高文佳 張海華 馬雪巍 張 瑩 那雙俊 劉 欣 馬占峰

（哈爾濱市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，哈爾濱150090）

基于中紅外光譜法快速檢測蜂蜜中還原糖的研究

高文佳 張海華 馬雪巍 張 瑩 那雙俊 劉 欣 馬占峰

（哈爾濱市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，哈爾濱150090）

目前蜂蜜的還原糖測定方法主要有滴定法、液相色譜法、氣相色譜法等。傳統(tǒng)化學(xué)檢測方法費(fèi)時、費(fèi)力,因此無法做到快速、無損檢測。中紅外光譜技術(shù)具有快速、簡便、無樣品預(yù)處理、無損傷等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為國內(nèi)外的研究重點(diǎn)。本研究采用中紅外光譜技術(shù)，利用偏最小二乘法建立模型，結(jié)合高效液相色譜法測定的蜂蜜中果糖和葡萄糖的檢測結(jié)果。采用主成分分析和PLS的方法，建立和優(yōu)化蜂蜜果糖和葡萄糖的快速檢測模型，實(shí)現(xiàn)蜂蜜還原糖的快速檢測。

中紅外光譜技術(shù)；蜂蜜；果糖；葡萄糖；高效液相色譜法

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜或者分泌物經(jīng)自身含有的特殊物質(zhì)進(jìn)行充分釀造而成的甜味物質(zhì)，蜂蜜中主要成分是糖類物質(zhì)，約占蜂蜜的3/4,其中果糖和葡萄糖含量最高,其次是蔗糖、麥芽糖、曲二糖等，還有蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、維生素等多種對人體有益的營養(yǎng)成分?，F(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖給出了明確的限量規(guī)定。由于利益的驅(qū)使，蜂蜜摻雜、使假一直是我國蜂產(chǎn)品行業(yè)存在的重要問題[2]。現(xiàn)階段蜂蜜的還原糖測定方法主要有滴定法、液相色譜法、氣相色譜法等，傳統(tǒng)化學(xué)檢測方法費(fèi)時、費(fèi)力，因此無法做到快速、無損檢測[1]。中紅外光譜技術(shù)具有快速、簡便、無樣品預(yù)處理、無損傷等特點(diǎn)，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取光譜有效信息進(jìn)行樣品定性或定量分析被應(yīng)用到很多領(lǐng)域[3]，尤其在食品的無損檢測方面顯現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，現(xiàn)已成為國內(nèi)外的研究重點(diǎn)。本研究采用中紅外光譜技術(shù)，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法[4]，結(jié)合液相色譜測得蜂蜜中果糖和葡萄糖的檢測結(jié)果，利用主成分分析和PLS的方法[5]，建立和優(yōu)化蜂蜜果糖和葡萄糖的快速檢測模型[6]，實(shí)現(xiàn)蜂蜜糖分的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

本研究通過調(diào)研，找出不同蜜種的分布區(qū)域，從2013年開始連續(xù)到全國多個區(qū)域采集蜂蜜真實(shí)樣本，共采集蜂蜜真實(shí)樣本一千余批次，蜜種包括椴樹蜜、槐花蜜、棗花蜜、油菜蜜、荊條蜜、百花蜜和其他一些蜜種，采樣區(qū)域覆蓋山東、遼寧、黑龍江、廣東、廣西等二十個省份。

D-果糖標(biāo)準(zhǔn)品：Purity≥99%，美國 SIGMAALDRICH公司；D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：Purity 99.9%，美國SUPELCO公司；乙腈（色譜純），一級水，符合GB/ T6682規(guī)定。

1.2 主要設(shè)備與儀器

中紅外福斯光譜分析儀：MilkoScan FT120型，丹麥FOSS公司；液相色譜儀，配示差折光檢測器：waters 2695型，美國waters公司；超純水機(jī)：Milli-Q Advantage型，美國密理博公司；電子天平：梅特勒AL104型，美國梅特勒-托利多公司；磁力攪拌器：RO10型，德國IKA公司。

1.3 樣品光譜采集法

1.3.1 樣品的制備

對所有待測蜂蜜樣品進(jìn)行編號處理，并進(jìn)行詳細(xì)記錄。對存在結(jié)晶現(xiàn)象的樣品于50℃水浴鍋中進(jìn)行加熱，直至樣品中無結(jié)晶現(xiàn)象為止。精確稱取待測樣品10g（±0.05 g）于100 ml燒杯中，加入30 ml去離子水，放入磁子。將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌，設(shè)定溫度為30℃，攪拌8分鐘。待樣品均一后，轉(zhuǎn)移至50 ml比色管中，并用去離子水清洗燒杯，全部轉(zhuǎn)移至比色管中，定容至刻度。搖勻靜置后待檢。

1.3.2 樣品掃描

測量前，預(yù)熱中紅外光譜分析儀，對儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，測試前進(jìn)行清洗和調(diào)零。將選定的146個樣品，按設(shè)定好的儀器條件進(jìn)行紅外檢測，每個樣品均檢測兩次，每次進(jìn)樣量為8 ml，取兩次平均值作為樣品的原始光譜。利用校正集合建立PLS模型后，對驗(yàn)證集合的樣品進(jìn)行掃描，驗(yàn)證模型的預(yù)測準(zhǔn)確性。

1.4 蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖含量的測定

蜂蜜的果糖、葡萄糖含量按照國標(biāo) GB/T 18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定方法-液相色譜示差折光檢測法》測定。

1.5 PLS定標(biāo)模型的建立

將上述選定的146個樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)建立正常樣品集合，在集合分別增加果糖、葡萄糖和蔗糖的參數(shù)，輸入液相色譜測得的結(jié)果作為真值（中紅外掃描時樣品經(jīng)過5倍稀釋），選擇具有較強(qiáng)吸收的特征波段，打開蜂蜜成分快速檢測模塊，對相應(yīng)的檢測項(xiàng)目采用PLS定標(biāo)方式定標(biāo)，選擇交互驗(yàn)證誤差最小時對應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)，建立最優(yōu)的蜂蜜成分快速檢測模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 定標(biāo)波段的選擇

采用主成分分析的方法，按照PLS定標(biāo)程序選擇確定的模塊，選擇最佳紅外吸收的15個波段。

2.2 中紅外光譜分析模型的建立

采用偏最小二乘法建立多元統(tǒng)計(jì)模型。校正模型的最佳因子個數(shù)由舍一交互驗(yàn)證法(leave-one-out)確定，計(jì)算出不同主因子數(shù)對應(yīng)的Cross Validation Error交互驗(yàn)證誤差 (交互驗(yàn)證誤差）值和RESECV(root mean square errorof cross validation交叉驗(yàn)證均方差)，然后以最小的交互驗(yàn)證誤差值所對應(yīng)的因子數(shù)作為模型的最佳因子數(shù)。圖1顯示了Norris平滑后葡萄糖PLS模型中Cross Validation Error值隨PLS因子變化的趨勢，隨著PLS因子數(shù)的增加，PRESS逐漸降低，當(dāng)PLS主成分因子達(dá)到6時，交互驗(yàn)證誤差最小，當(dāng)PLS主成分因子數(shù)大于6時，PLS模型擬合了部分噪聲信息，導(dǎo)致交互驗(yàn)證誤差值逐漸增大。因此，蜂蜜葡萄糖PLS模型的最佳主成分因子數(shù)為6。

圖1中橫坐標(biāo)為模型和選擇的主成分因子Factor數(shù)，縱坐標(biāo)為Cross Validation Error（交互驗(yàn)證誤差）值。

圖1 Norris平滑后Cross Validation Error值和PLS主成分因子關(guān)系圖

圖2 Norris平滑后Cross Validation Error值和PLS主成分因子關(guān)系圖

圖2顯示了Norris平滑后果糖PLS模型中Cross Validation Error值隨PLS因子變化的趨勢，隨著PLS因子數(shù)的增加，PRESS逐漸降低，當(dāng)PLS主成分因子達(dá)到6時，交互驗(yàn)證誤差最小，當(dāng)PLS主成分因子數(shù)大于6時，PLS模型擬合了部分噪聲信息，導(dǎo)致交互驗(yàn)證誤差值逐漸增大。因此，蜂蜜果糖PLS模型的最佳主成分因子數(shù)為6。

圖2中橫坐標(biāo)為模型和選擇的主成分因子Factor數(shù)，縱坐標(biāo)為Cross Validation Error（交互驗(yàn)證誤差）值。

2.3 PLS模型預(yù)測結(jié)果分析

2.3.1 葡萄糖PLS模型的預(yù)測值與液相色譜結(jié)果對照

146個檢測蜂蜜樣本中，葡萄糖PLS模型的預(yù)測值與手工輸入的液相色譜結(jié)果（視為真值）對比情況見圖3和圖4。圖3中橫坐標(biāo)代表葡萄糖的預(yù)測結(jié)果，縱坐標(biāo)代表預(yù)測結(jié)果與真值之間的殘差。圖4為葡萄糖預(yù)測結(jié)果的部分截取圖。

圖3 葡萄糖預(yù)測值與真值之間的殘差散點(diǎn)分布圖

2.3.2 果糖PLS模型的預(yù)測值與液相色譜結(jié)果對照

146 個檢測蜂蜜樣本中，果糖PLS模型的預(yù)測值與手工輸入的液相色譜結(jié)果（視為真值）對比情況見圖5和圖6。圖3中橫坐標(biāo)代表果糖的預(yù)測結(jié)果，縱坐標(biāo)代表預(yù)測結(jié)果與真值之間的殘差。圖6為果糖預(yù)測結(jié)果的部分截取圖。

表1 PLS定標(biāo)模型的預(yù)測情況同行估計(jì)結(jié)果表

圖4 葡萄糖預(yù)測值與真值的殘差截取圖

圖5 果糖預(yù)測值與真值之間的殘差散點(diǎn)分布圖

參與品定量分析樣品的含量應(yīng)能涵蓋待測樣品的成分范圍。將所有樣本的預(yù)測值和真值作比較，分析對比數(shù)據(jù)見表1(本實(shí)驗(yàn)樣品嚴(yán)格按照5倍質(zhì)量比稀釋，所得結(jié)果乘以5為蜂蜜中果糖和葡萄糖含量的真實(shí)值)。

對于建立的模型，交互驗(yàn)證均方差RMSECV越小，說明所提取的光譜信息與分析組分的相關(guān)性越好，所得到的模型的預(yù)測能力也就越好。通過表1可以看出，預(yù)測模型經(jīng)過平滑、求導(dǎo)等處理方式后，交叉驗(yàn)證均方根誤差分別為0.5151%和0.5143%，數(shù)值較小，說明模型可以很好地預(yù)測蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量。

圖6 果糖預(yù)測值與真值的殘差截取圖

2.4 結(jié)論

采用中紅外光譜技術(shù)對蜂蜜中果糖和葡萄糖進(jìn)行檢測，檢測速度快，檢測成本低，污染小，而且能達(dá)到滿意的檢測精度。同時，采用Norris平滑、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)等數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，對利用中紅外光譜法定量檢測蜂蜜中的果糖和葡萄糖起到重要作用。試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪藖碜远鄠€省份的十幾種蜂蜜樣品，不同的地理位置和不同的植物來源都會對光譜產(chǎn)生影響，樣品的合理選擇使得模型具有更加廣泛的適用性。

中紅外光譜技術(shù)可以滿足蜂蜜檢測質(zhì)量控制需求，是適合蜂蜜果糖和葡萄糖檢測和質(zhì)量控制的高效檢測技術(shù)。

[1]史建國,馬耀宏,楊艷,等.蜂蜜中還原糖的快速測定技術(shù)[J].山東科學(xué),2004,17(2):30-32.

[2]趙延華,劉成雁,韓旭,等.傅里葉變換紅外光譜法快速鑒別摻假蜂蜜[J].PTCA,2012,48(2):136-139.

[3]李水芳,朱向榮,單楊,等.中/近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)在蜂蜜快速檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].食品與機(jī)械,2009,25(5): 121-124.

[4]張欣,單楊,李水芳.基于多元散射校正和偏最小二乘（MSC/ PLS）的傅里葉變換近紅外光譜檢測蜂蜜中還原糖[J].食品與機(jī)械,2009,25(6):109-112.

[5]許偉堅(jiān),周劍楊.基于PLS/Sugar預(yù)言的RISC模塊驗(yàn)證[J].廈門大學(xué)學(xué)報,2005,44(3):337-340.

[6]褚小立,王艷斌,陸婉珍.近紅外光譜定量校正模型的建立及應(yīng)用[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊),2008,44(08):796-800.

馬占峰，E－mail：tct1998@163.com