白 曼，孫麗敏，項露頡，賈 超，李佳蓉，姜懷志

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

睪丸發(fā)育與精子發(fā)生相關(guān)miRNAs的研究進展

白 曼，孫麗敏，項露頡，賈 超，李佳蓉，姜懷志*

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

miRNAs是一類廣泛存在于真核生物中參與調(diào)節(jié)不同生物過程的非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后特異結(jié)合mRNAs 3'非翻譯區(qū)降解靶mRNAs或抑制其翻譯，調(diào)控其表達。miRNAs對精子發(fā)生的細胞特異性調(diào)控，對調(diào)節(jié)雄性生殖具有重要意義。本文概述了miRNAs的生物合成、作用機制，特別是miRNAs對睪丸組織發(fā)育及精子發(fā)生的表達調(diào)控，旨在為進一步深入研究miRNAs在雄性生殖中的作用及分子調(diào)控機制提供參考。

miRNAs；生物合成；表達調(diào)控；睪丸發(fā)育；精子發(fā)生

miRNAs是一類長約19～24 nt具有調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于真核生物基因組，可通過特異結(jié)合mRNAs 3'非翻譯區(qū)調(diào)控靶基因表達。曾被認為是“基因組垃圾”的miRNA調(diào)控人類基因組1/3以上蛋白編碼基因，作為關(guān)鍵基因調(diào)控因子，參與細胞分化、增殖和凋亡等許多細胞過程，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因修飾作用，參與生長、發(fā)育、生殖和疾病產(chǎn)生等多種生物學代謝過程調(diào)控。Lee等[1]發(fā)現(xiàn)了第1個在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控線蟲胚胎發(fā)育的miRNA（lin-4）。Reinhart等[2]在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第2個具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)育功能的miRNA（let-7）。此后，研究人員相繼在線蟲、果蠅和人體發(fā)現(xiàn)上百種長度相似的小分子RNA，隨后又在動植物中鑒定出成百上千種與lin-4和let-7功能相似的miRNAs，并命名為microRNA（miRNA）。隨著對miRNA相關(guān)進化、生物合成、表達模式等功能和分子機制研究的深入，人們建立起miRNA登記、分類和命名規(guī)則，并構(gòu)建了miRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase）。

睪丸內(nèi)精子發(fā)生是一個復雜而精確的過程，精子發(fā)生過程的分子事件必須受到嚴格調(diào)控才能將遺傳信息及表觀信息正確地傳遞給下一代。研究表明，miRNA與睪丸發(fā)育及精子發(fā)生密切相關(guān)，且miRNA表達量隨著睪丸及精細胞的發(fā)育呈動態(tài)變化，miRNA表達異常會使睪丸發(fā)育和精子發(fā)生障礙，并導致雄性不育[3]。因此，深入了解調(diào)控睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的miRNA，對于找到精子發(fā)生調(diào)控靶點和治療雄性不育具有重要意義。

1 miRNA概述

1.1 miRNA生物合成與作用機制 真核生物miRNA合成大致需要經(jīng)歷幾個階段：pri-miRNA轉(zhuǎn)錄、pre-miRNA形成、pre-miRNA轉(zhuǎn)運、雙鏈miRNA產(chǎn)生及成熟，每一個生物過程都需要內(nèi)切酶的參與[4]。在典型的miRNA生物合成途徑中，核內(nèi)miRNA host基因首先在RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ參與下，轉(zhuǎn)錄形成具有較長莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，經(jīng)Drosha/DGRC（人）或Drosha-Pasha（果蠅）復合體加工形成大約70 nt具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的premiRNA。pre-miRNA通過exportion-5（核轉(zhuǎn)運蛋白受體）從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，并在細胞質(zhì)中被Dicer酶（RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶）剪切掉莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成19～24 bp的miRNA， 即miRNA*雙鏈體。其中一條miRNA鏈裝載到Argonaute（AGO）蛋白上保留下來形成成熟miRNA，稱為“Guide Strand”，即通常所說的miRNA；另一條鏈則被降解[5]，稱作“Passenger Strand”，也叫“*”鏈，常表示為“miR-×××*”，一般不容易檢測到。大部分miRNA是以這種形式形成的。另外，還有幾種非典型的miRNA合成途徑繞過Drosha對pri-RNA剪切，在上游加工過程中，通過套索去分支酶對Mirtron及加尾Mirtron尾部剪切，產(chǎn)生直接適合于Dicer剪切的發(fā)夾狀pre-RNA，或由shRNA及加尾shRNA在未知核酶作用下產(chǎn)生Dicer能剪切的發(fā)夾狀pre-mRNA。之后進入細胞質(zhì)中與典型miRNA形成過程相同（miRNA的典型和非典型合成途徑見圖1）。通過典型合成途徑產(chǎn)生的miRNA主要來自于pri-miRNA 5'臂，而經(jīng)過非典型合成途徑產(chǎn)生的miRNA主要來自于Mirtron 3'臂[6]。

結(jié)合AGO蛋白的成熟miRNA與蛋白因子復合物結(jié)合形成RNA誘導沉默復合物（RISC）后，通過堿基互補配對原則識別靶mRNA 3'UTR，大部分miRNA通過RNA降解及翻譯抑制2種作用機制發(fā)揮調(diào)控作用。當miRNA與靶mRNA 3'UTR完全互補時，可使靶mRNA降解，植物中大部分miRNA是這種作用機制；當miRNA與靶mRNA 3'UTR不完全互補時，可使靶mRNA翻譯抑制，如大多數(shù)動物miRNA通過翻譯抑制發(fā)揮作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，5′UTR區(qū)和編碼區(qū)同樣也可作為miRNA作用靶點，此時，miRNA 主要在翻譯起始階段發(fā)揮抑制作用，如通過與翻譯起始復合物競爭mRNA 5′UTR區(qū)7-甲基-鳥嘌呤帽子結(jié)構(gòu)，或影響核糖體大小亞基聚合抑制靶基因翻譯；miRNA亦能在翻譯起始后減緩核糖體在翻譯中的移動速度或促進核糖體提早解離等抑制翻譯，miRNA還可通過RISC結(jié)合在靶mRNA上改變mRNP結(jié)構(gòu)和功能，從而促進mRNA的剪切或降解[8]。

圖1 miRNA的生物合成過程[9]

1.2 miRNA命名 隨著研究發(fā)展，越來越多miRNA被發(fā)現(xiàn)，為使miRNA能夠被清楚識別而不被混淆，科學家制定了幾種命名方法，最早用“-s”（sence）和 “-as”（ antisence）來對先導鏈（-s）和*號鏈（-as）命名，以代表RNA雙鏈體形成過程的正向和反向，但容易混淆，在較早的文獻中容易見到這種命名方式，現(xiàn)已被取消。后來用“Guide Strand（先導鏈）”和“Passenger Strand（*）”分別命名2條鏈，*號鏈表達量特別低，所以經(jīng)常被認為沒有功能[10]。但自2011年開始，研究發(fā)現(xiàn)miRNA的*號鏈也有功能，且功能可能比先導鏈更強大。于是產(chǎn)生了新的命名方法，即根據(jù)miRNA產(chǎn)生于pre-miRNA 5'臂或3'臂而將其命名為miR-×××-5p或miR-×××-3p。miRNA成熟體一般簡寫為miR，miRNA前體則用mir表示。采用3～4個字母代表miRNA來源物種名縮寫，阿拉伯數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)先后順序，高度同源miRNA 在數(shù)字后加上英文小寫字母(a，b，c， …)。以hsamiR-199a-1-5p（也叫hsa-miR-199a-1*）為例，hsa表示miRNA來源于人，miR表示miRNA成熟體，199表示第199個被發(fā)現(xiàn)的miRNA，a表示miRNA在高度同源中編號為a，1表示miRNA在1號染色體上形成，5p表示miRNA來自于前體miRNA 5’臂。

目前，miRNA命名中有先導鏈和*號鏈2種，而表達量很低的*號鏈到底有何作用，是不是很關(guān)鍵，還需要大量研究證明。miRNA生物合成、作用機制及命名規(guī)則也會隨著研究的新發(fā)現(xiàn)而更新。

2 睪丸發(fā)育相關(guān)調(diào)控miRNA

miRNA廣泛表達于各種組織和細胞，且許多miRNA表達模式是固定的，但miRNA表達具有組織特異性和物種特異性。睪丸是哺乳動物產(chǎn)生精子和分泌雄激素的特殊組織，其中精子發(fā)生很大程度上受到miRNA調(diào)控，對睪丸中miRNA研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA在睪丸及生殖細胞（精原細胞，精母細胞及精子）中特異表達。研究人員通過高通量測序、基因芯片與qRT-PCR等方法已篩選鑒定出人、鼠、山羊等動物睪丸及生殖細胞特異表達的miRNA，以及miRNA在人、鼠、豬、狗、果蠅等睪丸中的表達譜，并篩選出不同發(fā)育階段睪丸差異表達miRNA，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段睪丸miRNA表達模式明顯不同（表1）。睪丸miRNA表達階段特異性表明，miRNA對調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育和精子發(fā)生具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，不同時期附睪上皮和不同附睪區(qū)域miRNA表達也存在差異，新生兒附睪檢測到有127種miRNA表達，而成年人和老年人附睪分別只檢測到3種和2種miRNA[11]。牛附睪頭和附睪尾上皮細胞分泌的囊泡中也含有不同miRNA[12]?？梢?，miRNA對附睪內(nèi)精子成熟也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。睪丸miRNA的差異表達見表1。生物技術(shù)的不斷發(fā)展將有助于發(fā)現(xiàn)更多睪丸中特異性表達miRNA，研究miRNA的物種特異性和睪丸階段特異性有助于解析miRNA在睪丸發(fā)育、成熟和精子發(fā)生中的調(diào)控作用。

表1 在睪丸中表達的miRNA

3 精子發(fā)生相關(guān)調(diào)控miRNA

精子發(fā)生是一個發(fā)生在睪丸曲細精管中由精原干細胞增殖分化，形成精子的復雜、精確而連續(xù)過程，主要分為3個階段：精原細胞分化形成初級精母細胞；初級精母細胞經(jīng)歷兩次連續(xù)減數(shù)分裂形成圓形精子細胞；圓形精子細胞分化變形為成型精子，釋放到曲精細管管腔后，轉(zhuǎn)移至附睪中成熟、儲存。精子發(fā)生過程中，每種細胞都會產(chǎn)生高度有序且特異的轉(zhuǎn)錄組表達譜，因此，在精原細胞有絲分裂、精母細胞減數(shù)分裂及圓形精子單倍體化和后期精子變形過程都有大量特異基因參與調(diào)控。miRNA通過調(diào)控靶基因表達來調(diào)控精子發(fā)生中有絲分裂、減數(shù)分裂及減數(shù)分裂后期過程，且miRNA以細胞特異方式參與調(diào)控精子發(fā)生各個階段。如：miR-221/ miR222可通過抑制c-KIT基因表達抑制精原細胞分化，使精原細胞處于有絲分裂狀態(tài)[23]。在精原干細胞、減數(shù)分裂前細胞及減數(shù)分裂細胞（初級精母細胞）中特異表達的miRNA分別有17、11和13個，其中miR-221（精原干細胞特異表達）、miR-203（減數(shù)分裂前細胞特異表達）和miR-34b-5（初級精母細胞特異表達）的靶基因分別是 c-KIT、 RBM44和 CDK6，三者協(xié)同互作調(diào)控精子發(fā)生[24]。

3.1 miRNA對精原干細胞的調(diào)節(jié) 精原干細胞具有自我更新和分化形成精原細胞的雙重特性，精子發(fā)生就是從精原干細胞開始，精原干細胞增殖和分化平衡是保證其能產(chǎn)生足夠精原細胞從而確保終身提供精子的前提，miRNA在精原干細胞自我更新和分化過程中起到重要調(diào)節(jié)作用。精原干細胞分化是一個涉及維甲酸信號調(diào)控的過程。miR17-92簇、miR290-295簇、miR146、miR20、 miR21、miR106a、 miR106b、miR221和miR222 在富含THY1未分化的精原細胞中高表達，而在體內(nèi)外維甲酸誘導的精原細胞分化過程中均顯著下調(diào)，表明這些miRNA參與調(diào)控精原干細胞的增殖和分化。維甲酸抑制miR17-92簇和miR-106b表達，從而上調(diào)BIM、KIT、SOCS3和STAT3基因表達，調(diào)節(jié)精原干細胞分化，且miR17-92簇和miR-106b可通過協(xié)調(diào)互作調(diào)節(jié)精子發(fā)育，即當雄性生殖細胞中miR17-92簇缺失，miR-106b表達量會顯著下調(diào)。miR-let-7家族成員（a/b/d/e/g/）可通過調(diào)節(jié)IGF1信號通路促進精原細胞分化[25]；miR20 和miR106a通過下調(diào)靶基因STAT3和CCND1表達促進精原干細胞自我更新[26]。對精原干細胞起調(diào)節(jié)作用的miRNA詳細見表2。

3.2 miRNA對減數(shù)分裂和精子形成的調(diào)控 減數(shù)分裂和精子形成是雄性生殖細胞特有過程。減數(shù)分裂階段包括染色體復制、重組和精母細胞2次連續(xù)減數(shù)分裂；精子形成階段即精子細胞分化形成精子，這2個階段中均有大量miRNA參與精子發(fā)生表達調(diào)控。miR449 和miR34b/miR34c，通過抑制NOTCH1和DA2L基因表達影響生殖細胞分化和存活，miR-34c在粗線期精母細胞和圓形精子細胞中高表達，通過抑制ATF1基因表達影響B(tài)CL-2/ BAX基因表達，促進小鼠雄性生殖細胞凋亡。影響減數(shù)分裂和精子發(fā)生的miRNA見表3。

3.3 miRNA與精子發(fā)生障礙 精子發(fā)生障礙包括無精子癥、少弱精子癥、生殖細胞瘤等睪丸疾病引起的睪丸發(fā)育異常和精子發(fā)生紊亂。利用基因芯片和RT-PCR技術(shù)的研究表明，許多miRNA（如miR-449b、miR-34b、miR-517c、miR-181c和 miR-605等）在弱精子癥或少精子癥患者睪丸中表達量與正常男性明顯不同，miR-122、miR-34c-5p、miR-146-5p、miR-374b等在無精子癥患者睪丸中表達量明顯下降，但在少弱精子癥患者睪丸中表達量有所升高[42]。和正常男性相比，非梗阻性無精子癥患者精清中miR-141（靶基因CBL和TGFβ2）、miR-7-1-3P（靶基因RBL和PIK3R3）及miR-429表達量均明顯高于正常男性精清中的表達量[43]。miR-383（靶基因 FMRP ）在精子成熟受阻患者睪丸中表達量下降[44]。精子發(fā)生障礙不僅與miRNA表達異常相關(guān)，還與miRNA合成異常相關(guān)。miRNA合成受到關(guān)鍵蛋白Dicer1、DGCR8、Drosha和AGO影響。特異性滅活雄性生殖細胞中Dicer1和DGCR8基因會使減數(shù)分裂過程發(fā)生變化，增加生殖細胞凋亡，破壞精子成熟過程，造成雄性不育[45]。雄性生殖細胞早期，Drosha缺失會使減數(shù)分裂細胞和減數(shù)分裂后細胞發(fā)生異常，導致雄性不育，AGO4富集在精母細胞核上，決定著精母細胞從有絲分裂向減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)變，AGO4缺失會抑制雄性生殖細胞減數(shù)分裂Ⅰ階段某些miRNA的表達[46]。

表2 調(diào)控精原干細胞增殖和分化的miRNA

表3 影響減數(shù)分裂和精子發(fā)生的miRNA

由此可見，miRNA是睪丸發(fā)育和精子發(fā)生不可或缺的調(diào)控因子，通過靶向抑制關(guān)鍵基因表達來調(diào)控精原干細胞分化、精母細胞減數(shù)分裂、精細胞變形及精子成熟。在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中，每一個環(huán)節(jié)都不僅僅只有一種、一簇或一個家族的miRNA參與，某些功能相關(guān)miRNA還具有補償效應。miRNA表達異常與合成變異均可導致精子發(fā)生低下、受阻及雄性不育。因此，探索睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中的特異miRNA及其調(diào)控功能，對于進一步找到精子發(fā)生調(diào)控靶點，治療雄性不育具有重要意義。

4 小 結(jié)

正常睪丸發(fā)育和精子發(fā)生是提高動物精液產(chǎn)量和獲得高品質(zhì)精液的基礎(chǔ)和前提，是雄性動物生殖健康和正常生育能力的保障。miRNA通過轉(zhuǎn)錄后降解靶基因mRNA或抑制靶基因翻譯，對睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中有絲分裂、減數(shù)分裂以及精子變形階段都具有重要調(diào)控作用。雖然部分miRNA 調(diào)控功能已經(jīng)得到確定，但還有許多miRNA功能尚不清楚，且miRNA在雄性生殖系統(tǒng)中的作用機制尚不十分明確，進一步篩選出睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的調(diào)控miRNA，并揭示其調(diào)控機制，不僅能為提高公畜精液品質(zhì)提供新途徑，還能為男性不育提供新的診療方法。因此，在未來的研究中，應著眼于睪丸發(fā)育和精子發(fā)生階段特異性表達 miRNA，重點開展miRNA表達分析和功能驗證等研究，進一步探索出miRNA與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的相關(guān)性，找出睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的調(diào)控靶點。

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Research Progress on miRNAs in Testis Development and Spermatogenesis

BAI Man, SUN Li-min, XIANG Lu-jie, JIA Chao, LI Jia-rong, JIANG Huai-zhi*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

miRNAs are a class of non-coding small RNA, which are widely existed in eukaryotes and involved in regulating different biological processes. miRNAs can degrade the target gene or inhibit the gene translation by targeting 3’UTR of mRNAs at the post transcriptional level to regulate the expression of gene. The cell specific regulation of miRNAs in spermatogenesis is important to regulate male reproduction. This article reviewed the biosynthesis, mechanism and especially the expressions of miRNAs in testis development and spermatogenesis, which provides a reference for further research on the role and molecular regulation mechanism of miRNAs in male reproduction.

miRNAs; Biosynthesis; Expression regulation; Testis development; Spermatogenesis

R321.1

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-004

2016-11-15；

2017-03-10

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20160204018NY）

白曼(1990-)，女，遼寧營口人，博士研究生，研究方向為綿山羊遺傳育種與繁殖，E-mail：1070598730@qq.com * 通訊作者：姜懷志，E-mail：jianghz6806@126.com