劉婷婷，梁梓強，梁安文，郭技星，李廣宏，王方海

(中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室//昆蟲學研究所，廣東 廣州510275)

靶向家蠶絲素重鏈基因的鋅指蛋白結構域的人工構建*

劉婷婷，梁梓強，梁安文，郭技星，李廣宏，王方海

(中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室//昆蟲學研究所，廣東 廣州510275)

將多個可特異識別并結合DNA的鋅指單體串聯在一起即可構成鋅指蛋白結構域，若將其與不同的功能域因子融合，則會構建出有很多用途的人工蛋白分子，從而實現對基因組的各種定點修飾或調控。以家蠶絲素重鏈基因為研究對象，首先利用Zinc Finger Tools軟件篩選到了一個合適的靶標位點，再采用模塊組裝技術，通過酶切、片段回收、連接、轉化等步驟成功將多個鋅指單體串聯在一起，構建出一對靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點的由4個鋅指單體組成的鋅指蛋白結構域，這為將來定點修飾或改造家蠶絲素基因，進一步提高蠶絲質量和產量，以及大幅度提升家蠶生物反應器對外源蛋白的表達能力打下了良好的基礎。

家蠶；絲素重鏈基因；鋅指蛋白

鋅指是構成鋅指蛋白(ZFP)結構域的基本單元，為廣泛存在于多種蛋白質中的蛋白基序，可特異介導蛋白質與核酸或其它蛋白質的相互作用。將多個可特異識別并結合DNA的鋅指單元串聯在一起后即構成ZFP。若將ZFP與鋅指激活因子(Zinc finger activator)、 鋅指抑制因子(Zinc finger repressor)、鋅指核酸甲基化酶(Zinc finger methylase)、鋅指核酸酶等不同的功能結構域融合，可構建出有很多用途的人工蛋白分子，從而實現對基因組的各種定點修飾或調控[1]。其中鋅指核酸酶的研究報道較多，由于其可通過鋅指蛋白和特定DNA位點結合，從而將核酸酶帶入該部位，對附近的DNA鏈進行酶解切割，從而可達到誘導DNA特定位點的雙鏈斷裂，大大提高同源重組的發(fā)生概率等。該技術因其具有高效和特異性的特點而受到廣泛關注和研究，已經在多種物種(如果蠅、線蟲、斑馬魚、大鼠等)中得到應用，近年來已經有多篇研究成果在Nature，Science，Nature Biotechnology等雜志上發(fā)表[2-4]。

ZFP結構域通常由3～6個C2H2類型的鋅指重復單元串聯而成，其基本骨架大多來自人或小鼠的天然鋅指蛋白ZIF268。通常每個鋅指可直接特異識別和結合DNA雙螺旋中某一條單鏈上的3個連續(xù)核苷酸(一個三聯子)，而由多個鋅指串聯形成的ZFP 結構域則可識別更長的靶標序列，同時也大大增加了DNA靶向修飾的特異性[1]。

家蠶是一種重要的經濟昆蟲，其可吐絲結繭，為絲綢原料的重要來源，同時家蠶也是世界上研究較多的一種高效的生物反應器[5]，如能對其絲素基因進行修飾或改造，我們就有可能進一步提高蠶絲質量和產量，也就有可能對家蠶生物反應器進行更好的改造升級。因此本研究主要報道我們課題組以家蠶絲素重鏈基因為研究對象，采用模塊組裝技術成功構建出靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點的一對由4個鋅指單元組成的ZFP。

1 材料和方法

1.1 質粒和酶

用于組裝鋅指蛋白(ZFP)結構域的所有質粒均源自美國Addgene公司的Modular Assembly Kit v1.0試劑盒，本實驗中所使用的酶都是購自TaKaRa公司。

1.2 構建方法

主要采用模塊組裝方法，具體參考文獻[6]，本實驗以家蠶絲素重鏈基因為研究對象，首先利用網上Zinc Finger Tools軟件(http://www.scripps.edu/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php)確定靶基因上合適的位點，獲得的位點為6個核苷酸的間隔序列，在其左右各含有4個三聯子組，再分別從現有的試劑盒中尋找含有能夠與各三聯子結合的鋅指質粒，通過酶切、連接等步驟組裝成可特異結合上述連續(xù)4個三聯子組序列的ZFP。

1.3 活性檢測

通過細菌雙雜交(B2H)系統(tǒng)，在攜帶有靶位點DNA序列的報告基因表達體系中檢測報告基因表達的強弱來判定ZFP的活性。

2 結果與分析

2.1 靶標位點的確定

我們選取了家蠶絲素重鏈基因為研究對象，該基因的詳細結構可參閱Zhou等[7]文獻，利用網上Zinc Finger Tools軟件篩選到了一個合適的靶標位點，在絲素重鏈基因AF226688中，這個靶標位點位于65 461到65 520之間。具體為間隔序列6個核苷酸，左右各由4個三聯子組組成，每個三聯子對應于一個可以與之結合的鋅指單體，這樣可以構建一對由4個鋅指單體組成的鋅指蛋白結構域，可與該段序列特異結合，如果在末端加上FokI，則可構成鋅指核酸酶，能夠特意切斷該靶標序列，為了便于后面的表述，我們將準備構建的能夠與這對由4個三聯子組組成的序列特異結合的鋅指蛋白結構域分別命名為F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b，其中每一個F代表一個鋅指單體，如圖1所示。

圖1 篩選到的靶標位點序列和擬構建的一對與之可特定結合的由4個鋅指單體組成的鋅指蛋白結構域Fig.1 The sequence of target sites and the zinc finger protein domain formed by 4 zinc finger units

2.2 鋅指蛋白結構域的人工構建

首先分別選取對應于F1a、F2a、F1b、F2b的質粒進行酶切，用AgeⅠ和BamHⅠ酶切對應于F1a和F1b的質粒，獲得相應的線形質粒框架，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切對應于F2a和F2b的質粒，獲得相應的相對分子質量在100左右的鋅指單體，分別純化線形質?？蚣芎弯\指單體，再經過連接轉化、挑選陽性克隆檢測等步驟，即可獲得含有F1aF2a和F1bF2b兩個鋅指單體的質粒，圖2為具體酶切的電泳圖。用同樣的方法可獲得含有F1aF2aF3a和F1bF2bF3b 3個鋅指單體的質粒，圖3為分別選取4個克隆細胞進行酶切鑒定的電泳圖，均含有一個300 bp左右的條帶，說明3個鋅指單體連接成功。接著再用同樣的方法可獲得含有F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b 4個鋅指單體的質粒，圖4為分別選取4個克隆細胞進行酶切鑒定的電泳圖，其中共有6個樣品均含有一個400 bp左右的條帶，說明4個鋅指單體連接成功。

圖2 帶有相應鋅指單體質粒的酶切電泳圖Fig.2 The enzyme electrophoresis of plasmid with corresponding zinc finger unitsF1az、F2az、F1bz、F2bz代表相應的質粒；S為DNA Marker；用AgeⅠ和BamHⅠ酶切F1az和F1bz，可見到特別明亮的線形質?？蚣軛l帶，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切F2az和F2bz，可見到100 bp左右的鋅指單體條帶

圖3 構建含有F1aF2aF3a和F1bF2bF3b3個鋅指單體的陽性克隆電泳鑒定圖Fig.3 Identification of cell clones containing three zinc finger F1aF2aF3a or F1bF2bF3b by electrophoresisS為DNA Marker；1、2、3、4和(1)、(2)、(3)、(4)分別代表挑選的4個克隆，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切，均可獲得300 bp左右的條帶，表明F1aF2aF3a和F1bF2bF3b 3個鋅指單體均連接成功

圖4 構建含有F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b4個鋅指單體的陽性克隆電泳鑒定圖Fig.4 Identification of cell clones containing four zinc finger F1aF2aF3aF4a or F1bF2bF3bF4b by electrophoresisS為DNA Marker；1、2、3、4和(1)、(2)、(3)、(4)分別代表挑選的4個克隆，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切，各有3個克隆獲得400 bp左右的條帶，表明F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b 4個鋅指單體連接成功

2.3 活性檢測

構建好的2個鋅指蛋白結構域F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b，與標靶位點的結合能力，主要是通過細菌雙雜交系統(tǒng)來檢測的[8]，首先分別構建好相應的質粒，然后共同轉進細菌細胞內，進行共表達，最后觀測計算出待測樣品的半乳糖苷酶的活性強度，從而確定構建好的鋅指蛋白結構域與靶標位點的結合能力。由表1可知，鋅指蛋白結構域F1aF2aF3aF4a的半乳糖苷酶的活性單位為10.527，與對照的比值為1.484，活性相對較高；而鋅指蛋白結構域F1bF2bF3bF4b的半乳糖苷酶的活性單位為8.726，與對照的比值為1.16，活性相對較低。

表1 鋅指蛋白結構域活性分析結果Table 1 The analysis results of zinc finger protein domain activity

3 討 論

蜘蛛絲用途非常廣泛，但資源緊缺，故人們一直嘗試使用生物技術的方法改造其它生物體來生產蜘蛛絲,可惜進程緩慢[9], 目前雖能將蜘蛛絲基因導入家蠶中生產出蜘蛛絲纖維[10]，然而產量太低，原因是家蠶本身要合成大量蠶絲蛋白，占用了體內過多的氨基酸資源。如文中所描述，我們已成功構建出一對靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點的由4個鋅指單體組成的ZFP，在此基礎上我們擬將其與FokⅠ核酸酶功能域融合，使其成為靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點的鋅指核酸酶[11]，再結合基因打靶方法[12]敲掉家蠶絲素重鏈基因，從而提高轉入的蜘蛛絲基因的表達產量，一旦獲得成功，不但能解決蜘蛛絲纖維資源緊缺的問題，且經濟意義重大。

[1] 肖安，胡瑩瑩，王唯曄，等. 人工鋅指核酸酶介導的基因組定點修飾技術 [J]. 遺傳，2011，33(7)：665-683. XIAO A, HU Y Y, WANG W Y, et al. Progress in zinc finger nuclease engineering for targeted genome modification[J]. Hereditas, 2011，33(7)：665-683.

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Artificial construction of zinc finger protein domain targetingBombyxmorifibroin heavy chain gene

LIUTingting,LIANGZiqiang,LIANGAnwen,GUOJixing,LIGuanghong,WANGFanghai

(State Key Laboratory for Biocontrol and Institute of Entomology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Many zinc finger units, which can specifically recognize and bind to DNA, are strung together to form zinc finger protein domain. There are many uses to artificially construct the protein molecules, such as various site modification or regulation of the genome, by its integration with the different functional domains of active factors. This study focused on fibroin heavy chain gene of silkworm. Firstly, a suitable target site was found using Zinc Finger Tools software, and then we used module assembled technology to construct a pair of four zinc finger domain targeting the specific site of fibroin heavy chain gene, through restriction enzyme digesting, fragment recycling, linking, transforming, and other steps. The results would provide a good foundation for the fixed-point modification or reconstruction of fibroin genes to improve silk quality and production, or to greatly enhance the expression of exogenous protein in the bioreactor ofBombyxmori.

silkworm; fibroin heavy chain gene; zinc finger protein

2016-08-10 基金項目：廣東省科技計劃項目(2014A010107009)

劉婷婷(1991年生)，女；研究方向：生物工程；E-mail：377085590@qq.com

王方海(1965年生)，男；研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：lsswfh@mail.sysu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.001

Q965

A

0529-6579(2017)02-0001-04