李貝貝 侯春生 刁青云

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

慢性蜜蜂麻痹病毒中國(guó)株RNA1序列克隆及進(jìn)化分析

李貝貝 侯春生 刁青云

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

慢性麻痹病是成蜂中的一種傳染性疾病，患病蜜蜂呈現(xiàn)一些神經(jīng)性行為如顫抖、爬行，能引起兩種不同的癥狀，可導(dǎo)致蜜蜂體表發(fā)黑光亮無(wú)毛或腹部膨大。該病的病原體是慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic bee paralysis virus，以下簡(jiǎn)稱CBPV），對(duì)其致病性起決定性作用的是RNA依賴RNA聚合酶（RdRp），而RdRp位于CBPV基因組的RNA1片段上。為了深入理解CBPV的感染特點(diǎn)及致病機(jī)理，本文克隆中國(guó)北京株CBPV RNA1的全基因組序列并對(duì)其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，為深入開展病毒研究提供信息數(shù)據(jù)。

慢性蜜蜂麻痹病毒；序列分析；RNA依賴的RNA聚合酶；進(jìn)化特點(diǎn)

1 引言

蜜蜂是糧食作物開花授粉的重要媒介昆蟲之一，不僅為人類提供多種多樣的蜂產(chǎn)品而且通過(guò)授粉產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益。在世界農(nóng)業(yè)范圍內(nèi)蜜蜂通過(guò)授粉創(chuàng)造的價(jià)值約為1750億美元[1]，僅在歐洲和北美大約為170～180億美元[2，3]。但是蜜蜂的健康正受到多個(gè)病原及環(huán)境壓力的影響，從寄生性瓦螨、RNA病毒和微孢子蟲等致病因子到環(huán)境中的農(nóng)藥等，都會(huì)導(dǎo)致蜂群數(shù)量持續(xù)下降[4，5]。尤其是自2007年發(fā)現(xiàn)IAPV是引起蜜蜂崩潰癥的主要病毒之一，病毒病被發(fā)現(xiàn)在全球分布廣泛且危害巨大。同樣，CBPV在近兩年對(duì)我國(guó)蜂群造成了較大的影響，分布也較廣。

慢性麻痹病是成蜂中的一種傳染性疾病，在1963年被首次發(fā)現(xiàn)[6]。其感染主要的癥狀是：行為上，患病蜜蜂身體顫抖，翅膀不對(duì)稱外翻狀態(tài)和只能在地上爬行不能飛行，幾天后巢門口聚集大量死蜂；體表上，蜜蜂體色發(fā)黑或腹部膨大。大多數(shù)情況下主要通過(guò)食物和表皮傷口傳播，健康蜂通過(guò)與病蜂接觸或者哺育蜂清理病蜂糞便時(shí)被感染[7]。

CBPV是長(zhǎng)度30～60 nm，寬度20 nm的非等軸無(wú)包膜病毒粒子[8]。它是單鏈正義RNA病毒，由兩段基因組成，分別是 RNA1和 RNA2，已知的參考株（EU122229）RNA1長(zhǎng)度3674個(gè)核苷酸，（EU122230）RNA2包含2305個(gè)核苷酸[9]，有實(shí)驗(yàn)顯示CBPV的RNA3’端不含多聚腺苷酸尾但有一個(gè)閉鎖結(jié)構(gòu)，5’端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)。RNA1和RNA2分別編碼三個(gè)和四個(gè)開放閱讀框[9]。Olivier V在2002年提交了兩個(gè)基因序列 CBPV-B-441（EU122231） 和 CBPV A-79P（EU122229），兩個(gè)序列長(zhǎng)度分別為3658 nt和3678 nt[9]。Philippe Blanchard擴(kuò)增獲得9個(gè)國(guó)家（奧地利、比利時(shí)、丹麥、法國(guó)、匈牙利、波蘭、西班牙、瑞士、烏拉圭）22個(gè)蜜蜂樣品中的CBPV RNA1的ORF3序列，序列號(hào)從FJ345306到FJ345327長(zhǎng)度為1947 nt，以獲得不同地區(qū)CBPV的親緣關(guān)系[10]。Kojima在Genbank提交了日本株 CBPV RdRp區(qū)序列，序列號(hào)從 AB682795到AB682799，長(zhǎng)度都為469 nt。吳艷艷等擴(kuò)增中國(guó)地區(qū)17個(gè)蜜蜂樣品的CBPV RNA1 RdRp區(qū)序列，序列號(hào)從KM036169到KM036185，長(zhǎng)度都不超過(guò)400 bp[11]。至今為止CBPV并未被病毒國(guó)際分類委員會(huì)進(jìn)行種屬分類(ICTV)，只有RNA1中的ORF3區(qū)與野田病毒科和番茄矮叢病毒科同源性較高，因此推測(cè)RNA1的ORF1和ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，RNA2的ORF2和ORF3編碼結(jié)構(gòu)蛋白[12]。CBPV RNA1中包含許多重要信息，大多數(shù)研究克隆序列較短，Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有三條全基因組序列。因此本研究通過(guò)克隆獲得北京CBPV RNA1的全基因組序列，以期獲得更多的病毒信息。

2 材料與方法

2.1 樣本采集

在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所內(nèi)采集有明顯黑腹癥狀的意大利蜜蜂（Apis mellifera mellifera）爬蜂，采集的樣品迅速放置于-80℃冰箱保存。

2.2 RNA提取

將蜜蜂樣品置于1.5 ml無(wú)菌管中，用電動(dòng)組織研磨器在液氮中將蜜蜂研磨成細(xì)粉狀，隨后加入Trizol（Invitrogen美國(guó)），之后用氯仿和異丙醇按照RNA提取操作步驟提取RNA，用TE溶解，在-20℃冰箱中保存。

2.3 反轉(zhuǎn)錄、PCR和克隆

按照反轉(zhuǎn)錄（Promega美國(guó)）試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，使用Primer 5.0依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求共設(shè)計(jì)5對(duì)引物，覆蓋CBPV的全長(zhǎng)，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

克隆CBPV各個(gè)片段。PCR反應(yīng)液：cDNA模板為1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，2×Es Taq Master－Mix（康為世紀(jì)中國(guó)）10 μl，無(wú)菌水7 μl。反應(yīng)條件為：94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃0.5～2 min（由克隆片段長(zhǎng)度決定），共34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒（天根中國(guó)）回收目的條帶。

按照全試金克隆試劑盒說(shuō)明書（全試金中國(guó)）將目的片段連接到pEASY-T1載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)，將陽(yáng)性菌株送去生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2.4 CBPV RNA1全長(zhǎng)及RdRp進(jìn)化樹構(gòu)建

目前在GenBank上公布的CBPV RNA1全基因組序列僅有3株，名稱及登錄號(hào)分別為：France B-441 (EU122231)、France A-79P (EU122229)、China LN（KU950353）。將本實(shí)驗(yàn)中得到的序列KX168412與這3株CBPV RNA1序列構(gòu)建進(jìn)化樹，并以以色列急性麻痹病毒IAPV（EU218534）全基因組序列作為進(jìn)化樹外群，用Mega6分析軟件中的Clustal W程序進(jìn)行多重序列對(duì)齊分析，使用鄰接法（Neighbour-Joining）Bootstrap重復(fù)1000次構(gòu)建進(jìn)化樹。

在GenBank上公布的CBPV RNA1序列中能夠全部覆蓋RdRp區(qū)的序列共25條，使用Mega6軟件分析中的Clustal W程序?qū)@25株和本文得到的序列進(jìn)行多重序列對(duì)齊分析，使用鄰接法（Neighbour-Joining）Bootstrap重復(fù)1000次構(gòu)建進(jìn)化樹。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 CBPV基因拼接及全基因組進(jìn)化樹分析

使用DNAman將5段CBPV RNA1序列拼接在一起，基因總長(zhǎng)度為3657 nt的序列，提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為KX168412。將 KX168412與其他三株CBPV RNA1序列共同構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果如圖1所示，括號(hào)中為各個(gè)序列的登錄號(hào)。

圖1 CBPV RNA1全基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

通過(guò) NCBI中的 BLAST將本文中所獲得的KX168412與全部3株CBPV RNA1基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示China BJ（KX168412）與China LN（KU950353）相似度最高為98%，其次為France B-441 (EU122231)相似度為 96%，與 France A-79P (EU122229)相似度最低91%。

全基因組序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，所有CBPV RNA1基因型都區(qū)別于IAPV的全基因組序列。在CBPV RNA1基因型中，進(jìn)化樹主要是一個(gè)大的分支，其中，F(xiàn)rance B-441(EU122231)與 France A-79P (EU122229)的同源性最高；China BJ（KX168412）與China LN（KU950353）的同源性高，在進(jìn)化關(guān)系上KX168412要高于France B-441(EU122231)、France A-79P(EU122229)、China LN（KU950353）。

3.2 CBPV RNA1 BJ株全基因結(jié)構(gòu)及RdRp區(qū)進(jìn)化分析

使用DNAman預(yù)測(cè)CBPV RNA1的ORF區(qū)，經(jīng)預(yù)測(cè)，China BJ(KX168412)含有三個(gè)ORF區(qū)域，包括ORF1（19-2575）、ORF2（32-887）、ORF3（1643-3587）。

使用Mega6采用鄰近法，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，對(duì)已克隆并測(cè)序的China BJ(KX168412)序列的RdRp區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的其他已報(bào)道25條CBPV毒株（長(zhǎng)度為1974 nt）構(gòu)建進(jìn)化樹。圖2進(jìn)化樹結(jié)果顯示，有四個(gè)主要的集群，第一個(gè)集群包括一個(gè)法國(guó)株序列，兩個(gè)瑞士株序列和所有的波蘭株、奧地利株、丹麥株和匈牙利株；第二個(gè)集群包括兩個(gè)烏拉圭株；第三個(gè)集群包括三個(gè)法國(guó)株和一個(gè)瑞士株、一個(gè)烏拉圭株、兩個(gè)中國(guó)株序列；第四個(gè)集群包括法國(guó)株、西班牙株和比利時(shí)株。本文 得 到 的 China BJ（KX168412） 與 China LN（KU950353）的同源性最高，其次與France B-441、Switzerland R3 C10和Uruguay 6-M同源性較為相近。

圖2 不同國(guó)家CBPV RNA1 RdRp區(qū)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

4 討論

NCBI最長(zhǎng)的CBPV RNA1基因序列是法國(guó)株，其序列號(hào)是EU122229，長(zhǎng)度為3674 nt，比China BJ (KX168412)長(zhǎng)17 nt[9]。經(jīng)Blast比對(duì)，本文中所得到RNA1的序列與法國(guó)株（EU122229）序列的同源性達(dá)到98%。

RdRd是病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶，對(duì)于病毒的傳播和表達(dá)具有重要意義。Olivier V在2008年推測(cè)RNA1的ORF3氨基酸序列可能編碼RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)區(qū)域[9]。經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)我們克隆所得到的ORF3區(qū)與多個(gè)病毒的RdRd區(qū)高度相似。Olivier V的分析表明CBPV法國(guó)株介于番茄叢矮病毒科和野田村病毒科之間，但并不屬于任何病毒科。因此選擇ORF3區(qū)與其他國(guó)家CBPV病毒株進(jìn)行進(jìn)化樹分析，以期獲得更多關(guān)于CBPV分類的信息。

用 ORF Finder對(duì) GenBank上其他 3株 CBPV RNA1全基因組序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)開放閱讀框結(jié)果顯示四株序列都含有3個(gè)ORF區(qū)。其中France B-441 (EU122231)、France A-79P(EU122229)和 China BJ (KX168412)三條序列的三個(gè)ORF區(qū)所含氨基酸數(shù)目相等，分別是852（ORF1）、285（ORF2）、648（ORF3）個(gè)氨基酸，而China LN（KU950353）序列的ORF1區(qū)含有784個(gè)氨基酸，比上述三株序列中的ORF1區(qū)少68個(gè)氨基酸。

進(jìn)化分析結(jié)果顯示烏拉圭株、瑞士株和法國(guó)株出現(xiàn)在多個(gè)集群中，沒(méi)有明顯的地域差異。第一集群中的CBPV RdRp序列主要集中在歐洲北部和東部；第二個(gè)集群主要集中在南美洲；第四個(gè)分支主要包括歐洲的南部和西部；第三個(gè)集群包括法國(guó)株、瑞士株、烏拉圭株和兩個(gè)中國(guó)株序列，其中兩個(gè)中國(guó)株序列聚為同一類，同源性較為相近，屬亞洲區(qū)域，但是從整體上看這一分支中的CBPV并無(wú)明顯地域差異，可能與頻繁的商業(yè)交換或者病毒變異有關(guān)。另外法國(guó)株序列出現(xiàn)在三個(gè)分支中，出現(xiàn)比例明顯高于其它地區(qū)CBPV株。因此可能需要更多的CBPV RdRp序列才能得到更詳細(xì)和精確的地域差異。

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Clone and Phylogenetic Analysis of Chronic Bee Paralysis Virus China RNA1 Sequence

Li Beibei,Hou Chunsheng,Diao Qingyun
(Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093)

Chronic bee paralysis virus is a contagious disease of adult honeybees,and diseased bee displayed several neurological symptoms such as trembling,crawling.And it can induce two kinds of significant different symptoms,black bright hairless or bloated abdomen.The pathogen of this disease is Chronic bee paralysis virus(CBPV), and RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)plays a vital role in the pathogenesis for the CBPV and positioned at the RNA 1 segment of CBPV genome.In order to better understand the mechanism of CBPV,we cloned the full genome of RNA 1 of CBPV and made a phylogenetic analysis on that.These results provided the fundamental data for studying the infection characterization of CBPV.

Chronic bee paralysis virus;phylogenetic analysis;RNA-dependent RNA polymerase;evolution characteristics

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2017-IAR）

李貝貝（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槊鄯洳∠x害，E-mail：15600928925@163.com

刁青云，女，研究員，從事蜜蜂病害研究工作，E-mail:dqyun1@126.com