徐倩倩，李彩麗，成 丹，孫澤群

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 十堰 442000

其他論著

沉默S期激酶相關(guān)蛋白2對Eca109細胞增殖的影響

徐倩倩，李彩麗，成 丹，孫澤群

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 十堰 442000

目的研究Ad-skp2-siRNA對Eca109細胞增殖的影響。方法采用熒光顯微鏡、流式細胞儀和Western bloting檢測轉(zhuǎn)染效率；采用CCK8法檢測Ad-skp2-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細胞后對奧沙利鉑耐藥的影響；采用細胞劃痕實驗和侵襲實驗檢測Ad-skp2-siRNA對Eca109細胞遷移能力的影響；采用Western blotting檢測Ad-skp2-siRNA作用Eca109細胞后對相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果Ad-skp2-siRNA能夠抑制Eca109細胞的生長和遷移，呈時間-劑量依賴性，Ad-skp2-siRNA能夠影響相關(guān)蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論沉默Skp2有助于抑制細胞增殖。

S期激酶相關(guān)蛋白2；食管癌；增殖

S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2, Skp2)是細胞周期中的重要調(diào)節(jié)蛋白，參與泛素蛋白酶體途徑，具有特異性識別底物和關(guān)鍵限速酶的作用，其在食管癌中表達且在耐化療藥的食管癌中高表達，Skp2參與細胞衰老相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促進細胞增殖與致癌作用，并可以決定細胞對DNA反應(yīng)后是凋亡還是自噬，故Skp2可能影響腫瘤耐藥的多個環(huán)節(jié)[1-2]，其在食管癌中高表達可能與食管癌的耐藥有某種聯(lián)系。本實驗選擇Skp2作為基因干預(yù)的靶點，采取RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)基因沉默技術(shù),特異性地阻斷Skp2的表達[3],探討Skp2下調(diào)后對Eca109細胞的增殖、耐藥等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與細胞培養(yǎng)人食管癌Eca109細胞(湖北省十堰市人民醫(yī)院消化研究所提供)培養(yǎng)在含100 g/L胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，置于體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每隔2～3 d用0.25%的胰蛋白酶消化傳代1次，連續(xù)傳3代后，取對數(shù)生長期的細胞。

1.2 主要試劑及抗體單抗小鼠抗人SKP2 IgG單抗(美國Zymed Laboratories公司)；Bax、Bcl-2抗體購自IBCAM公司，MMP2及MMP9抗體購自Proteintech公司，α-tubulin抗體購自sigma公司。抗E-cadherin抗體購自Bioworld Technology公司。CCK8試劑盒購自上海七海生物公司，Martrigel膠購自BD公司，Transwell小室購自Corning公司(8 μm)；流式細胞儀：Beckman Coulter(EPICS XL)，凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad，酶標儀：Tecan(Sunrise)。

1.3 Ad-skp2-siRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定本實驗所用腺病毒由湖北醫(yī)藥學(xué)院徐少勇教授饋贈[4]，本文采用的 Skp2干擾序列及對照序列均為已被應(yīng)用的序列[5]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的Skp2-siRNA序列。siSkp2 正義鏈：5′-CGCGTCGTTCTCTCGATTTAGCTTAGGCTTCAAGAGAGCCTAAGCTAAATCGAGAGAACTTTTTTGGAAA-3′；陰 性 對 照 (NC) 正 義 鏈：5′-CGCGTCAGCAGAAGTGGTATTTTCTCATTCAAGAGATGAGAAAATACCACTTCTGCTTTTTTGGAAA-3′。將載體pShuttle-H1用MluⅠ和HindⅢ雙酶切， 將以上退火形成的雙鏈寡核苷酸用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，培養(yǎng)后小提質(zhì)粒，PacⅠ酶切鑒定陽性克隆，得到pShuttle-H1-Skp2-siRNA質(zhì)粒。pShuttle-H1-NC質(zhì)粒用同樣方法獲得。分別取質(zhì)粒pShuttle-H1-Skp2-siRNA及pShuttle-H1-NC，用PmeⅠ線性化，經(jīng)純化回收后轉(zhuǎn)化帶骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的感受態(tài)大腸埃希菌BJ5183進行同源重組。37 ℃培養(yǎng)過夜，選取菌落，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用PacⅠ酶切鑒定陽性克隆，后用酚-氯仿法進行純化。純化的質(zhì)粒用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝病毒并擴增，后對重組腺病毒進行CsCl密度梯度離心純化。

1.4 Ad-skp2-siRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測細胞接種于6孔板上，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection， MOI)100 加入腺病毒，在感染3 d后用胰酶(0.25%)消化轉(zhuǎn)染的細胞，將細胞吹打成單個細胞，加入PBS，5 min，棄上清，再用PBS重新清洗2次，將細胞密度調(diào)整為1×106個/ml，上機檢測，以未轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照。

1.5 CCK8法檢測藥物作用于Ad-skp2-siRNA轉(zhuǎn)染的Eca109細胞的毒性將Eca109細胞用胰酶消化制成細胞懸液，分為正常對照組、實驗組。使用細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為7×104個/ml接種到96孔板上(100 μl/孔)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，體積分數(shù)5% CO2)24 h，待細胞貼壁后加入含奧沙利鉑的培養(yǎng)基各100 μl，使得奧沙利鉑的終濃度分別為(0 μg/ml、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml)，每組設(shè)2個復(fù)孔，待48 h后，向每孔加入10 μl CCK溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值，然后計算抑制率：抑制率(%)=(正常對照組-實驗組)/正常對照組。

1.6 細胞劃痕實驗檢測Ad-skp2-siRNA對Eca109細胞增殖的影響細胞接種于24孔培養(yǎng)板中,分為正常對照組、腺病毒組，待長到完全融合時，用200 μl Tip頭在每孔單層細胞上劃痕，造成細胞傷口模型，后用PBS沖洗2次，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0 h、6 h、12 h、24 h時用1%結(jié)晶紫染液染色，15 min后置于顯微鏡下觀察傷口愈合程度并拍照1次。

1.7 侵襲實驗按比例(1∶8)配置Matrgel膠50 μl并加入到Transwell小室內(nèi)，干燥1 h；取實驗組與正常對照組的Eca109細胞，胰酶消化，轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min,棄上清，細胞重懸于含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640中，調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml，各取200 μl加入上室，并在下室中加入含100 g/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基1 500 μl；將24孔板置于體積分數(shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，取出Transwell小室并用棉簽擦掉上室內(nèi)的Matrgel膠和上室內(nèi)底部的細胞。行1%結(jié)晶紫固定并染色，置于顯微鏡下計數(shù)觀察。

1.8 Western blotting檢測耐藥相關(guān)蛋白按MOI 100加入Ad-skp2-siRNA，72 h后收集細胞，冰PBS洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液,于冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管，4 ℃ 1 000 r/min，離心5 min,取上清。蛋白上樣量70 μg，10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)120 min，電壓70 V；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加抗Skp2 (1∶1 000)、抗Bcl-2 (1∶1 000)、抗Bax (1∶1 000)、抗MMP9 (1∶500)、抗MMP2 (1∶500)、抗E-cadherin (1∶1 000)、抗N-cadherin (1∶1 000)，以a-tubulin為內(nèi)參(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，分別以羊抗兔二抗(1∶10 000)反應(yīng)2 h，洗膜后ECL顯色成像，Image J軟件讀出條帶的灰度值，求出各目的條帶與內(nèi)參的灰度值比值，即相對蛋白含量，設(shè)control組的相對對照蛋白含量為1，計算各組與對照組的相對蛋白含量比值。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率實驗組與正常對照組的細胞分別通過流式細胞儀和Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效率。實驗組轉(zhuǎn)染率為95.4%，對照組轉(zhuǎn)染率為2.05%(見圖1)。

2.2 Ad-skp2-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細胞后對藥物敏感性的影響分別以1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml濃度的奧沙利鉑作用于正常對照組與腺病毒組48 h后測得IC50為17.37 μg/ml，以奧沙利鉑濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線，實驗組與正常對照組相比，OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.3 Ad-skp2-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細胞后對其遷移能力的影響實驗組與正常對照組在0 h、6 h、12 h、24 h的細胞侵襲結(jié)果顯示(見圖3)，加入Ad-skp2-siRNA的實驗組(7.0±1.3)與正常對照組(22.1±3.5)比較，相同時間內(nèi)穿過24孔-小室微孔膜數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)；與腫瘤細胞遷移有關(guān)的蛋白：MMP2顯著增加[(98.1±4.6)%vs(125.8±2.7)%](P<0.05)，MMP9顯著減少[(99.3±1.2)%vs(38.1±2.5)%](P<0.05，見圖5)。

圖1 流式測轉(zhuǎn)染效率、免疫熒光及Western blotting檢測沉默效果

圖2 食管癌Eca109細胞的增殖曲線

圖3 不同時間點兩組細胞遷移情況

圖4 Transwell 結(jié)果

圖5 Western blotting 檢測相關(guān)蛋白水平

2.4 Western blotting檢測有關(guān)增殖蛋白的表達Western blotting檢測結(jié)果顯示，加入腺病毒后，實驗組與正常對照組比較：相關(guān)蛋白Bax顯著增加[(38.2±4.7)%vs(98.1±3.1)%](P<0.05)，Bcl-2顯著減少[(122.1±3.2)%vs(75±2.2)%](P<0.05)，E-cadherin顯著增加[(40.2±3.8)%vs(110.1±3.7)%](P<0.05)，N-cadherin顯著減少[(93.2±3.3)%vs(65.0±1.7)%](P<0.05，見圖6)。

圖6 實驗組與正常對照組的相關(guān)蛋白表達

Fig 6 The expressions of apoptosis related proteins in experimental group and normal control group

3 討論

食管癌是5年生存率<16%的高度惡性腫瘤，對于已轉(zhuǎn)移的腫瘤，88%的患者選擇外科手術(shù)治療[6]，所以,對于術(shù)后的化療十分重要。奧沙利鉑是目前食管癌化療的一線藥物，以鉑類化療藥為基礎(chǔ)的多藥耐藥是食管癌治療中的主要問題之一[7-8]。由于耐藥機制的復(fù)雜性，所選擇的靶點基因也應(yīng)涉及耐藥機制的多環(huán)節(jié)，Skp2是F-box蛋白家族成員之一，具有癌蛋白的特性，是細胞周期中重要的調(diào)節(jié)因子,能特異性識別磷酸化底物并介導(dǎo)其泛素化降解, 其通過降解多種細胞周期調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細胞周期S、G2期的運行。Skp2還參與細胞衰老相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，研究證實磷酸化功能域缺失的Skp2突變蛋白可徹底失去其促進細胞增殖與致癌作用[9-11]。

本實驗旨在研究Ad-skp2-siRNA與體外培養(yǎng)的Eca109細胞的關(guān)系，采用CCK8驗證了Ad-skp2-siRNA能夠降低Eca109細胞的耐藥性，且隨著濃度的增加，抑制效果愈加明顯；采用劃痕實驗和侵襲實驗直觀地表示Ad-skp2-siRNA能夠顯著地抑制Eca109細胞的遷移，且與侵襲相關(guān)的蛋白MMP2的顯著升高與MMP9的顯著降低也從Western blotting方面驗證了Ad-skp2-siRNA對Eca109細胞的遷移的抑制作用；文中與凋亡有關(guān)的Bcl-2的降低與Bax的升高證明了Ad-skp2-siRNA增加了Eca109細胞凋亡的能力，也證明了沉默Skp2能夠促進食管癌細胞發(fā)生凋亡，抑制其增殖，介導(dǎo)細胞黏附的相關(guān)蛋白E-cadherin的增加與N-cadherin的降低也從細胞連接與遷移方面證明了Ad-skp2-siRNA對于Eca109細胞的抑制作用。

綜上所述，Ad-skp2-siRNA能夠增加Eca109細胞對藥物的敏感性，抑制Eca109細胞的遷移及增值，但腺病毒是通過何種通路以及過程中所包含的一系列細胞活動還有待進一步深入研究，但這也為臨床上抵抗腫瘤細胞的耐藥及抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移找到了一個新的契機。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Effects of S-phase kinase-associated protein 2 gene silence on proliferation of esophageal cancer Eca109 cells

XU Qianqian, LI Caili, CHENG Dan, SUN Zequn

Department of Gastroenterology, Hubei University of Medicine, Shiyan People’s Hospital, Shiyan 442000, China

Objective To observe the effects of S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) gene silence on proliferation of esophagus cancer Eca109 cell.Methods Ad-skp2-siRNA was transfected into Eca109 cells. Flourescence microcope, flow cytometry and Western blotting were used to detect transfecting efficiency. The metastatic potential and apoptosis were examined by cell wound model, CCK8 assay, Boyden chamber invasion assay and Western blotting in vitro.Results Ad-skp2-siRNA inhibited the proliferation and migration of Eca109 cells, showed time-dose dependent. Ad-skp2-siRNA could influence the expressions of resistance proteins, the difference was significant (P<0.05).Conclusion Skp2 gene silence can contribute to inhibite the proliferation and migration of Eca109 cells.

S-phase kinase-associated protein 2; Esophageal cancer; Proliferation

徐倩倩，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：食管癌的基因易感性。E-mail: 455482761@qq.com

孫澤群,博士，主任醫(yī)師，研究方向：食管癌的基因易感性。E-mail: wwwszq@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.02.017

R735.1

A 文章編號：1006-5709(2017)02-0177-04

2016-04-23