劉小玉，付登強，余鳳玉，賈效成，陳良秋，趙志浩

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所油茶研究中心，海南文昌 571339）

引起天然茶枯膏酸敗的微生物分離與鑒定

劉小玉，付登強，余鳳玉，賈效成，陳良秋，趙志浩

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所油茶研究中心，海南文昌 571339）

近年來，我國油茶產(chǎn)業(yè)得到了快速的發(fā)展，種植面積逐年上升，茶枯是油茶籽經(jīng)榨油后剩下的渣餅，產(chǎn)量大，營養(yǎng)豐富，生物活性作用多。但茶枯膏易酸敗，影響其應用。本文采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)法，對酸敗天然茶枯膏中的微生物進行了分離、純化，共獲得5株細菌。然后進行菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckgp-01、ckg-p-02均為枯草芽孢桿菌，ckg-l-03為解淀粉芽孢桿菌。該研究為抑制天然茶枯膏酸敗、延長其保質(zhì)期的技術(shù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：天然茶枯膏；酸?。晃⑸?；分離與鑒定

在國務院和各級地方政府的高度重視下，我國油茶產(chǎn)業(yè)得到了快速的發(fā)展。目前，全國油茶種植面積接近400萬hm2，年產(chǎn)茶油量達51.8萬t[1]。茶枯是油茶籽經(jīng)榨油后剩下的渣餅，其產(chǎn)量是茶油的2～3倍，富含多種營養(yǎng)成分，如蛋白、脂肪、糖類等，還有抗營養(yǎng)因子成分，如茶皂素、生物堿、多酚類等[2，3]。茶皂素是一種天然非離子型表面活性劑，具有良好的乳化、分散、發(fā)泡、濕潤等功能；水解茶籽蛋白能有效提高洗發(fā)水的保濕性能，使頭發(fā)易于梳理并富有光澤，對頭發(fā)具有一定的藥理作用[4]。我國古代早有用茶枯洗頭的傳統(tǒng)，但因使用不方便，粘膜刺激性強等缺點，僅在少數(shù)油茶產(chǎn)區(qū)仍保留使用。茶枯高值化利用成了油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向，利用茶枯研制洗發(fā)用品是茶枯高值化利用的主要方向之一。天然茶枯膏是經(jīng)過雙酶水解茶枯制備而成，能有效降低茶枯殘油含量和粘膜刺激性，增強清潔力和使用方便性，產(chǎn)物富含茶枯水解蛋白、茶皂素等，長期使用有殺菌、止癢、控油、去屑、修復受損發(fā)質(zhì)等功效，還有明顯的烏發(fā)、防脫發(fā)等作用，是極佳的天然護發(fā)產(chǎn)品。但是天然茶枯膏保質(zhì)期比較短，在室溫下30d左右即開始酸敗，因而制約了它的商品性開發(fā)。

酸敗通常是由霉菌或細菌造成的，因為有些霉菌（如黑曲霉）和細菌（如醋酸桿菌）在生長發(fā)育過程中能產(chǎn)生檸檬酸和醋酸等代謝產(chǎn)物，致使產(chǎn)品酸敗，pH降低[5]。本研究是采集酸敗的天然茶枯膏，分離并篩選出其中的微生物，并通過菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究對菌株進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

茶枯，本研究室采用海南傳統(tǒng)熱榨法榨取茶油后剩余的枯餅。

酸敗的天然茶枯膏，采用本研究室發(fā)明的雙酶水解茶枯制備而成，專利申請?zhí)枺?01510939400.3，在室溫條件下保存1個月以上。

1.2 天然茶枯膏酸敗微生物的分離與鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

1.2.2 酸敗微生物的分離純化

稱取10g變質(zhì)天然茶枯膏置于盛有90mL無菌水的三角瓶中，振蕩30min（160r/min），制成懸浮液。取其上清液依次稀釋成10-2、10-3、10-4g/mL，各吸取0.1mL分別涂布于LB培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單菌落劃線純化，并將純化的菌株接種到斜面LB培養(yǎng)基上，置于4℃的冰箱中保存待用。

1.2.3 酸敗微生物的鑒定

（1）菌株形態(tài)特征和主要生理生化特征

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[6]對菌株的形狀、顏色、透明度、生長速度等菌落形態(tài)特征及吲哚試驗、氧化酶、革蘭氏染色、淀粉水解、V-P試驗、明膠液化、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗等主要生理生化特征進行試驗和觀察記錄。

（2）16SrDNA序列分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離純化得到的細菌DNA。PCR擴增選用通用引物27F5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。反應體系50μL（1μL模板、1μL 1492R、1μL 27F、25μL PCR mastermix、22μL ddH2O）。PCR擴增（94℃預變性5min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，進行35個循環(huán)，72℃終延伸10min，4℃保存），取50μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在紫外燈下觀察、并拍照保存。將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

（3）系統(tǒng)發(fā)育分析

將序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（Neighbour-joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸敗微生物的分離純化

從酸敗的天然茶枯膏中共分離篩選得到5株細菌，即ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-l-03、ckg-p-01、ckg-p-02，結(jié)果如表1（見下頁）所示。

2.2 酸敗微生物的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

表1顯示的是5株細菌的形態(tài)特征。由表可知，菌株ckg-l-01在LB培養(yǎng)基上生長情況較好，培養(yǎng)48h后，菌落形狀不規(guī)則，表面光滑，扁平，淡黃色，不透明，濕潤，扁平，無色素產(chǎn)生，菌落中等大?。痪阠kg-l-02在LB培養(yǎng)基上生長較好，培養(yǎng)48h后，菌落不規(guī)則，表面淡黃色，背面淡紅色，不透明，干燥，表面凸起，有色素產(chǎn)生，菌落中等大小，生長速度中等；菌株ckg-l-03在LB培養(yǎng)基上生長速度慢，培養(yǎng)48h后，菌落圓形，淡黃色，不透明，干燥，表面凸起，無色素產(chǎn)生，菌落??；菌株ckg-p-01在LB培養(yǎng)基上生長速度慢，培養(yǎng)48h后，菌落不規(guī)則，淡黃色，不透明，表面濕潤，扁平、無色素產(chǎn)生，菌落小；菌株ckg-p-02在LB培養(yǎng)基上生長較好，生長速度快，培養(yǎng)48h后，菌落圓形，淡黃色，不透明，表面濕潤光滑、扁平，無色素產(chǎn)生，菌落大。

2.2.2 菌株的生理生化特征

對5株細菌的生理生化特征鑒定有吲哚試驗、氧化酶、革蘭氏染色、淀粉水解、V-P試驗、明膠液化、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗等，結(jié)果見表2。5株菌在吲哚試驗、氧化酶試驗中均表現(xiàn)為陰性，在革蘭氏染色、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗中均表現(xiàn)為陽性，且均能利用葡萄糖；而只有菌株ckg-l-02 V-P試驗呈陰性，其余4株菌V-P試驗均表現(xiàn)為陽性。對照參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》得知，菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02與枯草芽孢桿菌生理生化特征相符，菌株ckg-l-03與解淀粉芽孢桿菌的生理生化特征相符。

2.2.3 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

分別以5株細菌的DNA為模板，采用通用引物擴增出約為1500bp左右的片段，瓊脂凝膠電泳檢測后進行測序。將5株菌16SrDNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號分別為5239MJPD01R、523BUXYY01R、5232HDR2015、523DBE5V01R、523EYPEH01R，并運用BioEdit、Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可知（見下頁），5株菌均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），其中菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02與GenBank中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源性最高，相似性大于99%，菌株ckg-l-03與GenBank中的解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）同源性最高，相似性大于99%。再結(jié)合細菌的形態(tài)特征、生理生化測定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步確定ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02為枯草芽孢桿菌，菌株ckg-l-03為解淀粉芽孢桿菌。

表1 5株細菌的菌落特征

表2 5株細菌生理生化特性

圖1 5株細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究通過從酸敗的天然茶枯膏中分離、純化獲得5株細菌，結(jié)合菌株菌落形態(tài)特征、生理生化試驗、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析等，初步鑒定菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02均為枯草芽孢桿菌，ckg-l-03為解淀粉芽孢桿菌，因而得知引起天然茶枯膏酸敗的微生物是枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

茶枯中富含蛋白、脂肪、糖類、茶皂素、生物堿和多酚類等多種生物活性成分，但是目前茶枯尚未得到充分的開發(fā)利用，價值沒有得到充分的發(fā)揮，茶枯高值化利用成

Isolation and Identification of Microorganism s from Rancidity Natural Sham poo of Oil Camellia Cake

LIU Xiao-yu,FU Deng-qiang,YU Feng-yu,JIA Xiao-cheng,CHEN Liang-qiu,ZHAO Zhi-hao
(Coconut Research Institute,CATAS,Wenchang 571339,China)

Camellia industry in our country has been developed rapidly,and the planting area has been increasing year by year.Oil camellia cake are the rest of the residue after camellia seed,and its production is large and nutrient rich,but natural shampoo of oil camellia cake is easy to rancidity,which limits its promotion and application.Using traditional method of isolation and culture of microorganisms,five strains were screened from natural shampoo of oil camellia cake rancidity.According to morphology of the colony,physiological and biochemical properties,16S rDNA and phylogenetic analysis,strain ckg-l-01,strain ckg-l-02,strain ckg-p-01 and strain ckg-p-02 were preliminarily identified as Bacillus subtilis,strain ckg-l-03 was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens.The study laid the foundation for the suppression of rancidity natural shampoo of oil camellia cake,and it extend the shelf-life of natural shampoo of oil camellia cake,in order to quicken the pace of high value utilization of oil camellia cake.

Natural shampoo of oil camellia cake;rancidity;microorganism;isolation and identification

S794.4

A

1008-1038(2017)05-0010-04

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.05.004

2017-01-12

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（NO.1630152016008）；海南省產(chǎn)學研一體會專項項目（cxy20150020）

劉小玉（1986—），女，助理研究員，主要研究方向為油茶豐產(chǎn)栽培技術(shù)及副產(chǎn)物綜合利用