陳莎莎, 王穎, 魏大能, 薛紅

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075)

電針重置超前性光暗周期轉(zhuǎn)移小鼠的節(jié)律特征及其對(duì)SCN內(nèi)相關(guān)鐘基因表達(dá)的影響*

陳莎莎, 王穎, 魏大能, 薛紅

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075)

為了探索電針重置超前性光暗周期轉(zhuǎn)移模型小鼠的時(shí)相特征及視交叉上核(Suprachiasmaticnucleus,SCN)多種節(jié)律相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，將符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的44只C57BL/6J小鼠完全隨機(jī)分為空白組(n=10)、模型組(n=12)、捆綁組(n=12)和電針組(n=10)4組。其中，模型組、捆綁組和電針組運(yùn)用超前性光暗周期轉(zhuǎn)移法進(jìn)行造模，連續(xù)10 d。造模結(jié)束后，模型組小鼠于ZT18時(shí)相點(diǎn)處死取材；電針組小鼠恢復(fù)正常光暗交替(Light and Dark，LD)狀態(tài)，并于ZT16時(shí)相點(diǎn)選取“肝俞”和“至陽(yáng)”穴進(jìn)行電針治療，連續(xù)3次，每天1次；捆綁組采用與電針組相同的方法進(jìn)行平行捆綁。捆綁及治療結(jié)束后，處死動(dòng)物并剝?nèi)CN，采用PCR Array檢測(cè)各組動(dòng)物SCN內(nèi)節(jié)律相關(guān)基因及部分節(jié)律相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①電針重置晝夜節(jié)律結(jié)果：造模后，模型組、捆綁組及電針組與造模前比較峰相位、起始活動(dòng)時(shí)間均顯著超前，晝夜活動(dòng)節(jié)律周期縮短(P<0.05)；再同步期，電針組峰相位、起始活動(dòng)時(shí)間后移，與造模期及空白組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；再同步第1天及第2天電針組小鼠的晝夜活動(dòng)節(jié)律周期與空白組和造模前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，再同步第3天與空白組和造模前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。② SCN節(jié)律相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子變化：與空白組比較，模型組小鼠的SCN節(jié)律相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)8個(gè)(Aanat、Crx、Epo、Nkx2-5、Pax4、Prf1、Rora、Stat5a)，下調(diào)4個(gè)(Egr1、Per1 、Per3、Prokr2) ；與模型組比較，捆綁組節(jié)律相關(guān)基因上調(diào)3個(gè) (Esrra、Mat2a、Per3)，下調(diào)11個(gè)(Cartpt、Crx、Epo、Kcnma1、Mtnr1b、Nkx2-5、Nms、Pax4、Prf1、Prkacb、Prkca)；與模型組比較，電針組節(jié)律相關(guān)基因上調(diào)6個(gè)(Egr1、Esrra、Mat2a、Per1、Per3、Prokr2)，下調(diào)21個(gè)(Aanat、Arntl、Cartpt、Crx、Csnk1e、Epo、Kcnma1、Mtnr1b、Myod1、Nkx2-5、Nms、Opn3、Pax4、Prf1、Prkacb、Prkca、Prkcb、Prokr2、Rora、Rorb、Slc9a3、Tgfb1)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示電針可縮短超前性光暗周期轉(zhuǎn)移小鼠的晝夜節(jié)律重置時(shí)間，加速紊亂晝夜節(jié)律的恢復(fù)，這可能是通過(guò)對(duì)SCN內(nèi)Per1、Egr1、Aanat、Prokr2等節(jié)律相關(guān)基因的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的。

電針；超前性光暗周期轉(zhuǎn)移；節(jié)律；SCN；鐘基因

節(jié)律是與人體生理病理狀態(tài)密切相關(guān)的基本生命現(xiàn)象，無(wú)論是整體還是組織細(xì)胞都保持周期接近24 h的節(jié)律性活動(dòng)，穩(wěn)定有序的晝夜節(jié)律的是維持機(jī)體健康的重要條件之一。一旦外環(huán)境的時(shí)間信息發(fā)生急性轉(zhuǎn)移或長(zhǎng)期處于倒轉(zhuǎn)時(shí)相的工作和休息制度后, 就會(huì)導(dǎo)致各種生理節(jié)律紊亂，從而引發(fā)一系列疾病。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明疾病的發(fā)生發(fā)展與晝夜節(jié)律紊亂密切相關(guān)。如跨時(shí)區(qū)飛行、輪班工作制度，以及環(huán)境、溫度、光照、噪聲等引起的節(jié)律紊亂不僅僅表現(xiàn)出睡眠-覺(jué)醒周期改變，還會(huì)表現(xiàn)出食欲欠佳、腹痛腹脹等消化道癥狀，疲勞乏力，注意力下降、精力不集中，工作效率低下等。早有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，針灸具有明確的調(diào)整生物節(jié)律作用，能夠調(diào)整慢性疲勞綜合征[1-3]、荷乳腺癌小鼠自發(fā)性活動(dòng)節(jié)律[4]，改善嗎啡成癮小鼠晝夜節(jié)律[5]，調(diào)節(jié)抑郁小鼠體溫及褪黑激素節(jié)律[6]等，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，尤其是對(duì)SCN的調(diào)節(jié)作用。隨著時(shí)間生物學(xué)的研究日趨深入，人體的節(jié)律系統(tǒng)及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制也日趨完善，其中Clock、Arntl、Cry1 和Cry2、CK1e、Per1、Per2和Per3、一對(duì)孤兒核受體Rev-Erba和RORa等節(jié)律基因構(gòu)成了最基本的轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)反饋調(diào)節(jié)部分[7]。而這些節(jié)律基因及其表達(dá)產(chǎn)物間形成了晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄/ 翻譯反饋環(huán)路，參與調(diào)控機(jī)體晝夜節(jié)律。然而，SCN節(jié)律相關(guān)基因研究重點(diǎn)關(guān)注基因主要集中在Per、Cry、Arntl等基因，其它節(jié)律相關(guān)基因是否參與電針重置生物鐘基因調(diào)節(jié)，目前尚未深入研究。本課題將C57BL/6J 近交系小鼠復(fù)制成超前性光暗周期轉(zhuǎn)移模型，從行為學(xué)、分子生物學(xué)等角度研究SCN節(jié)律相關(guān)基因參與電針重置紊亂節(jié)律作用機(jī)制，以探討電針對(duì)節(jié)律相關(guān)基因的調(diào)控作用，為針灸調(diào)整節(jié)律紊亂臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用同批次12～14周齡的 C57BL/6J 近交系小鼠。為避免雌性動(dòng)物動(dòng)情周期對(duì)節(jié)律可能造成的影響干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故統(tǒng)一選用雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：scxk(京)2009-0017。本次實(shí)驗(yàn)方案獲得了成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要器械和儀器

①小動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)自動(dòng)記錄系統(tǒng)：成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；②Clocklab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)：ACT-500，美國(guó) Clocklab 公司；③基因擴(kuò)增儀：mastercycler epgradient-5341，德國(guó)埃普多夫公司；④FLUKO F6/10超細(xì)勻漿機(jī)：德國(guó)FLUKO公司；⑤Eppendorf Centrifuge離心機(jī)：5417R，德國(guó)Eppendorf公司；⑥Thermo Scientific微量紫外分光光度計(jì)：Nano drop 2000，美國(guó)Thermo公司 ；⑦Themal Cycle熱循環(huán)儀：C1000，美國(guó)伯樂(lè)公司；⑧數(shù)顯雙列四孔水浴鍋：HH-S4，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器；⑨韓式穴位神經(jīng)刺激儀：YZB/蘇0362-2007，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限責(zé)任公司；⑩華佗牌無(wú)菌針灸針(0.25 mm×13 mm)：標(biāo)準(zhǔn)號(hào)GB2024-1994，蘇州醫(yī)療用品有限公司。

1.3 主要試劑

①RNeasy Mini Kit(50)：RNA提取試劑盒(No.74104)，德國(guó)Qiagen公司；②RNase Free DNase Set：去除基因組DNA，德國(guó)Qiagen公司；③RT2 First Stand Kid(50)：逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(No.330404)，德國(guó)Qiagen公司；④RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix(24)：德國(guó)Qiagen公司；⑤RT2 Profiler PCR Array盤(pán)：PAMM-153ZA，德國(guó)Qiagen公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物篩選

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間生物學(xué)測(cè)試室隔離單元鼠籠中，并放入隔離單元內(nèi)，鼠籠底部鋪干燥清潔級(jí)墊料，鼠籠內(nèi)含轉(zhuǎn)輪可供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由活動(dòng)。隔音、避光、恒溫[(23±1)℃]、通風(fēng)、相對(duì)濕度60%±5%，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水(全價(jià)顆粒鼠飼料由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供)，光-暗控制下連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)3 d，其平均轉(zhuǎn)輪次數(shù)大于10 000次/d的動(dòng)物合格留用。

2.2 動(dòng)物分組

利用SPSS 17.0軟件產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字將篩選出的44只動(dòng)物分為空白組(n=10)、模型組(n=12)、電針組(n=10)、捆綁組(n=12)4組。

2.3 動(dòng)物馴化

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)先LD馴化同步，即06:00-18:00光照，18:00-次日06:00暗置，使動(dòng)物的轉(zhuǎn)輪活動(dòng)與外界正常的光暗周期同步，光暗馴化10 d。馴化10 d后開(kāi)始造模。

2.4 造模方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)過(guò)10 d光暗周期同步后參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，將模型組、捆綁組、電針組動(dòng)物進(jìn)行10 d的超前性光暗周期轉(zhuǎn)移(Advances of light/dark cycle)，即每2 d提前8 h開(kāi)燈，連續(xù)5次，持續(xù)改變光照制度10 d后節(jié)律紊亂模型建立成功。律紊亂模型的標(biāo)準(zhǔn)為：起始活動(dòng)時(shí)間與關(guān)燈時(shí)間的相位偏移超過(guò)1 h[9]。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程將分為3個(gè)組成部分，分別是：LD光暗周期同步10 d為同步期(Entrained)即造模前；采用超前性光暗周期轉(zhuǎn)移方法造節(jié)律紊亂模型10 d為造模期；造模完成后光暗周期恢復(fù)到造模前光照條件，并根據(jù)不同組別給予相應(yīng)干預(yù)手段，此時(shí)間段為再同步期(Re-entrained)。

2.5 干預(yù)方法

1)空白組：不造模。持續(xù)采用光暗交替LD光照制度，不予其他處理，自由進(jìn)食飲水。

2)模型組：僅造模。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)D同步后開(kāi)始造模，采用超前性光暗周期轉(zhuǎn)移的常規(guī)方法，每2 d提前8 h開(kāi)燈，循環(huán)5次，持續(xù)改變光照制10 d，復(fù)制成節(jié)律紊亂動(dòng)物模型。

3)捆綁組：造模不電針。造模成功后，于動(dòng)物起始活動(dòng)點(diǎn)后4 h，即ZT16，將動(dòng)物固定于自制固定器上，以平衡捆綁刺激造成的影響。捆綁組動(dòng)物每次捆綁固定時(shí)間與電針組捆綁時(shí)間相同15 min。捆綁完成后將動(dòng)物放回籠內(nèi)，自由進(jìn)食飲水。

4)電針組：造模并電針。造模成功后，于ZT16時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物固定于自制固定器上，固定后進(jìn)行電針操作，參照余曙光主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]小鼠穴位定位圖，選取動(dòng)物兩側(cè)“肝俞”和“至陽(yáng)”穴位[11]進(jìn)行針刺，“肝俞”左右兩側(cè)穴位交替使用，每次取單側(cè)，“至陽(yáng)”每次均進(jìn)行針刺，肝俞穴連接正極，至陽(yáng)穴連接負(fù)極。針刺后按照說(shuō)明書(shū)要求連接韓式電針儀HANS-200，選擇電針儀經(jīng)針模式，頻率2/15 Hz，電流0.2 mA，每次電針15 min，電針每日1次，連續(xù)電針3次。電針后將動(dòng)物放回籠內(nèi)，自由進(jìn)食飲水。

選穴依據(jù)：①陰陽(yáng)消長(zhǎng)節(jié)律是人體生理節(jié)律的基本形式，“陽(yáng)主動(dòng)”，調(diào)節(jié)陽(yáng)氣即可調(diào)整人體的活動(dòng)狀態(tài)。②督脈總督一身之陽(yáng)氣，6條陽(yáng)經(jīng)均與之交會(huì)，為陽(yáng)脈之海，調(diào)一經(jīng)可達(dá)調(diào)全身陽(yáng)氣之功。③至陽(yáng)為督脈陽(yáng)氣隆盛之處，有振奮全身陽(yáng)氣，疏通經(jīng)血，安各五臟，攻補(bǔ)兼施之功。④肝俞為肝經(jīng)俞穴，中醫(yī)理論為為，背俞穴是臟腑之氣輸注于背腰部的腧穴，與臟腑有密切關(guān)系。肝癌病位在肝，治療肝臟相關(guān)疾病，選穴肝俞，體現(xiàn)了“腧穴所在，主治所及”的局部選穴原則。

2.6 行為學(xué)數(shù)據(jù)采集方法

使用成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制的小動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)記錄系統(tǒng)和美國(guó)Clocklab 生物節(jié)律數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)自動(dòng)監(jiān)測(cè)和記錄每只動(dòng)物的自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律數(shù)據(jù)。Clocklab生物節(jié)律數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)作出觀察周期內(nèi)動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)直方圖、周期、起始活動(dòng)時(shí)間點(diǎn)、峰相位。對(duì)動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律相關(guān)參數(shù)進(jìn)行造模前后、干預(yù)前后對(duì)比分析。動(dòng)物從LD馴化期第1-10天代表同步期，第11-20天代表造模期，第21-23天為再同步期。

2.7 樣本采集

動(dòng)物第3次電針(或捆綁固定)后2 h處死動(dòng)物，參考George Paxinos[12]小鼠大腦立體定位圖譜，以視交叉為標(biāo)志，切取其腦部視交叉上核組織塊，放入無(wú)菌凍存管內(nèi)并迅速放至-80 ℃冰箱保存。

2.8 PCR Array法檢測(cè)各組動(dòng)物SCN內(nèi)生物鐘基因的表達(dá)

2.8.1 RNA提取 ①SCN組織加入600 μL裂解液；②勻漿1 min后離心，14 000 r/min，3 min，吸上清；③加入φ=70%乙醇，600 μL，混勻并離心，12 000 r/min，1 min，吸上清；④加入350 μL RW1并離心，12 000 r/min，1 min；⑤棄下液，加入DNase 80 μL/份室溫靜置15 min；⑥加RW 1 350 μL，離心，12 000 r/min，1 min；⑦棄下液，加入500 μL RPE，離心，12 000r/min，1 min；⑧棄下液，加入500 μL RPE，離心，12 000 r/min，2 min；⑨離心，14 000 r/min，1 min；⑩保留吸附柱，加30 μL RNA Free water，離心，12 000 r/min，1 min；棄吸附柱，保留離心管；Nano drop 2 000微量紫外分光光度計(jì)分析純化測(cè)定RNA質(zhì)量濃度及質(zhì)量。當(dāng)RNA質(zhì)量濃度>125 ng/μL時(shí)，測(cè)定260 nm/280 nm的吸光度比值，數(shù)值為1.8～2.1者留用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.8.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA ① 將RT2 First Stand Kid試劑盒中試劑短離心15 s；②按照表1配置基因組DNA去除反應(yīng)物，混勻后短離心；③將基因組DNA去除反應(yīng)放入熱循環(huán)儀，42 ℃保溫5 min，5 min后迅速置于冰上至少1 min；④配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，如表2；⑤混勻步驟②④反應(yīng)物；⑥放入熱循環(huán)儀，42 ℃，15 min；95 ℃，5 min；⑦每個(gè)反應(yīng)中加入91 μL RNase-free water，混勻。

表1 基因組DNA去除反應(yīng)物配置表Table 1 Genomic DNA elimination mix

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)配置表Table 2 Reverse-transcription mix

2.8.3 配制PCR Array反應(yīng)體系(避光) ①RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix短離心15 s；②放入42 ℃恒溫水浴鍋，1 min；③室溫，靜置15 min；④配制PCR反應(yīng)混合物：RT2 SYBR Green ROX 1 350 μL；cDNA合成反應(yīng)物 102 μL；無(wú)RNA酶純凈水1 248 μL；總體積2 700 μL，混勻；⑤取出RT2 Profiler PCR Array盤(pán)，每孔加入25 μL PCR Array反應(yīng)物。

2.8.4 進(jìn)行Real-Time PCR 反應(yīng) PCR儀溫度條件：95 ℃，1 min，循環(huán)數(shù)1；95 ℃，15 s，循環(huán)數(shù)40；60 ℃，1 min，循環(huán)數(shù)40，95 ℃，15 s，循環(huán)數(shù)1；60 ℃，1 min，循環(huán)數(shù)1；95 ℃，15 s，循環(huán)數(shù)1；溫度變化速率調(diào)整為35%。

2.9 PCR Array數(shù)據(jù)采集方法

PCR 反應(yīng)完成后，設(shè)置熒光閾值190，基線范圍為3～15，導(dǎo)出數(shù)據(jù)整理為Excel表格格式。利用RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5檢測(cè)PCR Array結(jié)果質(zhì)量：①基因組DNA污染≥35，說(shuō)明染色組DNA污染很少，不會(huì)影響到基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，數(shù)據(jù)可用。②PCR重復(fù)性對(duì)照：每塊RT2 Profiler PCR Array的CTPPC的均值在20±2者合格。③計(jì)算ΔCT值：AVG CTRTC-AVGCTPPC≤5，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄沒(méi)有收到明顯抑制，數(shù)據(jù)合格。

在PCR Array 數(shù)據(jù)分析頁(yè)面，導(dǎo)入CT值數(shù)據(jù)后開(kāi)始進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。軟件根據(jù)2-ΔΔCT方法自動(dòng)計(jì)算Fold change結(jié)果。

2.10 數(shù)據(jù)分析方法

2.10.2 RT2 Profiler PCR Array數(shù)據(jù)分析方法 在RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5數(shù)據(jù)分析頁(yè)面有CT值均值，2△△CT值，倍數(shù)變化值(Fold-change)，以及P值等數(shù)據(jù)結(jié)果分析。其中倍數(shù)變化值及P值將用于之后的數(shù)據(jù)分析以及圖形分析。變化倍數(shù)表示與對(duì)照組比較的表達(dá)倍數(shù)改變，倍數(shù)變顯示基因表達(dá)上調(diào)、下調(diào)倍數(shù)。CT值均值表示每組動(dòng)物每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)預(yù)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)的平均數(shù)，倍數(shù)變化值2-△△CT也就是PCR的相對(duì)定量，與對(duì)照組相比較，倍數(shù)變化大于2倍。

3 結(jié) 果

3.1 節(jié)律紊亂模型建立

造模后，利用Clocklab計(jì)算出動(dòng)物每天的峰相位時(shí)間，并分別計(jì)算出造模前、后峰相位以及峰相位轉(zhuǎn)移時(shí)間。結(jié)果表明，空白組造模前后相位偏移值小于1 h，模型組造模前后相位偏移均大于1 h，依據(jù)節(jié)律紊亂模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)：起始活動(dòng)時(shí)間與關(guān)燈時(shí)間的相位偏移超過(guò)1 h[9]，判定造模成功(見(jiàn)表3，圖1)。

圖1 動(dòng)物造模自發(fā)性活動(dòng)直方圖Fig.1 The actograme of phase advanced mice

3.2 電針對(duì)節(jié)律紊亂小鼠自發(fā)性活動(dòng)節(jié)律的影響

3.2.1 電針對(duì)節(jié)律紊亂小鼠自發(fā)性活動(dòng)峰相位的影響 造模前各組動(dòng)物峰相位比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模后模型組、捆綁組、電針組峰相位均顯著超前，與各組造模前及空白組峰相位比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。捆綁組再同步時(shí)期峰相位較該組造模時(shí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，電針組峰相位后移與造模時(shí)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果表明節(jié)律紊亂小鼠峰相位超前，自然恢復(fù)可使峰相位逐漸恢復(fù)，但電針干預(yù)可顯著加速峰相位恢復(fù)速度(表4)(為同時(shí)觀察造模對(duì)SCN節(jié)律相關(guān)基因改變，模型組小鼠造模第10天于ZT18時(shí)相點(diǎn)處死取材，故無(wú)模型組再同步期數(shù)據(jù)，下同)。

h

組別n同步造模再同步空白組1021.99±0.921.98±2.3221.93±0.69模型組1221.75±1.348±5.33#Δ捆綁組1220.99±2.349.5±4.92#Δ11.66±8.24#Δ電針組1020.87±3.119.98±5.35#Δ15.9±7.17#Δ*

1)#：與空白組比較(P<0.05)；Δ：與造模前比較(P<0.05)；*與造模時(shí)比較(P<0.05)

3.2.2 電針對(duì)節(jié)律紊亂小鼠自發(fā)性活動(dòng)起始活動(dòng)時(shí)間的影響 造模前各組動(dòng)物起始活動(dòng)時(shí)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模后模型組、電針組、捆綁組起始活動(dòng)時(shí)間顯著提前，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。電針組再同步時(shí)期起始活動(dòng)時(shí)間點(diǎn)較造模時(shí)顯著延遲(P<0.05)，而捆綁組相較造模和再同步起始活動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明節(jié)律紊亂小鼠起始活動(dòng)時(shí)間提前，自然恢復(fù)不能顯著改善超前的起始活動(dòng)時(shí)間，電針能顯著恢復(fù)節(jié)律紊亂小鼠的起始活動(dòng)時(shí)間(表5)。

3.2.3 電針對(duì)節(jié)律紊亂小鼠自發(fā)性活動(dòng)周期的影響 造模前各組動(dòng)物周期比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模后模型組、捆綁組、電針組周期均顯著縮短，與造模前及空白組周期比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。捆綁組再同步3 d周期與空白組和造模前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。電針組再同步第1天及第2天周期與空白組和造模前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，再同步第3天與空白組和造模前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說(shuō)明節(jié)律紊亂小鼠周期縮短，自然恢復(fù)不能顯著恢復(fù)其周期，電針可促進(jìn)節(jié)律紊亂小鼠周期恢復(fù)(表6)。

h

1) 與空白組比較，#P<0.05；與造模前比較ΔP<0.05；與造模時(shí)比較，*P<0.05

h

1)與空白組比較，#P<0.05；與造模前比較，ΔP<0.05

綜上所述，電針在調(diào)整節(jié)律紊亂小鼠峰相位、起始活動(dòng)時(shí)間及周期的作用優(yōu)于捆綁組。電針可顯著使超前的峰相位后移，提前的起始活動(dòng)時(shí)間恢復(fù)，縮短的周期恢復(fù)至造模前水平。

3.3 各組SCN節(jié)律相關(guān)基因及節(jié)律相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的變化

本實(shí)驗(yàn)將測(cè)定84個(gè)SCN節(jié)律相關(guān)基因，其中包括節(jié)律基因，節(jié)律相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，感光蛋白，環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號(hào)分子(cAMP- response element binding protein signaling , CREB)等。與空白組比較，模型組造模后小鼠生物鐘相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的有8個(gè)，下降的有4個(gè)基因(見(jiàn)圖2)；造模后8個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)锳anat、Crx、Epo、Nkx2-5、Pax4、Prf1、Rora和Stat5a，8個(gè)上調(diào)基因中捆綁組有5個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)(Crx、Epo、Nkx2-5、Pax4和Prf1)，電針干預(yù)后，有7個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)(除Stat5a)；4個(gè)模型組表達(dá)下調(diào)的基因(Egr1、Per1 、Per3和Prokr2)，在自然恢復(fù)后，僅有一個(gè)表達(dá)上調(diào)(Per3)，而電針后均顯著上調(diào)(見(jiàn)圖3、圖4)。

圖2 超前性光暗周期轉(zhuǎn)移后SCN節(jié)律相關(guān)基因及節(jié)律相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的變化Fig.2 Different clock-related gene expression in the SCN between control and phase advanced mice

圖3 自然恢復(fù)后SCN內(nèi)部分生物鐘基因及節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的影響Fig.3 Different clock-related gene expression in the SCN between natural recovery and phase advanced mice

圖4 電針干預(yù)后節(jié)律紊亂小鼠SCN內(nèi)部分生物鐘基因及節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的變化Fig.4 Different clock-related gene expression in the SCN between EA and phase advanced mice

4 討 論

晝夜節(jié)律是一種最常見(jiàn)的生命節(jié)律現(xiàn)象，主要包括入睡和睡眠-覺(jué)醒[13]，體溫[14]，血壓[15]，激素分泌[16]，消化液分泌[17]以及免疫應(yīng)答[18]等。而這種正常的節(jié)律模式是生命活動(dòng)正常進(jìn)行的基礎(chǔ)，正是因?yàn)槿梭w的節(jié)律系統(tǒng)與外環(huán)境節(jié)律保持同步，才能夠維持機(jī)體生命活動(dòng)的正常有序。一旦這種節(jié)律同步活動(dòng)被打破，很容易引發(fā)或者加重一系列節(jié)律紊亂相關(guān)疾病。電針作為一種外源性授時(shí)因子，可以促進(jìn)節(jié)律紊亂的恢復(fù)。在本研究中，超前性光暗周期轉(zhuǎn)移小鼠的時(shí)相特征主要表現(xiàn)為節(jié)律超前，而電針在節(jié)律紊亂小鼠重置晝夜節(jié)律地過(guò)程中起到良性調(diào)整作用。與捆綁組比較，電針組顯著增強(qiáng)了節(jié)律紊亂小鼠晝夜節(jié)律地恢復(fù)效率，加快了峰相位恢復(fù)速度、起始活動(dòng)時(shí)間重置速度和自發(fā)性活動(dòng)周期的恢復(fù)。由此可知，電針能夠作為一種加速因素使機(jī)體重置到外部環(huán)境的節(jié)律影響因子存在。

下丘腦的視交叉上核是節(jié)律系統(tǒng)的核心振蕩器，也稱(chēng)之為“主鐘”(master clock)，副鐘廣泛分布于組織、器官中[19]，環(huán)境中光照信號(hào)對(duì)節(jié)律的調(diào)整就是通過(guò)SCN而實(shí)現(xiàn)的。SCN約20 000個(gè)擁有自主節(jié)律周期的細(xì)胞構(gòu)成，即使單個(gè)細(xì)胞也展現(xiàn)出代謝率和基因表達(dá)的高度節(jié)律性。SCN對(duì)節(jié)律的調(diào)控是通過(guò)對(duì)節(jié)律相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物間形成的晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)路進(jìn)行的。其中，周期基因1(Period gene 1，Per1)是周期基因家族成員之一，在視交叉上核調(diào)控生物節(jié)律，節(jié)律紊亂會(huì)導(dǎo)致Per1基因表達(dá)下降。而電針可能通過(guò)上調(diào)節(jié)律紊亂小鼠SCN內(nèi)Per1生物鐘基因的表達(dá)從而影響整個(gè)生物鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路，使其節(jié)律調(diào)控功能恢復(fù)平衡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)紊亂性節(jié)律的調(diào)整作用；早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因1(early growth response-1，Egr1)，屬于即刻早期基因家族，是哺乳動(dòng)物節(jié)律相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，Egr1通過(guò)參與細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶( Cyclin-dependent kinases , CDKs)參與細(xì)胞周期調(diào)控[20]，并且與Per1與Per2密切相關(guān)，節(jié)律紊亂后Egrl表達(dá)水平降低，且在電針后明顯升高，可能也是電針調(diào)整生物節(jié)律的分子機(jī)制之一。芳基烷化胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase，Aanat)是催化乙?；饔玫难逅?，在褪黑激素合成過(guò)程中是一個(gè)最主要的限速酶，與睡眠相位后移癥候群顯著相關(guān)[21]。本實(shí)驗(yàn)觀察了電針對(duì)節(jié)律紊亂小鼠SCN內(nèi)Aanat水平，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)節(jié)律紊亂小鼠SCN內(nèi)Aanat表達(dá)與空白組小鼠比較顯著升高，針刺后明顯降低，而捆綁組無(wú)顯著變化。這一結(jié)果表明電針干預(yù)小鼠相較自然恢復(fù)小鼠而言能抑制Aanat的表達(dá)，這可能是電針通過(guò)抑制節(jié)律紊亂小鼠SCN內(nèi)Aanat這一褪黑激素限速酶表達(dá)從而提高褪黑激素的分泌而較快的使紊亂的節(jié)律恢復(fù)至正常水平的分子機(jī)制之一；前動(dòng)力蛋白受體2(Prokineticin receptor 2，Prokr2)屬于蛋白編碼基因，是SCN節(jié)律輸出因子。Prokr2 mRNA在SCN上的表達(dá)具有節(jié)律性，Prokr2的節(jié)律相位與光照相關(guān)。分子和遺傳研究證明，Prokr2由生物鐘所調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Prokr2表達(dá)水平的降低有可能是節(jié)律紊亂小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律紊亂的分子機(jī)制之一。Prokr2 主要作為哺乳動(dòng)物SCN 節(jié)律輸出信號(hào)分子發(fā)揮其節(jié)律調(diào)控功能。本研究發(fā)現(xiàn)電針可以明顯增高節(jié)律紊亂小鼠SCN 內(nèi)Prokr2水平，捆綁組小鼠Prokr2水平改變卻不明顯。這提示電針可能是通過(guò)調(diào)控節(jié)律紊亂小鼠SCN 信號(hào)分子Prokr2的輸出這一環(huán)節(jié)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)節(jié)律紊亂小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律輸出的調(diào)整作用，這也是電針節(jié)律調(diào)整作用的分子機(jī)制之一。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察到SCN內(nèi)這幾種鐘基因及其相關(guān)因子的表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)針可縮短超前性光暗周期轉(zhuǎn)移小鼠的晝夜節(jié)律重置時(shí)間，加速紊亂晝夜節(jié)律的恢復(fù)，這可能是通過(guò)對(duì)SCN內(nèi)Per1、Egr1、Aanat、Prokr2等節(jié)律相關(guān)基因的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的。

[1] 諸毅暉. 電針調(diào)整慢性疲勞綜合征晝夜節(jié)律的研究[D]. 成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2008. CHU Y H. Therapeutic effects of electroacupuncture for chronic fatigue syndrome (CFS)[D] . Chengdu:Chengdu University of Traditional of Chinese Medicine,2008.

[2] 吳曦.慢性疲勞綜合征患者病理節(jié)律特征及其電針調(diào)整機(jī)制研究[D]. 成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)論文,2006. WU X. Corrective effects and of electroacupuncture for chronic fatigue syndrome (CFS)[D] . Chengdu: Chengdu University of Traditional of Chinese Medicine,2006.

[3] 諸毅暉,梁繁榮,吳曦,等.電針對(duì)慢性疲勞綜合征患者唾液CS、MT晝夜節(jié)律的調(diào)整機(jī)制[J].山東醫(yī)藥,2007,47(28):18-20. CHU Y H,LIANG F R,WU X,et al.Mechanism of electric acupuncuture on saliva CS and MT circadian rhythm in chronic fatigue syndrome[J].Shandong Medical Journal, 2007,47(28):18-20.

[4] 李勝吾,薛紅,吳佳,等.荷乳腺癌小鼠自發(fā)性活動(dòng)節(jié)律變化特征及不同時(shí)相點(diǎn)電針對(duì)其效應(yīng)的研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(1):9-13. LI S W,XUE H,WU J,et al. Characteristics of activity rhythm of mice bearing breast tumor by electroacupuncture on changqiang ( GV 1) and baihui ( GV 20)[J].Journal of Chengdu Universty of TCM, 2012,35(1):9-13.

[5] 賈亞妹,王俊娟,劉文,等.電針、埋線調(diào)整嗎啡成癮C57BL/6J小鼠晝夜節(jié)律的變化研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014 (4):17-21. JIA Y M,WANG J J,LIU W,et al.Research of electro-acupuncture and catgut implantation regulate the changes of circadian rhythm of morphine-addiction mice[J]. Journal of Chengdu Universty of TCM,2014 (4):17-21.

[6] 姚海江,宋洪濤,莫雨平,等.電針對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁模型大鼠體溫及褪黑素晝夜節(jié)律的影響[J] .中國(guó)針灸,2014 (7):685-689. YAO H J,SONG H T,MO Y P,et al.Effects of electroacupuncture on circadian rhythm of temperature and melatonin in depression rats model induced by chronic stress[J].Chinese Acupuncture & Moxibustion, 2014 (7):685-689.

[7] FRENKEL L, CERIANI M F. Circadian plasticity: from structure to behavior[J]. Int Rev Neurobiol, 2011,99:107-138.

[8] FILIPSKI E,DELAUNAY F,KING V M,et al. Effects of chronic jet lag on tumor progression in mice[J]. Cancer Research,2004,64(21):7879-7885.

[9] PILORZ V, CUNNINGHAM P S, JACKSON A,et al. A novel mechanism controlling resetting speed of the circadian clock to environmental stimuli[J]. Current Biology,2014,24:766-773.

[10] 余曙光，徐斌.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012. YU S G,XU B. Experimental acupuncture science[M]. Beijing:People’s Medical Publishing House Co,Ltd,2012.

[11] 王穎,賈亞妹,陳莎莎,等.電針不同穴位對(duì)小鼠自發(fā)性活動(dòng)節(jié)律的影響[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,38(1):1-4. WANG Y,JIA Y M,CHEN S S,et al.Effect of activity rhythm of mice by electroacupuncture different acupoint[J].Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,2015,38(1):1-4.

[12] PAXINOS G, FRANKLIN K B J. The mouse brain in stereotaxic coordinates[M]. San Diego：Academic Press,2001.

[13] WULFF K, PORCHERET K, CUSSANS E, et al. Sleep and circadian rhythm disturbances: Multiple genes and multiple phenotypes[J]. Curr Opin Genet Dev，2009，19:237-246.

[14] CAJOCHEN C. High sensitivity of human melatonin, alertness, thermoregulation, and heart rate to short wavelength light[J]. J Clin Endocrinol Metab,2005,90:1311-1316.

[15] AGARWAL R. Regulation of circadian blood pressure: from mice to astronauts[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens,2010,19:51-58.

[16] OSTER H, DAMEROW S, HUT R A, et al. Transcriptional profiling in the adrenal gland reveals circadian regulation of hormone biosynthesis genes and nucleosome assembly genes[J]. J Biol Rhythms,2006,21:350-361.

[17] FROY O. Metabolism and circadian rhythms-implications for obesity[J]. Endocr Rev,2010,31:1-24.

[18] KELLER M. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009,106:21407-21412.

[19] ATON S J, HERZOG E D. Come together, right…now: Synchronization of rhythms in a mammalian circadian clock[J].Neuron, 2005, 48(4):531-534.

[20] DHAVAN R I, TSAI L H. A decade of CDK5[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(10):749-759.

[21] BLOMEKE B, GOLKA K, GRIENFAHN B,et al.Arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) genotype as a personal trait in melatonin synthesis[J]. J Toxicol Environ Health A, 2008,71(13/14):874-876.

Mechanism of clock-control gene in SCN involved in resetting circadian rhythm with electro-acupuncture on advances of light/dark cycle model mice

CHENShasha,WANGYing,WEIDaneng，XUEHong

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China)

This study was to investigate the time phase of circadian rhythm of advances of light/dark cycle model mice, the effect of electro-acupuncture (EA) on their activity rhythms and the molecular regulating mechanism on the clock genes of suprachiasmatic nucleus (SCN). 44 male C57BL/6J mice were divided into 4 groups which were the blank group(n=10), the model group(n=12), the binding group(n=12) and the electro-acupuncture group (n=10) . We housed mice in LD cycle for 10 days. The control group was kept 12 h∶12 h LD of 20 days, and then SCN collected at ZT18. Then 8 hours advance of light onset every 2 days of 5 times. The model group was collected tissue at ZT18 when model successful. The binding group binds as the same time with the electro-acupuncture group. Electro-acupuncture group was treated at ZT16, on Zhiyang (GV 9) and Ganshu (BL 18) with acupuncture needle one time a day of three days. The SCN were collected at ZT18 at the third day. At last, samples of SCN were measured by PCR Array method to test the gene expression level. The experiment results are：① After the model was established, phase positions and onset of activity rhythms were advanced and period was shorten compared with the control group (P<0.05). After resynchronization, the phase positions and onset of activity rhythms of the electro-acupuncture group were delay respectively compared with the control group and the model group. The period at the 1stand 2ndday after resynchronization of the electro-acupuncture group had significant differences with the control group and itself before.② Compared with the control group, there were 8 genes upregulated(Aanat、Crx、Epo、Nkx2-5、Pax4、Prf1、Rora、Stat5a) and 4 genes decreased(Egr1、Per1 、Per3、Prokr2) of the model group. There were 3 genes upregulated(Esrra、Mat2a、Per3) and 11 genes decreased(Cartpt、Crx、Epo、Kcnma1、Mtnr1b、Nkx2-5、Nms、Pax4、Prf1、Prkacb、Prkca) of binding group compared with model group; after electro-acupuncture there were 6 upregulated(Egr1、Esrra、Mat2a、Per1、Per3、Prokr2) and 21 decreased(Aanat、Arntl、Cartpt、Crx、Csnk1e、Epo、Kcnma1、Mtnr1b、Myod1、Nkx2-5、Nms、Opn3、Pax4、Prf1、Prkacb、Prkca、Prkcb、Prokr2、Rora、Rorb、Slc9a3、Tgfb1). The results indicate electro-acupuncture can regulate onset of activity rhythms and period. Regulating the expressions of some clock genes in SCN of the circadian rhythm disturbance mice was probably one of the molecular mechanisms of electro-acupuncture to regulate the activity rhythms of circadian rhythm disturbance animals.

electro-acupuncture; advances of light/dark cycle; circadian rhythm; SCN; clock genes

2016-08-10 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(81373739)；四川省教育廳項(xiàng)目(15ZB0089)

陳莎莎(1987年生)，女；研究方向：時(shí)間針灸學(xué)；E-mail:ceciliacss@163.com

薛紅(1971年生)，女；研究方向：時(shí)間針灸學(xué)；E-mail:cdxuehong@126.com

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.003

R245.9+7；R446.7

A

0529-6579(2017)02-0013-09