杜東霞，杜 宇，許 雋，尹紅梅，賀月林

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

耐鎘菌株N-17的分離、鑒定及其強(qiáng)化印度芥菜富集土壤鎘的潛力

杜東霞，杜 宇，許 雋，尹紅梅，賀月林*

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

從鎘污染稻田土壤中分離到一株兼具活化碳酸鎘、分泌鐵載體和固氮能力的耐鎘菌株N-17，結(jié)合菌體形態(tài)、生理生化及16S rDNA分析，初步鑒定其為伯克氏菌屬。將其用于強(qiáng)化印度芥菜修復(fù)鎘污染土壤，盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株能增加污染土壤中可交換態(tài)鎘的含量，與對照相比，接種該菌后，印度芥菜的生物量提高了9.41%，株高增加了20.2%，地上部和地下部鎘含量分別比對照提高了49%和67%。

鐵載體；固氮；伯克氏菌屬；植物修復(fù)

隨著我國工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加快，環(huán)境問題日益突出。根據(jù)2014年4月環(huán)保部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，全國耕地土壤污染物點(diǎn)位超標(biāo)率19.4%，污染類型以無機(jī)型為主，無機(jī)污染物超標(biāo)點(diǎn)位數(shù)占全部超標(biāo)點(diǎn)位的82.8%，主要無機(jī)污染物包括鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、銅(Cu)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、鋅(Zn)、鎳(Ni)等重金屬，點(diǎn)位超標(biāo)率分別為7.0%、1.6%、2.7%、2.1%、1.5%、1.1%、0.9%、4.8%。以目前全國糧食播種面積1.35億hm2推算，有待修復(fù)的耕地污染面積約為0.26億hm2[1-2]。如何修復(fù)并提高重金屬污染土壤的生產(chǎn)力，已成為事關(guān)我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境質(zhì)量改善的研究熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)的物理、化學(xué)修復(fù)方法大都存在修復(fù)成本高、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)大、破壞土壤結(jié)構(gòu)、降低土壤生物活性和土壤肥力等缺點(diǎn)。1983年Chaney最早提出了植物修復(fù)的概念[3]。但單一應(yīng)用植物修復(fù)技術(shù)會受到植物生物量、生長速度、土壤理化性質(zhì)及污染物在土壤中的分布和生物利用度等條件的限制，導(dǎo)致其在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用進(jìn)展緩慢[4]。

微生物，特別是細(xì)菌，比表面積大，數(shù)量多，代謝活動旺盛，在重金屬污染土壤修復(fù)方面具有獨(dú)特的作用，不僅可通過自身吸附累積重金屬，還可通過分泌鐵載體、功能酶、有機(jī)酸及生物表面活性劑等物質(zhì)活化土壤重金屬，促進(jìn)植物吸收重金屬。微生物與超積累植物的聯(lián)合修復(fù)能充分利用其共生關(guān)系，發(fā)揮各自優(yōu)勢，協(xié)同增效，達(dá)到高效修復(fù)重金屬污染土壤的目的[5-8]。Dimkpa等[9]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌tendae F4產(chǎn)生的鐵載體能顯著增強(qiáng)向日葵對鎘的吸收能力。吳秉奇等[10]從鎘超積累龍葵葉片中篩選到一株內(nèi)生細(xì)菌DE5，結(jié)果表明，接種DE5能夠強(qiáng)化青葙的鎘吸收效果，其作用效果好于澆施螯合劑EDTA。

本研究從重金屬污染土壤中分離到1株兼具活化碳酸鎘、分泌鐵載體和固氮能力的多功能鎘耐性菌株N-17，該菌株能夠和超累積植物印度芥菜共生，并通過促生長(固氮作用)、活化鎘(分泌鐵載體和有機(jī)酸等)等作用提高印度芥菜的修復(fù)效率，以期為植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤的大面積應(yīng)用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物，印度芥菜(Brassicajuncea)。盆栽用土采自岳陽縣某鎮(zhèn)中輕度鎘污染稻田0～20 cm土層，晾干過篩后使用，土壤有機(jī)質(zhì)含量37.2 g·kg-1，鎘含量2.33 mg·kg-1，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為180.0、12.9、58.0 mg·kg-1。篩菌用土采自株洲市清水塘工業(yè)區(qū)某冶煉廠附近0～20 cm土層，保存于無菌紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室供菌株分離、篩選，土壤有機(jī)質(zhì)含量30.8 g·kg-1，鎘含量12.0 mg·kg-1，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為90.5、21.2、68.9 mg·kg-1。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：原子吸收光譜儀，AA-670型，日本島津制作所生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)，751GW，惠普上海分析儀器有限公司生產(chǎn)；pH計(jì)，8904型，江蘇江環(huán)分析儀器有限公司生產(chǎn)。

主要試劑：CdCl2、Pb(NO3)2、ZnSO4、CoCl2、CuSO4、K2Cr2O7、CdCO3，均為分析純，購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

Ashby無氮培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[11]中的配方配制；改進(jìn)的MSA培養(yǎng)基、CAS檢測平板及CAS染液參照文獻(xiàn)[12]中的配方配制。

1.3 耐鎘菌株篩選及馴化

稱取10 g新鮮土壤樣品，放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，利用常規(guī)梯度稀釋方法獲得各個梯度的土壤稀釋液，取適量分別涂布在含Cd的LB固體培養(yǎng)基上，待長出菌落后，參照文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行分離純化。

將篩選到的菌株分別涂布到Cd2+含量為2、4、6、8、10 mmol·L-1的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，將長勢較好的菌株接種到Cd2+含量比篩選平板高2 mmol·L-1的固體培養(yǎng)基上逐步馴化培養(yǎng)。以相同的方法逐步淘汰鎘耐性較差的菌株，記錄不同菌株的最高耐受濃度[7]。

1.4 菌株的性能測試

1.4.1 重金屬抗性測定

參照文獻(xiàn)[7]中的方法，將分離純化的菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600達(dá)0.2時，在培養(yǎng)液中分別加入相應(yīng)濃度(設(shè)置濃度梯度)的重金屬(Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+)，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)24 h后，測定各個含有重金屬培養(yǎng)液的D600值。

1.4.2 固氮酶活測定

將純化后的耐鎘菌株轉(zhuǎn)接到固體Ashby無氮培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d，挑選生長旺盛、較大、黏稠的菌落保存到斜面?zhèn)溆?。用乙炔還原法測定所分離細(xì)菌的固氮酶活性[11]。

1.4.3 菌株產(chǎn)鐵載體的能力分析

將純化后的耐鎘菌株采用點(diǎn)接方法轉(zhuǎn)接到CAS檢測平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～7 d，每12 h觀察一次結(jié)果，根據(jù)黃色暈圈的有無及大小篩選出產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)的菌株，保存留用。對篩選到的可產(chǎn)鐵載體的菌株，采用改進(jìn)的液體MSA培養(yǎng)基定量測定其產(chǎn)鐵載體的能力[12]。

1.5 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析

基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[13]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參照文獻(xiàn)[14]中的方法，并對其加以改進(jìn)(PCR 反應(yīng)緩沖液改用2×GC緩沖液)。PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

通過Blast程序，將待測定的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA序列進(jìn)行相似性分析[15]，利用 DNAstar構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 菌株對重金屬鎘的活化作用

將菌株N-17活化后制成菌懸液，以5%的接種量接入加有碳酸鎘(100 mg ·L-1)的液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。以加有等量去離子水的液體培養(yǎng)基為對照。每個處理重復(fù)3次，10 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，測定上清液pH值及其中Cd2+濃度，計(jì)算活化率。

將菌株N-17活化后制成菌懸液，接入重金屬鎘含量為12 mg·kg-1的土壤中(篩菌用土)，使菌株的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到2×108cfu·g-1，對照加液

體培養(yǎng)基，重復(fù)3次，30 ℃恒溫培養(yǎng)。每5 d測定1次鎘耐性菌株的數(shù)量。同時采用改進(jìn)的Tessie連續(xù)浸提法，測定土壤中不同形態(tài)鎘的含量。

1.7 N-17與印度芥菜聯(lián)合土壤修復(fù)試驗(yàn)

在湖南省微生物研究院網(wǎng)室內(nèi)開展盆栽試驗(yàn)，土壤類型為紫潮泥土(pH 5.2)。供試土壤經(jīng)晾干、粉碎、過篩后，裝盆，每盆5 kg，按照土壤質(zhì)量的1%添加N-17，以不添加N-17菌劑的為對照。每個處理重復(fù)3次，隨機(jī)排列。各處理管理措施相同。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及方差分析，采用Duncan法對有顯著差異的處理進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株N-17的形態(tài)特征及生理生化特性

經(jīng)篩選、馴化，本研究得到1株耐鎘菌株，將其命名為N-17。該菌株菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢。菌落為不規(guī)則圓形，表面光滑濕潤，易挑起，邊緣不整齊。主要生理生化特性結(jié)果詳見表1。

2.2 菌株N-17的重金屬抗性

N-17菌株對Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+表現(xiàn)出不同的程度的抗性(圖1)，其中，對鎘的抗性最高，在LB固體培養(yǎng)基上最高可耐受18 mmol·L-1的鎘。

2.3 菌株N-17的固氮能力

表1 菌株N-17的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Physiological biochemical characteristics of strain N-17

指標(biāo)Index結(jié)果Result指標(biāo)Index結(jié)果Result麥芽糖發(fā)酵Maltosefermentation-葡萄糖苷水解酶Grapeglycosidestest+乳糖發(fā)酵Lactosefermentation-蛋白水解酶Proteolyticenzymetest+蔗糖發(fā)酵Sucrosefermentation-半乳糖苷酶Glucanasetest+甘露糖發(fā)酵Mannosefermentation+檸檬酸鹽試驗(yàn)Citrateutilizationtest+阿拉伯糖發(fā)酵Arabiasugarfermentation+反硝化試驗(yàn)Denitrificationtest+果糖發(fā)酵Fructosefermentation+甲基紅試驗(yàn)Methylredtest-葡萄糖發(fā)酵Glucosefermentation+硫化氫試驗(yàn)hydrogensulfideproductiontest-山梨醇發(fā)酵Sorbitolfermentation+明膠液化試驗(yàn)Gelatinliquefactiontests-甘露醇發(fā)酵Mannitolfermentation+V?P試驗(yàn)V?Ptest+脲酶試驗(yàn)Ureasetest+吲哚試驗(yàn)Indoletest+

+表示陽性，-表示陰性。

+indicated positive;-indicated negative.

圖1 不同重金屬對菌株N-17的最低抑菌濃度Fig.1 Minimum inhibitory concentration of N-17 strain on 6 kinds of heavy metals

菌株N-17在Ashby無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h即可長出肉眼可見、明顯的菌落，其固氮酶活性高達(dá)216.83 nmol C2H4·mL-1·h-1。

2.4 菌株N-17產(chǎn)鐵載體的能力

在CAS檢測平板上，N-17菌株菌落周圍可產(chǎn)生較大的黃色水解圈(圖2)。定量分析結(jié)果表明，其鐵載體表達(dá)量高達(dá)83.4%。

2.5 菌株N-17的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株N-17的16S rDNA序列擴(kuò)增長度為1.4 kb。將測序得到的序列進(jìn)行Blast序列分析和同源性比較，并將其與同源性最高的9株細(xì)菌的16S rDNA全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)，以及分子鑒定結(jié)果，可初步判定該菌株為伯克氏菌屬。

2.6 菌株N-17對鎘的活化能力

圖2 菌株N-17產(chǎn)鐵載體的情況Fig.2 Detection of siderophore produced by strain N-17

圖3 菌株N-17的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain N-17

從表2可以看出，未接種N-17對照處理的培養(yǎng)液pH為7.25，接種菌株N-17的培養(yǎng)液pH為6.10，降低了1.15個單位。與不接菌對照相比，接種N-17菌株的培養(yǎng)液中有效鎘含量增加了13.9倍。

與對照相比，接種菌株N-17后，土壤中可交換態(tài)Cd含量增加30.9%，碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cd含量增加62.6%，鐵錳結(jié)合態(tài)Cd含量降低21.1%，殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量降低46.0%，有機(jī)結(jié)合態(tài)Cd含量無明顯變化(表3)。由此可見，菌株N-17有利于土壤中的鐵錳結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)Cd向更易被植物吸收的可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化。

表2 菌株N-17對沉淀態(tài)鎘的活化作用

Table 2 Activation of Cd by strain N-17 in medium

處理Treatment培養(yǎng)液上清中的鎘濃度Cdconcentrationinsupernatantofculturesolution/(mg·L-1)培養(yǎng)液pHpHofculturesolutionN?1798 6±0 86 10±0 26對照Control6 6±0 17 25±0 13

表3 菌株N-17處理對土壤中鎘存在形態(tài)的影響

Table 3 Effects of N-17 treatments on cadmium speciation in soils (mg·kg-1)

2.7 菌株N-17對印度芥菜鎘吸收的影響

由表4可以看出，菌株N-17處理下印度芥菜生物量較對照提高了9.41%，株高增加了20.2%，且差異顯著(P<0.05)。這可能是因?yàn)榻臃N微生物后，活化了土壤礦物中的磷、鉀等營養(yǎng)元素，促進(jìn)了植物的生長。

與對照相比，接種菌株N-17后，印度芥菜地上部和地下部鎘含量分別比對照提高了49%和67%，整株印度芥菜的鎘積累量比對照增加55%，且差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)(表5)。

表4 菌株N-17處理對印度芥菜生長發(fā)育的影響
Table 4 Effects of N-17 treatment on growth ofBrassicajuncea

處理Treatment株高Plantheight/cm生物量Biomass/gN?1725 32±1 20a120 21±2 0a對照Control21 06±0 50b109 87±1 2b

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

表5 菌株N-17處理對印度芥菜鎘吸收量的影響

Table 5 Effects of N-17 treatment on cadmium contents ofBrassicajuncea

處理Treatment地上部鎘含量Cdcontentinabovegroundpart/(mg·kg-1)地下部鎘含量Cdcontentinundergroundpart/(mg·kg-1)整株鎘積累量Cdaccumulationamountinwholeplant/(mg·kg-1)N?173 52±0 01a1 87±0 30a5 39±0 04a對照Control2 36±0 01b1 12±0 06b3 48±0 07b

3 討論

植物修復(fù)技術(shù)作為一種生物修復(fù)技術(shù)，因其原位、經(jīng)濟(jì)、綠色等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到重金屬污染土壤修復(fù)領(lǐng)域的關(guān)注。土壤中微生物種類多，繁殖快，比表面積大，代謝活動旺盛，對土壤微生態(tài)環(huán)境具有重要影響。楊卓等[16]以印度芥菜作為超富集植物，研究了巨大芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌的混合微生物制劑對植物修復(fù)重金屬污染土壤的作用。結(jié)果表明，混合微生物制劑可以促進(jìn)植物的生長，增強(qiáng)印度芥菜對重金屬的吸收，大幅提高植物修復(fù)效率，可使印度芥菜對外源添加的Cd、Pb和Zn的提取量分別提高1.18、1.54和0.85倍。

針對當(dāng)前耕地重金屬污染的長期性和復(fù)雜性，以及現(xiàn)有修復(fù)措施的局限性，本研究從鎘污染的稻田土壤中篩選到1株兼具活化碳酸鎘、分泌鐵載體和固氮能力的鎘耐性菌株N-17，結(jié)合菌體形態(tài)、生理生化及16S rDNA分析，該菌株初步鑒定為伯克氏菌屬。將該菌株與印度芥菜聯(lián)合開展土壤Cd污染修復(fù)。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株N-17不僅促進(jìn)了印度芥菜的生長，還促進(jìn)了其地上部和地下部對鎘的積累，可使印度芥菜整株的鎘積累量增加55%。

細(xì)菌鐵載體(siderophore)是由細(xì)菌分泌的一種對Fe3+具有高度特異性結(jié)合能力的小分子蛋白質(zhì)，微生物分泌的鐵載體可在植物根際復(fù)雜的土壤環(huán)境中，通過協(xié)同作用促進(jìn)植物對土壤中礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收(如鐵、磷和鉀等元素)，增加土壤中重金屬鎘的可溶出性。本試驗(yàn)所分離的N-17菌株具有分泌植物鐵載體的能力，這無疑有助于印度芥菜從土壤中富集更多的鎘。試驗(yàn)顯示，菌株N-17可降低培養(yǎng)基的pH值，這可能是因?yàn)槠浯x產(chǎn)物中含有一定量的易降解的低分子有機(jī)酸，如檸檬酸、果酸、丙二酸、酒石酸等，這些酸性物質(zhì)釋放到土壤中，亦具有活化土壤中重金屬鎘的能力。這些代謝產(chǎn)物還可通過絡(luò)合、氧化還原等作用，改變土壤中重金屬鎘的存在形態(tài)，從而提高重金屬的生物可利用性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種菌株N-17可使土壤中的鐵錳結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)Cd向更易被植物吸收的可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化。此外，N-17菌株還具有顯著的固氮活性，印度芥菜生物量的增加也可能與該菌株的固氮活性有關(guān)。

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(責(zé)任編輯 高 峻)

Isolation， identification of a Cd-resistant strain N-17 and its potential in enhancing cadmium accumulation byBrassicajuncea

DU Dongxia， DU Yu， XU Jun， YIN Hongmei， HE Yuelin*

(HunanAcademyofMicrobiology，Changsha410009，China)

A Cd-resistant strain N-17， with siderophore-producing， nitrogen-fixing and CdCO3-solubilizing capacity， was isolated from paddy soil with Cd pollution. Combined with the colony morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， N-17 was identified asBurkholderiasp. A pot experiment was done to investigate the effect of N-17 on phytoremediation of Cd polluted soil byBrassicajuncea. It was shown that this strain could significantly increase the content of exchangeable cadmium in contaminated soil. Compared with control， the biomass and plant height ofBrassicajunceainoculated with N-17 was increased by 9.41% and 20.2%， respectively. The cadmium content in aboveground and root ofBrassicajunceainoculated with N-17 was increased by 49% and 67%, respectively.

siderophore; nitrogen-fixing capacity;Burkholderiasp.; phytoremediation

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.18

2017-01-09

基金專項(xiàng)：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (13JJ2035)；農(nóng)業(yè)部、財(cái)政部“長株潭”耕地重金屬污染修復(fù)及農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)調(diào)整子項(xiàng)目(農(nóng)辦財(cái)函〔2016〕6號)

杜東霞(1980—)，女，山東荷澤人，碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)牧廢棄物處理及農(nóng)田土壤污染防控等方面的研究。E-mail: xiaxia414@126.com

*通信作者，賀月林，E-mail: 719641546@qq.com

X172

A

1004-1524(2017)05-0812-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 812-817

杜東霞，杜宇，許雋，等. 耐鎘菌株N-17的分離、鑒定及其強(qiáng)化印度芥菜富集土壤鎘的潛力[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(5)： 812-817.