李浩洋，張憲臣，張小花，胡儀光，李 蓉＊

（1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，中山528400； 2.中山市國林沉香科學(xué)研究所，中山528400）

“通體結(jié)香技術(shù)”所結(jié)人工沉香的質(zhì)量評(píng)價(jià)

李浩洋1，張憲臣1，張小花2，胡儀光1，李 蓉1＊

（1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，中山528400； 2.中山市國林沉香科學(xué)研究所，中山528400）

國產(chǎn)沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含樹脂的木材，主要產(chǎn)于我國海南、廣東等地，是我國傳統(tǒng)的名貴藥材［1－2］。沉香味辛、苦，性微溫，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥狀［3］。長期以來由于對(duì)沉香資源的過度采伐，白木香植物資源日漸枯竭，現(xiàn)被列為國家二級(jí)保護(hù)野生植物，并載入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ［4］。

在自然界中，只有當(dāng)沉香屬植物受到刺激或損傷時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生沉香，結(jié)香過程往往需要幾十年甚至上百年時(shí)間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)臨床用藥需求。為此，人們研發(fā)了物理傷害結(jié)香法、接菌結(jié)香法、化學(xué)傷害結(jié)香法等多種人工結(jié)香技術(shù)來促進(jìn)白木香樹的結(jié)香［5］。文獻(xiàn)［6］提出“白木香防御反應(yīng)誘導(dǎo)結(jié)香假說”，發(fā)明了“通體結(jié)香技術(shù)”［7］，縮短了結(jié)香時(shí)間，提高了沉香產(chǎn)量，較好地解決了沉香產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中面臨的結(jié)香技術(shù)瓶頸，使產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)沉香變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，所結(jié)人工沉香可稱為通體香沉香。因此，開展通體香沉香的質(zhì)量評(píng)價(jià)，不僅可為通體香沉香的質(zhì)量控制、質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)，還能為通體結(jié)香產(chǎn)業(yè)提供有力的理論支撐。

目前，針對(duì)評(píng)價(jià)通體香沉香質(zhì)量的研究主要集中在性狀描述、顯微鑒別、薄層鑒別、理化鑒別、浸出物含量、揮發(fā)油等方面［7－10］，而關(guān)于利用特征圖譜、特征組分沉香四醇含量和特征參數(shù)評(píng)價(jià)通體香沉香質(zhì)量的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。特征圖譜作為一種現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制方法，已成為國內(nèi)外廣泛認(rèn)可的中藥質(zhì)量控制模型［11－13］，特征組分沉香四醇則在沉香真?zhèn)舞b定中具有極其重要的作用［14］，而通體香沉香的特征參數(shù)可作為區(qū)別其他人工結(jié)香技術(shù)所結(jié)沉香的有效依據(jù)。本工作通過測(cè)定通體香沉香的特征圖譜、沉香四醇和浸出物含量及特征參數(shù)，對(duì)通體香沉香的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；WNB22L4型水浴搖床；UA22MFD型超聲波清洗機(jī)；DKN 612C型烘箱。

沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 000mg·L－1，乙醇為介質(zhì)，于4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用乙醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度為96.8%）；乙醇、乙腈、甲酸均為分析純；試驗(yàn)用水均為超純水（電阻率小于18.2μS·cm）。

1.2 色譜條件

Phenomenex C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL，流量0.7mL· min－1；檢測(cè)波長252nm；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～10min時(shí)，A由15%升至20%；10～19min時(shí)，A由20%升至23%；19～21min時(shí)，A由23%升至33%，保持18min；39～40min，A由33%升至35%，保持5min；45～46min時(shí)，A由35%跳轉(zhuǎn)至95%，保持4min；50～51min，A由95%跳轉(zhuǎn)至15%，保持9min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 特征圖譜和沉香四醇測(cè)定法

稱取沉香樣品（過0.35mm篩）0.200 0g，置于具塞錐形瓶中，加入乙醇10mL，稱定質(zhì)量，浸泡0.5h，超聲（功率250W，頻率40kHz）1h，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上層清液，過0.22μm聚四氟乙烯（PTFE）濾膜后，直接注入高效液相色譜儀，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 醇溶性浸出物測(cè)定法

醇溶性浸出物含量按照2015年版《中國藥典》四部中“浸出物測(cè)定法（醇溶性浸出物）”要求進(jìn)行測(cè)定［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

60.0 mg·L－1沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見圖1，其保留時(shí)間為17.8min。

圖1 沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC spectrum of agarotetrol standard solution

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)考察了Thermo C18柱（100mm×2.1mm，3μm），Capcell C18柱（150mm×2.0mm，5μm），Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5μm）等色譜柱對(duì)沉香提取液的色譜峰分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Phenomenex C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）對(duì)沉香提取液的色譜峰分離效果較好。

試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了選擇，最初用乙腈－20mmol乙酸胺溶液作為流動(dòng)相，提取液中色譜峰分離效果較好，但是有個(gè)別色譜峰達(dá)不到基線分離；選擇乙腈－0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，分離效果有顯著改善，經(jīng)試驗(yàn)選擇乙腈－0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，采用1.2節(jié)中梯度洗脫條件，可實(shí)現(xiàn)各目標(biāo)物質(zhì)的有效分離，各峰峰形尖銳，峰對(duì)稱性好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按色譜條件對(duì)20.0，40.0，60.0，100.0，140.0，200.0mg·L－1沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定。以沉香四醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y＝36.11 x－22.20，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

對(duì)低質(zhì)量濃度沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N）為0.05mg· L－1，以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限（10S／N）為0.8mg·L－1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

平行稱取通體香沉香樣品7份，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.0%，表明方法精密度較好。

平行稱取通體香沉香樣品9份，分別進(jìn)行高、中、低等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)（n＝9）Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知：加標(biāo)回收率在93.3%～120%之間，表明方法符合沉香四醇的測(cè)定要求。

2.5 特征圖譜

按試驗(yàn)方法對(duì)沉香樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄其特征圖譜，結(jié)果見圖2。

圖2 對(duì)照品和10批樣品的HPLC特征圖譜Fig.2 HPLC characteristic spectra of reference substance and 10batches of samples

由圖2可知：對(duì)照品特征圖譜S0中呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，與2015年版《中國藥典》中的沉香對(duì)照特征圖譜整體相似，表明試驗(yàn)采用的天然沉香對(duì)照品滿足藥典中的要求。供試品圖譜S1～S10中6個(gè)特征峰與對(duì)照品特征譜圖S0一一對(duì)應(yīng)，其中峰1的保留時(shí)間約為17.8min，與天然沉香對(duì)照品S0中峰1的保留時(shí)間基本一致，說明通體香沉香與天然沉香具有相似的化學(xué)成分。

2.6 沉香四醇的測(cè)定

取通體香沉香樣品和天然沉香對(duì)照品，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見表2。

由表2可知：通體香沉香樣品中沉香四醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.12%～0.39%之間，符合2015年版《中國藥典》中“沉香”項(xiàng)規(guī)定的0.10%的要求。

2.7 醇溶性浸出物的測(cè)定

取通體香沉香樣品和天然沉香對(duì)照品各2份，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見表2。

由表2可知：通體香沉香樣品中醇溶性浸出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10.0%～31.7%之間，符合2015年版《中國藥典》中“沉香”項(xiàng)規(guī)定的10.0%的要求。

2.8 特征參數(shù)的確定

在對(duì)液相色譜特征圖譜的研究中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)特征峰，并通過對(duì)照品確認(rèn)峰1為沉香四醇的特征峰，是鑒定沉香真?zhèn)蔚奶卣鹘M分，而醇溶性浸出物則代表沉香中總的有效成分，二者的含量不僅代表沉香的本身特性，而且與結(jié)香技術(shù)息息相關(guān)，故將二者比值定義為特定結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香的特征參數(shù)，以K表示?！巴w結(jié)香技術(shù)”的結(jié)香過程發(fā)生在白木香樹內(nèi)部，相對(duì)于其他結(jié)香方式其結(jié)香過程受外界因素影響較小，因此，所結(jié)人工沉香的K值相對(duì)穩(wěn)定，其結(jié)果見表2。

表2 沉香四醇、浸出物和特征參數(shù)的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of Agarotetrol，extracts and characteristic parameters

10批“通體結(jié)香技術(shù)”所結(jié)人工沉香K值的結(jié)果表明，通體香沉香樣品的K值相對(duì)穩(wěn)定，均在（1.3±0.1）×10－2范圍內(nèi)，而天然沉香對(duì)照品的K值測(cè)定結(jié)果為1.52×10－2。此K值可作為“通體結(jié)香技術(shù)”所結(jié)沉香的特征參數(shù)，以區(qū)別天然沉香或其他結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)的人工沉香，也可利用K值和通體香沉香中浸出物含量粗略判斷沉香四醇含量，縮短測(cè)定時(shí)間，提高測(cè)定效率，降低通體香沉香生產(chǎn)企業(yè)為評(píng)價(jià)沉香質(zhì)量而購買試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)儀器的費(fèi)用，為通體結(jié)香產(chǎn)業(yè)的強(qiáng)大提供有力的理論依據(jù)。

本工作通過測(cè)定通體香沉香樣品中液相色譜特征圖譜、沉香四醇含量和醇溶性浸出物含量，對(duì)“通體結(jié)香技術(shù)”所結(jié)人工沉香進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)?！巴w結(jié)香技術(shù)”所結(jié)人工沉香的質(zhì)量符合2015年版《中國藥典》中“沉香”項(xiàng)的規(guī)定，可以作為藥品代替天然沉香入藥。

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中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A2FC241）；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK052）

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