jié)構(gòu)蛋白，避免了免疫系統(tǒng)的攻擊，同時(shí)針對(duì)靜止期的細(xì)胞也有更為持久且穩(wěn)定的表達(dá)功效。該病毒載體pCMV-MCS-IRES-EGFP因攜帶有特異性高且檢測(cè)便捷的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP，不僅可以通過熒光顯微鏡觀察目的病毒的感染效率，同時(shí)也能通過流式細(xì)胞儀(FACS)快速篩選以獲取陽性細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR和Western Blot分別檢測(cè)空白組、陰性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞中的NM23表達(dá)情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中的NM23基因mRNA和蛋白表達(dá)高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明我們所構(gòu)建的重組腺病毒可以有效過表達(dá)NM23基因。

多數(shù)研究認(rèn)為NM23基因可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而起到抑制腫瘤的作用[15-16]。我們利用流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與空白組、陰性對(duì)照組相比凋亡率有所升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明重組腺病毒感染細(xì)胞后，NM23基因的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

總之，在本實(shí)驗(yàn)中我們成功構(gòu)建了攜帶NM23基因的重組腺病毒載體pCMV-NM23-IRES-EGFP，建立了穩(wěn)定表達(dá)NM23基因的低分化人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823，并對(duì)其中NM23在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況和對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡方面的影響進(jìn)行了初步觀察和探討，為后續(xù)研究NM23基因?qū)θ宋赶侔┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2017-02-01;修回2017-03-08]

(編輯：王福軍)

Construction and identification of recombinant adenovirus pCMV-NM23-IRES-EGFP

ZengLi,TangZefei,LiChunming

(Department of Pathology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To construct the re-combinant adenovirus vector carrying with geneNM23 and observe the influence on the apoptosis of human carcinoma of stomach cell line BGC-823.Methods TheNM23 gene was amplified by PCR using plasmid NM23-PIRES2-EGFP as templateand cloned into adenovirus vector pCMV-MCS-IRES-EGFP.The recombinant adenovirus vector pCMV-NM23-IRES-EGFP was identified by restriction enzyme digestion and gene sequencing.The human gastric cancer cell line BGC-823 was divided into experimental group (NM23-OE group,infected pCMV-NM23-IRES-EGFP),blank group (Ctrl group),negative control group (NC group,infected pCMV-MCS-IRES-EGFP).The mRNA and protein expressions of NM23 gene were detected by real Time PCR and western blot assay.The apoptosis was detected by flow cytometry.Results The recombinant adenovirus pCMV-NM23-IRES-EGFP was supported by restriction enzyme digestion and gene sequencing.After amplification,the titer of re-constructed adenovirus was 4.0×1010ifu/ml.Compared with the NC group,there was no significant difference between the Ctrl group and the NC group (P>0.05).The mRNA and protein expressions ofNM23 gene in the NM23-OE group were higher than those in the other two groups(P<0.05).The apoptosis rate of human gastric cancer cell line BGC-823 in the NM23-OE group was also higher than that in the other two groups (P<0.05).Conclusion The recombinant adenovirus pCMV-NM23-IRES-EGFP vector is successfully constructed.The expression ofNM23 gene is significantly increased by up-regulating the expression ofNM23 gene BGC-823.These data could provide an experimental basis for the subsequent study on the effect ofNM23 gene on the biological function of human gastric adenocarcinoma cells.

NM23; vector; BGC-823; adenovirus; apoptosis

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合SY字[2013]3001)。

李春鳴，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：胃腸道腫瘤，E-mail:cmli@zmc.edu.cn。

R363

A

1000-2715(2017)02-0166-06