馬志杰，胡雙龍，李瑞哲，陳生梅，雷初朝，晁生玉

（1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧 810016；2.青海省格爾木市烏圖美仁鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，青海格爾木816000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；4.青海省海西州動物疫病預(yù)防控制中心，青海德令哈 817099）

柴達(dá)木黃牛Y染色體單倍型組構(gòu)成及父系起源
——基于USP9Y基因多態(tài)性的分析

馬志杰1*，胡雙龍2，李瑞哲1，陳生梅1，雷初朝3，晁生玉4

（1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧 810016；2.青海省格爾木市烏圖美仁鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，青海格爾木816000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；4.青海省海西州動物疫病預(yù)防控制中心，青海德令哈 817099）

為從分子水平上探究柴達(dá)木黃牛的父系遺傳多樣性、起源及群體遺傳結(jié)構(gòu)，對62頭柴達(dá)木黃牛公牛進行Y染色體USP9Y基因多態(tài)性分析。結(jié)果表明：柴達(dá)木黃牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物顯示471 bp和552 bp 2種帶型，其中552 bp帶型不能被SspI酶酶切，這2種帶型對應(yīng)Y1和Y2 2種普通牛Y染色體單倍型組，表明柴達(dá)木黃牛含有Y1和Y2 2個父系支系，有2個普通牛父系起源。單倍型多樣度為0.3369，說明柴達(dá)木黃牛具有較低的父系遺傳多樣性。

柴達(dá)木黃牛；Y染色體；USP9Y；多態(tài)性；單倍型組；父系起源

柴達(dá)木黃牛是我國優(yōu)良的地方黃牛品種之一，主產(chǎn)于青海省柴達(dá)木盆地邊緣的都蘭縣、烏蘭縣和格爾木市轄區(qū)等2 600～3 200 m高海拔地區(qū)。柴達(dá)木黃牛具有較強的抗逆性和適應(yīng)能力，可為該地區(qū)蒙、藏少數(shù)民族提供乳、肉主要畜產(chǎn)品和役力，在遺傳方面是一個寶貴的基因庫[1]。目前，有關(guān)柴達(dá)木黃牛遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳背景的研究相對較少。在生化水平上，張才駿等[2]對柴達(dá)木黃牛14個血液和乳生化遺傳標(biāo)記進行了系統(tǒng)分析，結(jié)果表明11個標(biāo)記存在多態(tài)性，平均基因雜合度為0.2677，平均有效等位基因數(shù)為1.4792個。隨后，張才駿等[3]探究了柴達(dá)木黃牛與我國其他黃牛品種/群體之間的遺傳關(guān)系，對血紅蛋白（HB）、運鐵蛋白（TF）、后運鐵蛋白（PTF）、后白蛋白（PA）和堿性磷酸酶（ALP）5個血液基因座進行了分析，發(fā)現(xiàn)柴達(dá)木黃牛與青海東部黃牛存在最近的親緣關(guān)系，與北方牛系蒙古牛、延邊牛和安西牛具有較近的親緣關(guān)系，而與其他黃牛品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在分子水平上，目前尚未見對柴達(dá)木黃牛品種的父系遺傳多樣性、起源及群體遺傳結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究報道。

動物Y染色體遵循父系遺傳，單倍型完整，突變率低，不易受重組和回復(fù)突變等因素影響，是探明父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史等研究的理想工具[4]。近年來，眾多關(guān)于家牛Y染色體SNPs標(biāo)記（Y-SNPs）的研究表明[5-14]，家牛由3種Y染色體單倍型組組成（即普通牛Y1和Y2單倍型組以及瘤牛Y3單倍型組）。與此同時，Bonfiglio等[10]基于Y染色體USP9Y（Y-linked Ubiquitin-specific Protease 9）基因內(nèi)含子26上1個81 bp的插入和1個限制性酶切位點的結(jié)合，發(fā)展出一種不用測序而只通過PCR和酶切電泳就可以直接鑒別這3種單倍型組的方法?；诖?，本研究利用USP9Y基因PCR和酶切電泳技術(shù)結(jié)合直接測序方法對柴達(dá)木黃牛進行Y染色體單倍型組及父系起源分析，以期弄清柴達(dá)木黃牛的父系遺傳多樣性、起源和群體遺傳結(jié)構(gòu)，為今后開展該品種的保種、選育策略制定和分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取 在青海省格爾木市烏圖美仁鄉(xiāng)（34頭）、都蘭縣宗加鎮(zhèn)（20頭）和烏蘭縣柯柯鎮(zhèn)（8頭）共采集62頭柴達(dá)木黃牛公牛血樣或耳組織帶回實驗室，采用基因組DNA提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取基因組DNA，稀釋終濃度至25～50 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增 參照Bonfiglio等[10]報道的普通牛USP9Y基因序列合成1對引物，其中上游引物（PF）：5'-AAACCCTTCAAGG TAATAAAACAAAA-3'，下游引物（PR）：5'-CACAGCTCCTCAAAACCAGA -3'，由生工（上海）有限公司合成。

25 μL PCR體系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海寶生物公司) 10.5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，模板DNA（25～50 ng/μL）1 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，57℃退火15 s，72℃延伸10 s，35個循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（含Gold View核酸染料）電泳后，凝膠成像系統(tǒng)分析檢測。

1.3 PCR產(chǎn)物的電泳檢測和酶切分析 先對PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后根據(jù)其帶型情況，對部分PCR純化產(chǎn)物用SspI限制性內(nèi)切酶再進行酶切分析，判定其單倍型組。其中20 μL SspI酶切體系：SspI酶（12 U/μL）1 μL，10×SspI Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，超純水7 μL。37℃酶切8～10 h，后對酶切結(jié)果進行電泳檢測。

1.4 序列測定及比對分析 根據(jù)酶切結(jié)果，對不同單倍型組個體PCR純化產(chǎn)物用3730XL型DNA測序儀（Applied Biosystems公司）進行正、反向測序，測序結(jié)果用Chromas 2.3軟件進行核實和校正，得到每頭柴達(dá)木黃牛公牛的USP9Y基因序列。后用BioEdit 7.0.9軟件[15]進行序列比對分析，以確認(rèn)是否與酶切分析結(jié)果一致，用Arlequin 3.11軟件[16]進行序列變異分析并計算群體單倍型多樣度，多樣度用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴達(dá)木黃牛USP9Y 基因擴增多態(tài)性與SspI 酶酶切分析 如圖1所示，62頭黃牛PCR產(chǎn)物均獲得預(yù)期的大小片段，有471 bp和552 bp 2種PCR產(chǎn)物，其中13頭黃牛的PCR產(chǎn)物為471 bp，49頭黃牛的PCR產(chǎn)物為552 bp。依據(jù)Bonfiglio等[10]的判定標(biāo)準(zhǔn)，確定這13頭黃牛（471 bp）為普通牛Y1單倍型組，剩余49頭黃牛尚不能確定屬于普通牛Y2單倍型組還是瘤牛Y3單倍型組，隨后進行SspI酶酶切分析，結(jié)果表明這49頭黃牛的PCR產(chǎn)物都不能被SspI酶切開，與其PCR產(chǎn)物帶型、大小完全相同（圖1），因此確定這49頭黃牛均為普通牛Y2單倍型組。

圖1 柴達(dá)木黃牛USP9Y基因PCR產(chǎn)物多態(tài)性及酶切電泳

圖2 柴達(dá)木黃牛Y1和Y2兩種單倍型組序列比對分析

2.2 柴達(dá)木黃牛不同Y染色體單倍型組頻率統(tǒng)計 由表1可知，62頭黃牛中所含Y1和Y2單倍型組個體分別為13和49個，所占頻率依次為0.21和0.79，表明柴達(dá)木黃牛品種由2種普通牛Y染色體單倍型組構(gòu)成，以Y2單倍型組為主。

表1 柴達(dá)木黃牛單倍型組頻率及單倍型多樣度

2.3 柴達(dá)木黃牛不同Y染色體單倍型組序列比對分析及單倍型多樣度 通過對62頭柴達(dá)木黃牛公牛USP9Y基因部分序列進行測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與酶切結(jié)果完全一致，Y1和Y2單倍型組個體數(shù)分別為13頭和49頭，其中13頭Y1單倍型組個體的序列完全相同（471 bp），剩余49頭Y2單倍型組個體的序列也完全相同（552 bp）。2種單倍型組序列（GenBank登錄號：KY495786～KY495787）表現(xiàn)為81 bp的序列插入和1個496A＞C核苷酸顛換的差異（圖2）。柴達(dá)木黃牛品種單倍型多樣度為0.3369（表1），表明其父系遺傳多樣性較低。

3 討 論

在先前對中國部分黃牛品種的父系遺傳研究中，常振華等[9]基于Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記對16個中國地方黃牛品種284頭公牛進行了父系遺傳多樣性及起源分析，結(jié)果在16個黃牛品種中僅發(fā)現(xiàn)普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組，未發(fā)現(xiàn)存在普通牛Y1單倍型組，其中Y2單倍型頻率在北方黃牛中占優(yōu)勢（98.3%），Y3單倍型頻率在南方黃牛中占優(yōu)勢（76.1%），中原黃牛中普通牛Y2的單倍型頻率（63.8%）比瘤牛Y3（36.2%）高。Li等[12-13]基于USP9Y基因多態(tài)標(biāo)記以及Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記進一步對常振華等[9]研究的16個中國地方黃牛品種302頭公牛進行綜合分析，結(jié)果與其研究結(jié)果一致，同時，該研究發(fā)現(xiàn)哈薩克、秦川、吉安3個黃牛品種除以Y2或Y3單倍型組為主外，還含有少量普通牛Y1 單倍型組個體。基于對一些西方肉牛品種的父系遺傳分析[7-8,10-13]（如Holstein、Aberdeen Angus等品種）和中國20世紀(jì)80年代以來的黃牛育種改良的實踐[1]，Li等[12-13]推測哈薩克、秦川和吉安3個黃牛品種中所含有的頻率較低的Y1單倍型組可能主要來自引進的黃牛品種。隨后，Yue等[14]對25頭蒙古黃牛公牛進行分子遺傳分析，表明蒙古黃牛由Y2單倍型組構(gòu)成。在本研究中，對62頭柴達(dá)木黃牛進行父系遺傳分析表明酶切結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，說明利用USP9Y基因酶切檢測技術(shù)能夠準(zhǔn)確快速、經(jīng)濟可靠的確定黃牛品種內(nèi)部的Y染色體單倍型組構(gòu)成，從而揭示其群體父系遺傳結(jié)構(gòu)。本研究顯示，柴達(dá)木黃牛由普通牛Y1和Y2單倍型組構(gòu)成，以Y2單倍型組為主，提示柴達(dá)木黃牛由2個父系支系組成，有2個父系起源，這與常振華等[9]、Li等[12-13]、Yue等[14]的研究結(jié)果基本一致，說明柴達(dá)木黃牛作為中國北方黃牛品種之一，具有與中國北部、中部黃牛品種相似的父系遺傳組成，即以Y2普通牛單倍型組為主。同時，與大部分中國黃牛品種相比也存在一定差異，不僅由Y2單倍型組構(gòu)成，還包括一定的Y1單倍型組個體，父系遺傳基礎(chǔ)較廣。柴達(dá)木黃牛在20世紀(jì)50年代后經(jīng)歷了秦川牛、荷斯坦牛、西門塔爾牛等品種的人工授精改良實踐[1]，可能由于這些牛品種雄性介導(dǎo)的基因滲入，導(dǎo)致柴達(dá)木黃牛含有與部分中國黃牛品種（如哈薩克、秦川、吉安黃牛品種）相似的Y1單倍型組[12-13]，形成較寬泛的父系遺傳基礎(chǔ)和起源。

在生化水平上，張才駿等[2]對柴達(dá)木黃牛14個血液和乳生化遺傳標(biāo)記分析表明，多態(tài)性遺傳標(biāo)記基因座達(dá)78.6%，平均基因雜合度（0.2677）和有效等位基因數(shù)（1.4792個）都較高，提示該品種在生化水平上具有較高程度的多態(tài)性和較大的遺傳變異；根據(jù)HB、TF、PTF、PA和ALP 5個基因座的資料，分析表明柴達(dá)木黃牛的平均基因雜合度（0.3770）和有效等位基因數(shù)（1.61）與蒙古牛（分別為0.3874和1.63）、復(fù)州牛（分別為0.3857和1.63）相似，低于絕大部分中原牛（分別為0.4262～0.4886和1.68～1.96）。而在分子水平上，Li等[12]對16個中國地方黃牛品種的父系遺傳多樣性分析表明，各品種單倍型多樣度在0.000～0.600，平均值為0.518；其中北方黃牛、中部黃牛和南方黃牛的單倍型多樣度平均值分別為0.164、0.416和0.312。在本研究中，62頭柴達(dá)木黃牛單倍型多樣度為0.3369，可以看出，該值低于部分國外牛品種的單倍型多樣度平均值0.422[11]，同時也低于Li等[12]報道的結(jié)果，但稍高于北方黃牛和南方黃牛的單倍型多樣度平均值，表明柴達(dá)木黃牛單倍型多樣度相對較低，這可能與柴達(dá)木黃牛在本研究父系遺傳檢測中不含瘤牛血統(tǒng)以及所處地理位置偏僻、牛群多為封閉性選育等因素相關(guān)。同時，也提示柴達(dá)木黃牛分子水平和生化水平上的遺傳多樣性研究結(jié)果稍有差異。柴達(dá)木黃牛和我國中部黃牛品種相比父系分子遺傳多樣性水平較低，可能與中部黃牛大多具有普通牛和瘤牛父系遺傳血統(tǒng)而多樣性水平較高有關(guān)[9,12-13]。當(dāng)然，有關(guān)柴達(dá)木黃牛分子水平上的遺傳多樣性狀況和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析還有待通過線粒體基因組和核基因組（包括Y染色體STR標(biāo)記和常染色體）遺傳信息從不同角度進行綜合系統(tǒng)研究，進而準(zhǔn)確地揭示其遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)，為其選育和保種提供基礎(chǔ)材料。

[1] 國家畜禽遺傳資源委員會.中國畜禽遺傳資源志·牛志[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011:198-200.

[2] 張才駿, 王勇, 盧福山, 等. 柴達(dá)木黃牛生化遺傳標(biāo)記的研究[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志, 2001, 31(6):3-5.

[3] 張才駿, 張海峰, 晃生玉. 柴達(dá)木黃牛與我國其它品種黃牛親緣關(guān)系的探討[J]. 中國畜牧雜志, 2001, 37(6):9-11.

[4] Cortez D, Marin R, Toledo-Flores D, et al. Origins and functional evolution of Y chromosomes across mammals[J]. Nature, 2014, 508(7497): 488-493.

[5] G?therstr?m A, Anderung C, Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J]. P Roy Soc Lond B Bio, 2005, 272: 2345-2351.

[6] Bollongino R, Elsner J, Vigne J D, et al. Y-SNPs Do notindicate hybridisation between european aurochs and domestic cattle[J]. PLoS One, 2008, 3(10):e3418.

[7] Ginja C, Telod G L, Penedo M C. Y chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J]. J Hered, 2009, 100(2):148-157.

[8] Pérez-Pardal L, Royo L J, Beja-Pereira A, et al. Y-specific microsatellites reveal an African subfamily in taurine (Bos taurus) cattle [J]. Anim Genet, 2010, 41(3): 232-241.

[9] 常振華. 中國黃牛Y染色體微衛(wèi)星和SNPs遺傳多樣性與起源研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2011.

[10] Bonfiglio S, De G A, Tesfaye K, et al. A novel USP9Y polymorphism allowing a rapid and unambiguous classification of Bos taurus Y chromosomes into haplogroups[J]. Anim Genet, 2012, 43(5):611-613.

[11] Edwards C J, Ginja C, Kantanen J, et al. Dual origins of dairy cattle farming-evidence from a comprehensive survey of European Y-chromosomal variation[J]. PLoS One, 2012, 6(1):e15922.

[12] Li R, Xie W M, Chang Z H, et al. Y chromosome diversity and paternal origin of Chinese cattle[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(12):6633-6636.

[13] Li R, Zhang X M, Campana M G, et al. Paternal origins of Chinese cattle[J]. Anim Genet, 2013, 44(4):446.

[14] Yue X, Li R, Liu L, et al. When and how did Bos indicus introgress into Mongolian cattle? [J]. Gene, 2014, 537(2):214-219.

[15] Hall T A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/ NT [J]. Nucl Acids Symp Ser, 1999, 41(41):95-98.

[16] Excoffier L, Laval G, Schneider S. Arlequin ver. 3.11: An integrated software package for population genetics data analysis[J]. Evol Bioinform, 2005, 1: 47-50.

Y Chromosome Haplogroups and Paternal Origin of Qaidam Cattle: Based on the Polymorphism Analysis of USP9Y Gene

MA Zhi-jie1*, HU Shuang-long2, LI Rui-zhe1, CHEN Sheng-mei1, LEI Chu-zhao3, CHAO Sheng-yu4
(1. Academy of Animal Science and Veterinary Medicine, Qinghai University, Qinghai Xining 810016, China; 2. Station of Animal Science and Veterinary Medicine of Wutumeiren town in Golmud city of Qinghai province, Qinghai Golmud 816000, China; 3.College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Shaanxi Yangling 712100, China; 4. Animal Epidemic Disease Prevent and Control Center in Haixi Autonomous Prefecture of Qinghai province, Qinghai Delingha 817099, China)

To explore the paternal diversity, population genetic structure and origin of Qaidam cattle, the polymorphism of Y chromosome USP9Y gene in 62 Qaidam cattle males was analyzed. The results showed that the size of PCR products of Qaidam cattle USP9Y gene was 471 bp and 552 bp respectively, and the 552 bp PCR products can’t be digested by SspI. Therefore, the above two belt types represent Y1 and Y2 cattle haplogroups, respectively, indicating that Qaidam cattle have two patrilineal branches with two paternal origins. The haplotype diversity of Qaidam cattle was 0.3369, suggesting that the Qaidam cattle have lower paternal genetic diversity.

Qaidam cattle; Y chromosome; USP9Y; Polymorphism; Haplogroups; Paternal origin

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-036

2016-09-06；

2017-03-06

青海省自然科學(xué)基金（面上）項目（2017-ZJ-906）；青海省“高端創(chuàng)新人才千人計劃”項目；國家自然科學(xué)基金項目（31360267）；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（2015-ZJ-712）；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-38）

馬志杰（1978-），男，甘肅張家川人，博士研究生，副研究員，主要從事動物遺傳資源研究，E-mail: zhijiema@126. com

* 通訊作者