袁大林，楊 繼，湯建國(guó)，楊 柳，吳 俊，段沅杏，鞏效偉，陳永寬

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明650231）

紫外－可見分光光度法測(cè)定袋裝口含煙溶入人工唾液中的煙堿含量

袁大林，楊 繼，湯建國(guó)，楊 柳，吳 俊，段沅杏，鞏效偉，陳永寬＊

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明650231）

袋裝口含煙樣品經(jīng)自行設(shè)計(jì)的溶出裝置使其中的煙堿溶入于人工唾液中，從所收集的人工唾液中分取試液1.00mL，加入pH 4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液1.0mL和飽和甲基橙溶液1.0mL，混勻，生成黃色絡(luò)合物。加入二氯甲烷4.0mL，渦旋1min，靜置15min，取下層萃取液，于波長(zhǎng)420nm處測(cè)量其吸光度。煙堿的質(zhì)量濃度在1.00～150mg·L－1范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系，檢出限（3s）為0.08mg·L－1。按標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收試驗(yàn)，回收率在97.3%～103%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）在0.86%～1.2%之間。

紫外－可見分光光度法；煙堿；袋裝口含煙；人工唾液

無(wú)煙氣煙草（簡(jiǎn)稱ST）制品是指不經(jīng)燃燒過(guò)程，直接通過(guò)口腔或鼻腔吸食的煙草制品［1］。與傳統(tǒng)卷煙相比主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是使用時(shí)不經(jīng)燃燒，降低了因燃燒而產(chǎn)生的焦油和其他有害成分，相比之下危害性較?。?－5］；二是不產(chǎn)生二手煙氣，不影響公共場(chǎng)所的空氣質(zhì)量，并能在一定程度上緩解公共場(chǎng)所禁煙和吸煙的矛盾；三是不受場(chǎng)所限制，且能在一定程度上滿足煙民的生理需要［6］。袋裝口含煙屬于無(wú)煙氣煙草制品，是將粉碎到一定粒徑的煙草經(jīng)過(guò)加工處理后包于小袋的煙草制品，使用時(shí)直接將其置于口腔內(nèi)，無(wú)需咀嚼，其主要成分經(jīng)唾液溶解后經(jīng)口腔黏膜吸收［7］。隨著世界各地禁煙力度不斷加大，一些國(guó)家限制吸煙，并定制實(shí)施十分嚴(yán)格的公共場(chǎng)所禁煙令，口含型無(wú)煙氣煙草受到較高重視，國(guó)內(nèi)相關(guān)部門也已開展對(duì)袋裝口含煙的研究［8］。

煙堿是煙草眾多成分中較重要的一種生物堿，其含量及釋放速率是評(píng)價(jià)各種口含型無(wú)煙氣煙草制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，同時(shí)也是制作袋裝口含煙的一項(xiàng)重要參數(shù)。現(xiàn)有測(cè)定煙堿的分析方法有氣相色譜法［910］、高效液相色譜法［11］、紫外分光光度法［12］、非水滴定法、旋光法和鎢酸重量法［13］等。氣相色譜法前處理過(guò)程復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)（一個(gè)樣需20～30min）；而用高效液相色譜法測(cè)定時(shí)，以人工唾液為基質(zhì)的袋裝口含煙釋放液成分復(fù)雜，離子含量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致柱壓升高，縮短泵使用壽命等不良后果。依據(jù)煙堿在一定條件下能與甲基橙發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成的黃色絡(luò)合物在可見光區(qū)的吸光度與煙堿含量成正比這一原理，本工作采用紫外－可見分光光度法快速測(cè)定袋裝口含煙釋放液中煙堿的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Crystal HYQ－2110型渦旋混勻器；S 20型酸度計(jì)；XP 504型分析天平（感量0.000 1g）；BT 100N型蠕動(dòng)泵；TU－1901型紫外－可見分光光度計(jì)。

氯化鈉溶液：10.00mmol·L－1。

磷酸二氫鉀溶液：2.50mmol·L－1。

檸檬酸溶液：0.15mmol·L－1。

碳酸氫鉀溶液：15.00mmol·L－1。

氯化鎂溶液：1.50mmol·L－1。

氯化鈣溶液：1.50mmol·L－1。

人臣為“男為人臣”之“人臣”，謂奴隸。隸圉，亦奴隸，隸服雜役，圉養(yǎng)馬。襄公二十三年《傳》“斐豹，隸也，謂宣子曰：‘茍焚丹書，我殺督戎?！泵饧捶俚?，使為自由民。[8](P1614)

磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液：由0.2mol· L－1磷酸氫二鈉溶液4mL和0.1mol·L－1檸檬酸溶液16mL混合配制而成。

煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.00g·L－1，稱取煙堿標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0g置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容。

人工唾液：稱取10.00mmol·L－1氯化鈉溶液0.585 0g、2.40mmol·L－1磷酸氫二鈉溶液0.340 8g、2.50mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液0.340 0g、0.15mmol·L－1檸檬酸溶液0.028 8g、15.00mmol·L－1碳酸氫鉀溶液1.501 8g、1.50mmol·L－1氯化鎂溶液0.142 5g和1.50mmol·L－1氯化鈣溶液0.166 5g，加水1L溶解，并用12.5mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.7。

煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98.5%），其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙堿的溶出和收集

袋裝口含煙中煙堿等的溶出和收集裝置見圖1，主要包括唾液儲(chǔ)存瓶、恒流泵、溶出池、袋裝口含煙、收集管和支架等6個(gè)組件。將人工唾液加到溶媒存儲(chǔ)瓶中，設(shè)定恒溫槽溫度為37℃的人體溫度，人工唾液以流量2mL·min－1經(jīng)恒流泵至溶出池淋洗袋裝口含煙，口含煙中各種組分在溶出池內(nèi)溶出，通過(guò)流量控制器實(shí)現(xiàn)新鮮介質(zhì)即人工唾液不斷流入，釋放液不斷流出，模擬無(wú)煙氣煙草制品主要成分在口腔中的溶出－吸收的過(guò)程。流經(jīng)樣品的釋放液通過(guò)玻璃套管內(nèi)腔底部出口收集到收集瓶中，每1min收集一次，共收集15min，用人工唾液定容至50.0mL。

圖1 袋裝口含煙中煙堿的溶出和收集裝置Fig.1 Installation for dissoiution and collection of nicotine from BST

1.2.2 吸光度的測(cè)定

從收集的人工唾液中移取樣液1.00mL，加入pH 4.6的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液1.0mL，飽和甲基橙溶液1.0mL，搖勻，加入二氯甲烷4.0mL，渦旋1min后靜置15min，取下層萃取液，立即在分光光度計(jì)上于420nm處測(cè)量吸光度（A）。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 萃取劑

移取不同煙堿質(zhì)量濃度的樣品溶液各1.00mL，加入磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液1.0mL（pH分別為3.0，3.6，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8）和飽和甲基橙溶液1.0mL，搖勻，再加入4.0mL 萃取劑（二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷）渦旋1min，靜置，取有機(jī)層用紫外－可見分光光度法測(cè)量吸光度，結(jié)果見圖。

圖2 在不同煙堿質(zhì)量濃度和不同酸度條件下不同萃取溶劑的影響Fig.2 Effect of various extraction solvents under various mass concentrations of nicotine and various acidity

由圖2可知：對(duì)于相同質(zhì)量濃度的樣品在相同酸度條件下，二氯甲烷的萃取效果比三氯甲烷好，可能是因?yàn)槿燃淄槊芏容^大，渦旋時(shí)混勻效果不好。而正己烷極性太小，對(duì)煙堿－甲基橙絡(luò)合物萃取效果較差。試驗(yàn)選擇二氯甲烷為萃取劑。

2.1.2 緩沖溶液的酸度

試驗(yàn)考察了磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液的pH分別為3.0，3.6，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8，6.4時(shí)對(duì)絡(luò)合物吸光度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 緩沖溶液酸度對(duì)絡(luò)合物吸光度的影響Fig.3 Effect of acidity of butter solution on absorbance of the complex

由圖3可知：對(duì)于相同質(zhì)量濃度的樣品，煙堿甲基橙絡(luò)合物在pH 4.6的緩沖溶液中吸光度最大。試驗(yàn)選擇磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液的pH為4.6。

2.1.3 甲基橙的用量

試驗(yàn)考察了飽和甲基橙溶液的用量分別為0.5， 1.0，1.5，2.0mL時(shí)對(duì)絡(luò)合物吸光度的影響，結(jié)果表明：當(dāng)飽和甲基橙溶液用量為1.0mL時(shí)，絡(luò)合物的吸光度達(dá)到最大。試驗(yàn)選擇飽和甲基橙溶液的用量為1.0mL。

2.1.4 二氯甲烷的用量

試驗(yàn)考察了萃取劑二氯甲烷的用量分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL時(shí)對(duì)絡(luò)合物萃取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 二氯甲烷用量對(duì)絡(luò)合物萃取的影響Fig.4 Effect of amounts of CH2Cl2on extraction of the complex

由圖4可知：相同質(zhì)量濃度的樣品的吸光度隨萃取劑二氯甲烷用量的增加而減小。含量較高的樣品中加入2.0mL或3.0mL二氯甲烷后，萃取液中煙堿含量較高，吸光度過(guò)大，對(duì)儀器造成過(guò)載。而含量較低的樣品中加入5.0mL或6.0mL二氯甲烷后，萃取液中煙堿含量較低，吸光度過(guò)小，影響測(cè)定。故試驗(yàn)選擇萃取劑二氯甲烷的用量為4.0mL。

2.1.5 渦旋后靜置時(shí)間

按試驗(yàn)方法制備3個(gè)樣品萃取液，分別渦旋后靜置1，5，10，15，20，30，60min，然后取有機(jī)相測(cè)量吸光度。試驗(yàn)結(jié)果表明：若靜置時(shí)間較短，萃取不完全，測(cè)定值不穩(wěn)定；渦旋靜置15min后測(cè)定值趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇渦旋后靜置15min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別移取煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.05，0.25，0.50，2.50，5.00，7.50mL置于50mL棕色容量瓶中，用人工唾液定容，配制成1.00，5.00，10.0，50.0，100，150mg·L－1煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法測(cè)定。以煙堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。煙堿的質(zhì)量濃度在1.00～150mg·L－1之間與吸光度呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為y＝0.200 8 x＋0.150 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。采用低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣10次，以測(cè)定結(jié)果的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，方法的檢出限（3s）為0.08mg·L－1。

2.3 精密度與回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法制備樣品萃取液，取其中3份釋放液分別平行測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），并對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知：樣品溶液中煙堿的加標(biāo)回收率在97.3%～103%之間，說(shuō)明該方法可用于口含煙釋放液中煙堿含量的測(cè)定。

本工作建立了紫外－可見分光光度法快速測(cè)定袋裝口含煙體外釋放液中煙堿的含量。該方法具有較寬的線性范圍，較好的重復(fù)性以及較高的準(zhǔn)確度，且前處理簡(jiǎn)便快捷，所使用設(shè)備簡(jiǎn)易，可為更好地探索袋裝口含煙中煙堿的釋放規(guī)律提供方便。

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Determination of Nicotine in Simulated Saliva Dissolved from Bagged Smokeless Sucking Tobacco by UV－Vis Spectrophotometry

YUAN Da－lin，YANG Ji，TANG Jian－guo，YANG Liu，WU Jun，DUAN Yuan－xing，GONG Xiao－wei，CHEN Yong－kuan＊
（Technical Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming650231，China）

By the self－made installation，the main constituents of the bagged smokeless sucking tobacco（BST），including nicotine were dissolved into simulated saliva，which was collected as described.An aliquot of 1.00mL was taken from it for analysis，and 1.0mL of citric acid－disodium hydrogen phospate buffer solution（pH 4.6）together with 1.0mL of saturated methyl orange solution was added and mixed thoroughly to form a yellow colored complex with nicotine.4.0mL of dichloromethane was added to the solution，and the mixture was swirled for 1min and stood for 15min to have the nicotine－methylorange complex transferred into the organic phase.The lower organic phase was separated and its absorbance was measured at the wavelength of 420nm.Linear relationship between values of absorbance and mass concentration of nicotine was found in the range of 1.00－150mg·L－1with detection limit（3s）of 0.08mg·L－1.Test for recovery was made by standard addition method，giving results in the range of 97.3%－103%，with RSDs（n＝6）in the range of 0.86%－1.2%.

UV－Vis spectrophotometry；Nicotine；Bagged smokeless sucking tobacco；Simulated saliva

O657.32

A

1001－4020（2017）04－0377－04

10.11973／lhjy－h(huán)x201704002

2016－03－23

中國(guó)煙草總公司科技重大專項(xiàng)［110201401017（XX－05）］；云南中煙工業(yè)公司科技開發(fā)計(jì)劃（2015CP07）；袋裝口含型無(wú)煙煙草制品研發(fā)（JSZX2014CP06）

袁大林（1979－），男，湖南新化人，工程師，主要從事煙草化學(xué)研究。

＊通信聯(lián)系人。E－mail：cyk1966＠163.com