呂欣榮，溫永梅 ，伍 佳，牟雁東，2(.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔種植科，四川 成都 60072)

微渠表面多孔羥基磷灰石支架體內(nèi)異位成骨性的研究

呂欣榮1，溫永梅1，伍 佳1，牟雁東1，2
(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔種植科，四川 成都 610072)

目的 通過進(jìn)行體內(nèi)非骨區(qū)域植入實(shí)驗(yàn)，評價(jià)微渠結(jié)構(gòu)對多孔羥基磷灰石支架體內(nèi)骨誘導(dǎo)性的影響。方法 選取4只比格犬的背部肌肉為實(shí)驗(yàn)區(qū)，分為微渠結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石支架(HAS-G)組和非微渠結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石支架(HAS)組，每組各兩只犬，分別植入HAS-G和HAS。并于植入1月和3月時(shí)處死后取出背肌內(nèi)植入樣本，進(jìn)行組織學(xué)檢查、力學(xué)檢測；比較兩組支架內(nèi)新骨形成情況，評價(jià)微渠結(jié)構(gòu)對多孔羥基磷灰石支架體內(nèi)異位成骨骨誘導(dǎo)性的影響。結(jié)果 兩組在背肌內(nèi)均可形成新骨，但各個(gè)時(shí)間段內(nèi)在HAS-G中形成的新生骨數(shù)量及新生血管數(shù)量均多于HAS。在抗壓強(qiáng)度測試中HAS-G也優(yōu)于HAS。結(jié)論 與HAS比較，HAS-G表現(xiàn)出明顯的力學(xué)和生物學(xué)優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。

微渠；多孔羥基磷灰石；支架；骨誘導(dǎo)性

目前，臨床上口腔種植治療時(shí)還存在著一些方面的不足與缺陷，像由于腫瘤、創(chuàng)傷或先天疾病導(dǎo)致的患者骨量不足以及無法直接有效地在頜骨上進(jìn)行種植；此時(shí)，自體骨移植由于不存在免疫排斥反應(yīng)且骨缺損修復(fù)能力較強(qiáng)，成為治療骨缺損的最佳選擇[1]；但由于頜骨有限的供骨量以及取骨會(huì)造成二次創(chuàng)傷從而極大限制了它在臨床上的應(yīng)用。對于頜骨大面積缺損的患者，臨床迫切需要一種可批量生產(chǎn)但又具有良好力學(xué)及生物學(xué)性能的替代材料，以滿足的骨缺損修復(fù)需要。

隨著該領(lǐng)域的研究不斷發(fā)展和創(chuàng)新，支架材料這一基本構(gòu)架被研究學(xué)者提出，同時(shí)利用支架材料已經(jīng)成功引導(dǎo)及參與機(jī)體細(xì)胞增殖、分化和新生骨迅速形成的過程[2]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，骨組織和新生血管的形成因生物支架表面形態(tài)的變化而受到影響，這主要是通過影響材料的微孔隙率、光滑度和支架的力學(xué)性能，進(jìn)一步調(diào)控蛋白吸附及細(xì)胞生物學(xué)行為來實(shí)現(xiàn)的[3～5]；但材料形態(tài)與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系目前研究尚不明確，其機(jī)制還需進(jìn)一步探索。近些年來的研究表明細(xì)胞生物學(xué)行為，如：細(xì)胞粘附、鋪展、遷移、增殖以及分化，不僅與周邊微環(huán)境密切相關(guān)，也與材料表面的形態(tài)密切相關(guān)[6，7]；支架材料在臨床研究進(jìn)展中受到阻礙，與其生物相容性和穩(wěn)定性的不理想密切相關(guān)。最近有一些學(xué)者通過在支架表面構(gòu)建溝槽結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠沿著溝槽方向進(jìn)行取向性遷移及生長，這些實(shí)驗(yàn)證明：不通過外加的化學(xué)修飾就可對細(xì)胞生物學(xué)行為及其功能進(jìn)行調(diào)控[8]。

1 材料與方法

1.1 材料 微渠(HAS-G)和非微渠結(jié)構(gòu)(HAS)的多孔羥基磷灰石支架由西南交通大學(xué)材料先進(jìn)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制作及提供。健康比格犬4只，均為雄性，年齡為10～14個(gè)月，體重為9～10公斤，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照2006年科技技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 方法

1.2.1 材料制備及表征 采用糖球造孔劑及濕化處理技術(shù)在多孔羥基磷灰石支架的宏孔孔壁表面構(gòu)建規(guī)則的溝槽結(jié)構(gòu)，糖球模板在濕度為70%的條件下處理24 h后所制備的多孔羥基磷灰石支架，宏孔孔壁表面上溝槽的寬度為25～30 μm，此為HAS-G。未經(jīng)過濕化處理制備的HAS宏孔孔壁表面十分平整，為非微渠結(jié)構(gòu)的多孔羥基磷灰石支架。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察材料的孔結(jié)構(gòu)及表面的微觀形貌，密度法測量多孔羥基磷灰石支架的孔隙率。試樣加工為Φ10 mm×8 mm的圓柱體，經(jīng)高溫高壓滅菌后備用。

1.2.2 支架植入及取出 4只比格犬分為HAS-G和HAS兩組各2只；采用3%戊巴比妥鈉/生理鹽水混合麻醉劑1 ml/kg經(jīng)靜脈注射麻醉，將犬只俯臥在手術(shù)臺(tái)上，背腰部位約30 cm×20 cm區(qū)域進(jìn)行褪毛、清洗和消毒處理。常規(guī)消毒與鋪巾后，手術(shù)區(qū)沿背脊中線長軸切開皮膚皮下，在左右兩側(cè)背肌內(nèi)各植入4個(gè)支架材料，各犬只共植入8個(gè)支架?？p合肌袋后用生理鹽水沖洗，分層縫合皮下組織，碘伏消毒。術(shù)后3 d內(nèi)每天肌肉注射青霉素160×104單位及碘伏棉簽消毒傷口一周預(yù)防感染。植入后1、3個(gè)月時(shí)各處死2只動(dòng)物取出所有支架材料，剔除周圍肌肉組織進(jìn)行組織學(xué)制樣等檢測，見圖1。

圖1 支架材料植入背肌過程

1.2.3 組織學(xué)檢測 每組在術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月，分別處死一只比格犬，在各只比格犬背肌內(nèi)隨機(jī)取出3塊樣品，經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋后，在長軸中心處平行于圓形截面做連續(xù)切片，經(jīng)HE染色在光鏡下觀察兩組的新生骨及血管形成情況。

1.2.4 力學(xué)檢測 各組在其余支架材料中隨機(jī)挑選3塊(平行樣本)。去除支架外層包裹的軟組織，采用Instro5567 型材料萬能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(美國英特斯朗)，進(jìn)行抗壓強(qiáng)度檢測，負(fù)載強(qiáng)度為30 kN，抗壓加載速度0.5 mm/min，載荷精度±0.25%；計(jì)算平均值。每組測量3個(gè)平行樣品，材料均按管材進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件將所得數(shù)據(jù)均進(jìn)行處理?？箟簭?qiáng)度測試的數(shù)據(jù)通過配對t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表征 HAS-G及HAS，孔隙率為80%左右，平均孔徑750～900 μm，大孔相互貫通，孔壁上有微孔，見圖2。HAS-G的宏孔孔壁表面具有25～30 μm溝槽結(jié)構(gòu)，而HAS宏孔孔壁表面平滑。

圖2 羥基磷灰石支架的掃描電鏡圖片(SEM × 500) a：微渠支架；b：非微渠支架

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 材料植入1個(gè)月和3個(gè)月后均觀察到骨誘導(dǎo)現(xiàn)象。植入1個(gè)月時(shí)，兩種多孔羥基磷灰石支架內(nèi)部可見結(jié)締組織和血管長入，宏孔內(nèi)形成薄的鈣化骨基質(zhì)沉積，其中可見少量骨細(xì)胞(圖3a 和圖4a)。隨著材料植入時(shí)間的延長至3個(gè)月后，兩種多孔羥基磷灰石支架宏孔內(nèi)的新生血管和新骨組織也明顯增加，組織學(xué)結(jié)果顯示所有支架的宏孔內(nèi)有明顯的骨痂和新骨組織形成，且新骨組織多沿宏孔孔壁生長(圖3)。在形成的新骨上有明顯的骨陷窩存在，有大量的成骨細(xì)胞和多核破骨細(xì)胞。HE染色可見，在植入背肌3個(gè)月后，HAS-G較HAS形成的新生血管的數(shù)量及新骨形成量明顯更高(圖3b 和圖4b)。

圖3 HAS-G組織學(xué)圖片(HE×100) a：1月；b：3月； NB：新生骨；S：多孔羥基磷灰石支架材料；紅色箭頭示新血管；黑色箭頭示新生骨沉積

2.3 力學(xué)性能檢測 植入材料進(jìn)行抗壓強(qiáng)度測試后，發(fā)現(xiàn)植入后材料的抗壓強(qiáng)度增強(qiáng)較植入前的材料有明顯增強(qiáng)，隨著植入時(shí)間延長至3個(gè)月后，HAS-G和HAS的抗壓強(qiáng)度均較一個(gè)月時(shí)有所增強(qiáng)，各組抗壓強(qiáng)度測試結(jié)果見表1。HAS-G和HAS植入體內(nèi)后，一個(gè)月和三個(gè)月時(shí)HAS-G的抗壓強(qiáng)度均高于HAS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，且植入三個(gè)月后較植入一個(gè)月時(shí)支架材料的抗壓強(qiáng)度也有所增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

圖4 HAS組織學(xué)圖片(HE×100) a：1月；b：3月； NB：新生骨；S：多孔羥基磷灰石支架材料；黑色箭頭示新生骨沉積

表1 兩組HA支架體內(nèi)植入后不同時(shí)期抗壓強(qiáng)度比較 (MPa)

a與未植入比較，P< 0.01

3 討論

頜骨骨缺損不僅給患者的生活來帶諸多不便，同時(shí)也對其精神造成極大的痛苦。近年來構(gòu)建組織工程骨也是頜面骨缺損修復(fù)重建領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，是指利用組織工程的原理在體外構(gòu)建具有骨誘導(dǎo)性的人工骨替代材料，用于修復(fù)骨缺損或替代喪失功能的骨組織[9]；構(gòu)建組織工程骨有三要素：種子細(xì)胞、生長因子和支架材料[10]，其中支架材料在骨缺損修復(fù)的過程中，不僅為細(xì)胞的粘附、增殖及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的沉積提供支架結(jié)構(gòu)，同時(shí)也為新生骨組織及血管長入提供生長空間[11]。在關(guān)于支架內(nèi)特異結(jié)構(gòu)方面的研究，有的學(xué)者著手于孔徑尺寸與孔形態(tài)方面對骨組織再生影響的研究，指出理想的支架應(yīng)當(dāng)同時(shí)擁有宏觀孔隙及微觀孔隙相結(jié)合的多孔結(jié)構(gòu)以促進(jìn)細(xì)胞的粘附、新骨的形成及血管的生長[12]；有的學(xué)者則探討孔隙率與貫通性對骨組織再生的影響，提出較高的孔隙率有利于細(xì)胞，血管及組織更多的生長，通過調(diào)節(jié)支架的孔隙率可以優(yōu)化其生物學(xué)功能，并調(diào)控新骨組織在支架內(nèi)的形成能力[13]；另一些學(xué)者研究材料表面微納米結(jié)構(gòu)對骨組織再生的影響，發(fā)現(xiàn)表面微納米結(jié)構(gòu)的改變會(huì)影響材料表面的粗糙度、微孔隙率及力學(xué)性能，從而影響蛋白吸附及細(xì)胞行為進(jìn)而調(diào)控組織的形成[14，15]。本實(shí)驗(yàn)從材料表面的微納米結(jié)構(gòu)這一方面出發(fā)，展開實(shí)驗(yàn)。

近年來，很多研究資料表明在材料表面形成的溝槽結(jié)構(gòu)可促使細(xì)胞沿溝槽取向性生長和遷移，調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能時(shí)也無需添加額外的化學(xué)修飾[16]。Watari等[17]將表面光滑和表面有溝槽結(jié)構(gòu)的硅基底與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)3天，發(fā)現(xiàn)RUNX2和BGLAP 的表達(dá)在具有溝槽結(jié)構(gòu)的硅基底中有明顯增加，且BMP的表達(dá)也有顯著提高，因此認(rèn)為溝槽結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)成骨誘導(dǎo)作用。Nadeem等[18]在氧化鋁陶瓷表面制備了寬度分別為10 μm和50 μm的溝槽結(jié)構(gòu)，并與細(xì)胞共培養(yǎng)21天后。發(fā)現(xiàn)在寬度為50 μm的溝槽上有更多的類骨基質(zhì)形成，得出50 μm的溝槽結(jié)構(gòu)更有利于提高陶瓷材料植入體內(nèi)骨整合性的結(jié)論。但這類研究多局限于在支架材料表面構(gòu)建溝槽結(jié)構(gòu)，而將此種結(jié)構(gòu)整合于多孔支架宏孔的表面，進(jìn)一步調(diào)控新生骨及血管的形成仍就是一個(gè)挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)從支架內(nèi)構(gòu)建微納米結(jié)構(gòu)-微渠結(jié)構(gòu)出發(fā)，探討微渠結(jié)構(gòu)對羥基磷灰石支架體內(nèi)骨誘導(dǎo)性的影響。

本實(shí)驗(yàn)以多孔羥基磷灰石為支架材料，采用糖球造孔劑及濕化處理技術(shù)，將溝槽結(jié)構(gòu)整合到三維多孔支架的表面；通過在比格犬背肌中實(shí)施體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用組織學(xué)觀察、影像學(xué)檢測及生物力學(xué)檢測的方法對骨移植材料有效骨再生的情況進(jìn)行評價(jià)[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所有樣本均觀察到成骨現(xiàn)象，支架植入1個(gè)月后即可在支架內(nèi)每個(gè)孔隙中看到一圈成骨細(xì)胞和薄層的骨基質(zhì)，孔壁周圍有骨沉積。隨著植入時(shí)間的延長，多孔羥基磷灰石支架孔壁上的骨層不斷增厚，孔壁內(nèi)新生骨、新生血管逐漸增多，但微渠組支架內(nèi)的新生骨量及血管數(shù)量仍多于同期的非微渠組。經(jīng)過改建的體內(nèi)組織工程骨移植物的力學(xué)性能較單純多孔羥基磷灰石支架材料有明顯提高，植入后的材料脆性改善，韌性增強(qiáng)，在承受應(yīng)力時(shí)不像易發(fā)生脆裂；三個(gè)月后非微渠組平均抗壓強(qiáng)度為1.658 MPa，而微渠組則增加至3.758 MPa，可以看出微渠組的力學(xué)性能的提升優(yōu)于非微渠組。從組織形態(tài)學(xué)觀察、抗壓強(qiáng)度測試及骨密度值測定等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均可看出微渠和和非微渠結(jié)構(gòu)的多孔羥基支架誘導(dǎo)新骨形成的差別。

綜上所述，微渠結(jié)構(gòu)能夠提高多孔羥基磷灰石支架在體內(nèi)成骨效果，對今后的植入材料內(nèi)孔隙表面微型結(jié)構(gòu)的研究具有一定指導(dǎo)意義，但其相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，臨床上應(yīng)用的很多問題也亟待解決。

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Osteogenesis of micro-grooved patterns of porous hydroxyapatite scaffolds in non-osseous tissue

LVXin-rong1，WENYong-mei1，WUJia1，MUYan-dong1，2
(1.SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，Sichuan，China；2.Oralimplant，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

MUYan-dong

Objective The study is aimed to evaluate the influence of the micro-grooved patterns of porous hydroxyapatite (HA) scaffolds on osteogenesis by means of implanting HA in non-osseous tissue.Methods The muscle tissue on the back of 4 Beagle dogs were taken as test area and divided into two groups (HAS-G and HAS)，2 dogs in each group.They were implanted with HAS-G and HAS，respectively.The specimens were respectively harvested at 1 and 3 months post operation for histological studies and mechanical measures.The osseous tissue formation at different times was compared between the two groups.The new bone grafts with micro-grooved patterns were evaluated.Results All kinds of scaffolds could construct new bone in muscle.However，blood vessels and number of new bone formed at each time in the HAS-G group was obvious more than those in the HAS group.The HAS-G was also better than HAS in compressive strength tests.Conclusion Compared to HAS，HAS-G show the obvious advantages of mechanics and biology.It could have brighter prospect to clinical application.

Micro-groove； Porous hydroxyapatite； Scaffold； Osteoinductive

四川省科技廳科研基金資助項(xiàng)目(編號：2016TD0008)

牟雁東

R783.1

A

1672-6170(2017)03-0028-04

2017-02-27；

2017-03-21)