劉亞嵐，蔣冬先，侯英勇，徐一凡，宿杰阿克蘇，曾海英，高 峰，張小壘，徐 晨

·論 著·

食管鱗狀細胞癌中PD-L1的表達及其預后意義

劉亞嵐，蔣冬先，侯英勇，徐一凡，宿杰阿克蘇，曾海英，高 峰，張小壘，徐 晨

目的 分析PD-L1表達與食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)臨床病理因素的相關性和預后價值。方法 采用免疫組化法檢測253例ESCC組織中PD-L1的表達，PD-L1陽性分別被定義為1%與5%的腫瘤細胞陽性。Kaplan-Meier 法構(gòu)建生存曲線，單因素和多因素Cox回歸模型分析獨立的預后因素。結(jié)果 腫瘤表達PD-L1的患者有預后較好的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。把患者分為Ⅰ+Ⅱ期(60.9%，154/253)和Ⅲ+Ⅳa期(39.1%，99/253)兩個亞組，在Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1表達是獨立的預后因子，提示患者預后較好(1%為分界值，P=0.046和0.021；5%為分界值，P=0.011和0.004)；而在Ⅲ+Ⅳa期患者中，PD-L1表達與患者預后無明顯相關性(1%為分界值，P=0.586和0.682；5%為分界值，P=0.807和0.620)。結(jié)論 不同分期的ESCC中，PD-L1表達的預后意義存在差異。在Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1表達是獨立的預后因子，而在Ⅲ+Ⅳa期患者中無預后意義。

食管腫瘤；鱗狀細胞癌；PD-L1；臨床分期；預后標志物

食管癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，2015年中國食管癌患者高達478 000例，其中375 000例死亡[1]。中國食管癌占全球的70%，其中95%為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)。近年來盡管治療水平明顯提高，ESCC仍然是主要的致死癌癥之一，5年的生存率低于20%。最近，針對免疫檢查點藥物引領了腫瘤治療進入免疫治療的新時期，也為ESCC的治療提供新策略[2]。研究表明很多腫瘤PD-L1蛋白表達與臨床病理因素存在相關性[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃癌中表達并提示患者預后較差。但是，另外一些報道則表明PD-L1與預后缺乏相關性，或者其表達提示預后較好。在ESCC中，現(xiàn)有的少量關于PD-L1預后的研究結(jié)果卻存在不一致現(xiàn)象[5-6]。因此，有必要進一步探討PD-L1表達在ESCC中的預后意義。本實驗利用組織芯片采用免疫組化法檢測253例ESCC中PD-L1的表達，以分析其表達與臨床病理特征的關系，探索其在ESCC中的預后意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2007年～2010年復旦大學附屬中山醫(yī)院手術切除的ESCC組織253例?；颊咝g前均未行放、化療，診斷及臨床分期參照AJCC指南。收集患者的臨床和病理資料，包括性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、腫瘤分化程度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.2 組織芯片 復習HE切片，選取代表性的區(qū)域，從供體蠟塊中取出(2 mm寬，6 mm長)的組織垂直接種于受體蠟塊中，制作組織芯片[6]。每個組織芯片包括70個位點，胃癌組織被用作起始標記點。

1.3 免疫組化 組織芯片制備4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，pH 9.0緩沖液中加熱10 min進行抗原修復。一抗為PD-L1兔單克隆抗體(稀釋比1 ∶300，Origene公司)，使用全自動免疫組化儀Ventana Benchmark XT進行免疫組化Polymer Conjugate法染色。

1.4 結(jié)果判讀 PD-L1染色陽性為胞質(zhì)和(或)胞膜中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。組織芯片中PD-L1的表達情況經(jīng)兩位病理醫(yī)師獨立評估。評估陽性細胞在腫瘤細胞中所占的百分比，參考相關文獻及在食管癌中的相關研究，分別將1%陽性和5%陽性定義為腫瘤PD-L1陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學分析 利用χ2檢驗和Fisher確切概率法分析PD-L1表達和臨床病理因素的相關性?；颊唠S訪至2015年8月15日。Kaplan-Meier和Log-rank法進行生存分析。Cox回歸模型進行單因素和多因素生存分析。采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 253例ESCC患者中位年齡62歲(37～83歲)，其中男性212例，女性41例。110例有吸煙史。腫瘤部位：食管上段占4.7%，食管中段48.2%，食管下段42.7%。149例(58.9%)腫瘤分化高～中等，104例(41.1%)腫瘤分化較低。46例(18.2%)腫瘤存在脈管癌栓，68例(26.9%)腫瘤存在神經(jīng)侵犯，120例(47.4%)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。依據(jù)第7版AJCC分期標準，154例(60.9%)患者為臨床Ⅰ+Ⅱ期，99例(39.1%)患者為Ⅲ+Ⅳa期(表1)。

表1 食管鱗狀細胞癌中PD-L1表達與臨床病理特征的關系

253例腫瘤中，將1%定義為分界值時，49.0%的腫瘤PD-L1陽性；將5%定義為分界值時，43.9%的腫瘤PD-L1陽性(圖1)。PD-L1表達與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、浸潤深度、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無明顯相關性(P>0.05，表1)。

AB

圖1 食管鱗狀細胞癌中PD-L1的表達：A.PD-L1陰性；B.PD-L1陽性，Polymer Conjugate法

2.2 ESCC患者的生存分析 患者中位隨訪時間為33個月(4～102個月)，148例患者出現(xiàn)疾病進展，149例死亡，其中144例死于ESCC。

PD-L1陽性患者的無瘤生存(disease free survival, DFS)和總生存期(overall survival, OS)比PD-L1陰性患者延長，但差異無統(tǒng)計學意義(1%作為分界值時，P=0.175和0.090；5%作為分界值時，P=0.099和0.057)。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤深度、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與DFS和OS相關；多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者獨立預后因子。

在臨床Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1陽性患者的DFS和OS比PD-L1陰性患者明顯延長(1%為分界值，P=0.046 和0.021；5%為分界值，P=0.011和0.004)。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性(5%為臨界值)、腫瘤部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與DFS和OS相關；多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1陽性(5%為臨界值)、腫瘤部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者獨立預后因子。而在Ⅲ+Ⅳa期患者中，PD-L1陽性患者的DFS和OS與PD-L1陰性患者無明顯差異(1%為分界值，P=0.586和0.682；5%為分界值，P=0.807和0.620)。單因素生存分析僅發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤深度與DFS和OS潛在相關(P=0.047和0.051，圖2，表2、3)。

表2 單因素和多因素Cox回歸模型分析與食管鱗狀細胞癌患者DFS相關的危險因素

表3 單因素和多因素Cox回歸模型分析與食管鱗狀細胞癌患者OS相關的危險因素

3 討論

PD1-PD-L1通路在腫瘤進展過程中發(fā)揮重要的作用。多種腫瘤中均存在PD-L1的表達，通過與腫瘤微環(huán)境的相互作用，PD-L1發(fā)揮免疫抑制作用。但是對于PD-L1表達的預后價值，目前的研究中存在相互沖突的結(jié)論。人群、檢測方法以及臨界值的差異，可能是潛在的原因。

圖2 生存分析 A～D.在全部食管鱗狀細胞癌患者中，PD-L1陽性患者的無瘤生存和總生存期潛在好于陰性患者(1%為分界值，P=0.175和0.090；5%為分界值，P=0.099和0.057)；E～H.Ⅰ+Ⅱ期PD-L1陽性患者的無瘤生存和總生存期明顯好于陰性患者(1%為分界值，P=0.046和0.021；5%為分界值，P=0.011和0.004；I～L.Ⅲ+Ⅳa期PD-L1陽性患者與陰性患者的預后差異無統(tǒng)計學意義(1%為分界值，P=0.586和0.682；5%為分界值，P=0.807和0.620)

在以往研究中，大部分學者將所有患者當作一個整體，未考慮臨床分期的差異。本實驗分別在臨床Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳa期中，評估PD-L1的表達情況。進而發(fā)現(xiàn)在臨床Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1表達與患者預后好相關；在臨床Ⅲ+Ⅳa期患者中，PD-L1表達與患者生存期無明顯相關性。這表明PD-L1表達的預后意義是有條件的，僅局限于臨床早期。在以前的研究中，也發(fā)現(xiàn)不同分期的患者中，分子標志物的預后意義不一致。如在結(jié)直腸癌中，與晚期患者相比，錯配修復基因缺陷的預后意義在早期患者中更顯著[8]；在非小細胞肺癌中，PD-L1僅在早期患者中是預后好的因素[9]。因而在預后分析中，出現(xiàn)不一致的結(jié)論時，可以在不同分期的患者中分別進行分析，推測不一致結(jié)論的潛在原因。

在不同的水平(mRNA水平和蛋白水平)上評估PD-L1的表達，可能是以往研究中出現(xiàn)沖突結(jié)論的潛在原因。如在乳腺癌中，一些學者發(fā)現(xiàn)檢測PD-L1 mRNA的表達提示延長的無復發(fā)生存期[10]，而另外一些學者發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白表達提示較差的預后[11]。以mRNA為基礎的方法，在檢測時難免會同時檢測腫瘤細胞和非腫瘤細胞的mRNA表達，導致結(jié)果出現(xiàn)偏差；而免疫組化的優(yōu)點在于準確的定位，能夠識別腫瘤細胞和非腫瘤細胞，減少結(jié)果的偏差。本實驗利用組織芯片采用免疫組化法檢測PD-L1的表達，避免了mRNA方法的缺陷。

PD-L1陽性分界值的選擇差異，可能導致以往研究結(jié)論的差異。最近Borghaei等[12]研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌中，當分界值為1%時，PD-L1表達與患者的總反應率和無進展生存期明顯相關。在以往的研究中，5%也被用于臨界值，進行預后分析。本實驗分別以1%和5%為分界值，評估PD-L1表達在ESCC中的預后意義，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達在較早期患者(I+Ⅱ期)中，是獨立的預后因子。對比這兩個分界值，本組實驗結(jié)果顯示分界值為5%時單因素和多因素分析顯示差異均具有統(tǒng)計學意義，而1%為分界值時只在單因素分析顯示差異有顯著性，因此，對于食管癌，5%可能是一個更值得推薦的分界值。

在非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和惡性黑色素瘤中，均有報道指出PD-L1表達提示患者預后較好，而其中的分子機制尚不清楚?？赡艿慕忉屖蔷植课蓙y的細胞免疫反應。一些學者認為PD-L1可能通過其它未知受體傳遞信號，造成T細胞增殖和細胞因子的釋放(如IL-10和INFγ)。在不同程度上，機體的免疫環(huán)境會影響腫瘤的生長。需要進一步的研究來解釋PD-L1作用的分子機制。

本組實驗發(fā)現(xiàn)在較早期ESCC中，PD-L1表達(5%為臨界值)是獨立的預后因子，提示患者預后較好。而在較晚期ESCC患者中，PD-L1表達無預后意義。提示PD-L1表達的預后意義有一定的局限性。較晚期ESCC中復雜的分子機制，可能影響了PD-L1的生物學作用。這些數(shù)據(jù)也表明在臨床實踐中，應該在不同分期的腫瘤中，分別評價分子標志物的預后意義。

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Expression of PD-L1 and its prognostic role in patients with esophageal squamous cell carcinoma

LIU Ya-lan, JIANG Dong-xian, HOU Ying-yong, XU Yi-fan, SU Jieakesu, ZENG Hai-ying, GAO Feng, ZHANG Xiao-lei, XU Chen
(DepartmentofPathology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Purpose To analyze the correlations between PD-L1 expression and clinicopathological factors and their prognostic values in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) patients. Methods PD-L1 expression in the primary tumors from 253 patients with ESCC was evaluated using tissue microarray and immunohistochemistry (IHC). PD-L1 positivity was defined as positive staining of 1% and 5% tumor cells. Survival curves were constructed by using the Kaplan-Meier method. Univariate and multivariate Cox proportional hazard regression models were performed to identify associations with outcome variables. Results Overall, tumoral PD-L1 expression was potentially associated with favorable DFS and OS. When the patients were stratified into stage Ⅰ+Ⅱ (60.9%, 154/253) and stage Ⅲ+Ⅳa (39.1%, 99/253), the prognostic role was not consistent. In patients with stage Ⅰ+Ⅱ disease, tumoral PD-L1 expression was associated with better DFS and OS upon multivariate analysis (1% as the cutoff:P=0.046 and 0.021, 5% as the cutoff:P=0.011 and 0.004). However, PD-L1 expression was not correlated with prognosis in patients with stage Ⅲ+Ⅳa disease (1% as the cutoff:P=0.586 and 0.682, 5% as the cutoff:P=0.807 and 0.620). Conclusion The prognostic role of tumoral PDL expression is variable in different stages of ESCC, and tumoral PDL expression is an independent favorable predictor in ESCC patients with Stage Ⅰ-Ⅱ disease, but not in stage Ⅲ-Ⅳa or lymph node metastasis.

esophageal neoplasms; squamous cell carcinoma; PD-L1 expression; clinical stage; prognostic marker

上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)重點薄弱學科建設基金(2015ZB 0201)

復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

劉亞嵐，女，主治醫(yī)師。E-mail: yalanliu@163.com 徐 晨，男，主治醫(yī)師，通訊作者。E-mail: xuchenmail@126.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.001.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)04-0355-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.001

接受日期：2017-03-07