張鳳成 魏澤寧 李傳潔 李亞男

增齡因素對大鼠成骨細(xì)胞BMP-Smad通路基因表達(dá)的影響*

張鳳成 魏澤寧 李傳潔 李亞男

目的：通過檢測機體在單一因素變量(增齡性改變)的影響下，機體BMP-Sm ad成骨信號基因的表達(dá)趨勢，探討增齡對該通路因子的影響。方法：成年、中年、老年未交配SD大鼠雌雄各4只，處死后獲取大鼠顱蓋骨及股骨。顱蓋骨采用組織塊法行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期；股骨采用Q-PCR檢測BMP-Smad成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況并繪制趨勢圖譜。結(jié)果：成年大鼠的成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期活躍，其DNA合成期(S期)的成骨細(xì)胞比例明顯高于中年大鼠；BMP-Smad成骨相關(guān)因子隨著增齡而出現(xiàn)明顯的降低，而該通路的始發(fā)因子BMP-2因子的改變并不明顯，甚至在機體步入老年后有升高的趨勢；來源于骨組織的成脂因子的表達(dá)同樣伴隨著機體的增齡呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論：增齡會導(dǎo)致機體的成骨能力逐漸降低，成骨細(xì)胞的活性逐漸下降；BMP-Smad信號通路的成骨因子隨著增齡其表達(dá)趨勢逐漸下降；機體成骨能力的下降和成脂能力的增強可能促使BMP-2因子的穩(wěn)定表達(dá)甚至輕微升高。

增齡；BMP-2；Runx2；Osterix；PPARγ；細(xì)胞周期

骨組織生長、發(fā)育、代謝和衰老分別表現(xiàn)為骨量的增加或減少，在組織學(xué)上則以骨生成和骨重建的方式進行[1]。成骨細(xì)胞作為骨組織細(xì)胞的重要成員，是骨形成和改建的主要功能細(xì)胞，該細(xì)胞主要由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，在分化發(fā)育的過程中主要經(jīng)歷四個階段：細(xì)胞增殖、基質(zhì)分泌、基質(zhì)成熟、基質(zhì)礦化[2]。從分子生物學(xué)角度來講，多條信號通路參與了成骨細(xì)胞分化和骨形成的調(diào)節(jié)，其中最重要、也是最早發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的一條通路為BMP-Smads，構(gòu)成該通路的BMP-2、Runx2、Osterix因子相互作用介導(dǎo)成骨，三種因子的表達(dá)趨勢很好的代表了該條通路乃至整個成骨通路的表達(dá)活性[3]。另外，PPARγ因子的表達(dá)往往與成骨因子表達(dá)趨勢相反，結(jié)合該因子的同期檢測對成骨因子表達(dá)趨勢的解釋更加具備客觀性。依照國際普遍采用的美國國家衰老研究所(National Institute on Aging，NIA)標(biāo)準(zhǔn)，本實驗選取成年大鼠(6月齡)、中年大鼠(12月齡)以及老年大鼠(20月齡)作為實驗對象，檢測機體BMP-2、Runx2、Osterix三種成骨因子的表達(dá)趨勢，輔以細(xì)胞周期以及PPARγ因子的檢測，探討增齡對于BMP-Smads成骨通路因子表達(dá)的影響。

1．材料與方法

1．1實驗動物健康未交配6月齡、12月齡、20月齡SD大鼠雌雄各4只共計24只(由301醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供)。

1．2 基因檢測及細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑及設(shè)備BMP-2測定試劑盒，Runx2測定試劑盒，Osterix測定試劑盒，PPARγ測定試劑盒(上述試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供)、RNA酶抑制劑DEPC(NOVON，北京)、DMEM培養(yǎng)基(杭州四季青公司)、青霉素-鏈霉素(碧云天公司)、0．25%胰酶和EDTA(GIBICO，美國)、細(xì)胞凍存液DMSO (Sigma，美國)、PCR儀(A ligent，美國)、核酸濃度測量儀(Themo nano-drop，美國)、酶標(biāo)儀(Therm o，美國)等。

1．3 大鼠基因表達(dá)的檢測SD大鼠處死前禁食12h，稱量每只SD大鼠體重，采用3%戊巴比妥鈉注射液，按照30mg/kg的劑量進行腹腔注射達(dá)到深入麻醉的效果。獲取雙側(cè)股骨組織，注意保留關(guān)節(jié)處，徹底去凈肌肉等軟組織后置于液氮中保存。

獲取RNA：取凍存組織研磨，加入Trizol及氯仿液，室溫靜置5m in 后置于離心機12000rpm，4℃離心15m in，取上清液并加入等體積異丙醇靜置10m in再次于離心機12000rpm，4℃離心10m in75%乙醇清洗沉淀并干燥，溶解于DEPC處理水中。

加入逆轉(zhuǎn)錄引物：計算公式為：XμlRNA+1μl Oligo(dT)15引物+(9-X)μl 無核酸酶水=10μl。置于70℃水浴鍋中，預(yù)變性5m in，然后置于冰上2m in。向每個樣品管中加入10μl配置好的RT-M ix。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，依次為退火(25℃，5m in)、延伸(42℃，5m in)、失活(70℃，15m in)。終止(4℃)。

PCR擴增：引物設(shè)計見表1。首先在95℃條件下預(yù)變性，然后在95℃條件下變性15分鐘，60℃條件下退火延伸1m in，該過程循環(huán)35-40次，最后依次在95℃和60℃條件下進行溶解曲線分析PCR擴增。

表1 相關(guān)基因PCR引物圖

1．4 成骨細(xì)胞培養(yǎng)、鑒別及細(xì)胞周期測定①成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒別獲取大鼠顱蓋骨并將組織剪成1mm*3mm左右的組織塊，用PBS緩沖液清洗組織塊3次，加入0．25%胰酶震蕩消化8m in，離心收集組織塊，將收集的組織塊再次剪碎至0．5mm* 0．5mm大小，將組織塊轉(zhuǎn)入混有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶內(nèi)，4h靜待組織貼壁后翻轉(zhuǎn)平放，將適量培養(yǎng)液加到非細(xì)胞生長面上，定期換液并觀察細(xì)胞形態(tài)；采用倒置顯微鏡連續(xù)觀察動態(tài)細(xì)胞形態(tài)。②采用流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞周期三次，并取平均值獲取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×106cells/L接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，收集細(xì)胞并用PBS清洗細(xì)胞沉淀并重懸，孵育離心并再次用PBS清洗細(xì)胞，加入8%的小牛血清重懸打勻，混入70%乙醇后于4℃固定30m in，1000rpm/m in離心5m in，吸出乙醇和PBS，加入RNA酶37℃孵育30m in，流式細(xì)胞儀檢測，Mod Fit軟件分析DNA數(shù)據(jù)，獲取G0/G1、S、G2/M期對應(yīng)的成骨細(xì)胞數(shù)，計算增殖指數(shù)(Proliferation Index)，PI=S+G2/M。

1．5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17．0軟件檢測數(shù)據(jù)是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，數(shù)據(jù)的走勢圖采用GraphPad Prism 5．0進行繪制。為避免統(tǒng)計學(xué)分析中Ⅰ類錯誤(假陽性)概率控制在α范圍內(nèi)(α=0．05)，多組樣本均數(shù)的兩兩比較采用SNK法，P＜0．05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2．結(jié)果

2．1 體重變化趨勢24只SD大鼠生長情況良好，健康，未交配。大鼠的體重隨著增齡逐漸呈現(xiàn)出升高的趨勢，在此期間大鼠并未出現(xiàn)系統(tǒng)性疾病，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)SNK法分析可以得出三組之間的兩兩比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(見圖1)。

圖1 體重變化趨勢圖

2．2 基因表達(dá)情況Runx2、Osterix基因mRNA表達(dá)趨勢:6月齡大鼠表達(dá)量最高，12月齡大鼠較6月齡大鼠表達(dá)下降，20月齡大鼠的表達(dá)量最低。三者中兩兩比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05) (見圖2)。

圖2 Q-PCR結(jié)果圖

PPARγ基因m RNA表達(dá)趨勢：隨著增齡亦呈現(xiàn)降低趨勢。三者中兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05，P＜0．01)。

BMP-2基因m RNA表達(dá)趨勢：6月齡大鼠表達(dá)量最高，12月齡大鼠表達(dá)下降，而20月齡大鼠的表達(dá)量卻有輕度升高。雖然后二者之間并無統(tǒng)計學(xué)差異，但這種趨勢和上述的成骨因子表達(dá)具有明顯的相反趨勢。

2．3 成骨細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞周期的測定倒置顯微鏡下觀察6月齡和12月齡大鼠體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞均具有較好的代表性，其形態(tài)和數(shù)量均較理想，其中尤以成年雄性大鼠的最為典型：鏡下觀察可見細(xì)胞呈現(xiàn)典型的長梭形，有較大突起，胞漿較豐富(見圖3，圖4)。

圖3 組織塊培養(yǎng)成骨細(xì)胞圖(×100)

圖4 細(xì)胞周期圖

對于成年和中年大鼠的細(xì)胞周期，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，6月齡大鼠的G0/G1期(DNA合成前期)細(xì)胞比例相對較低，而S期、G2/M期(DNA合成期及合成終止期)的細(xì)胞比例相對較高，增值指數(shù)PI較高；而12月齡大鼠組的G0/G1期細(xì)胞比例要比成年大鼠高(P＜0．05)，而S期、G2/M期細(xì)胞比例要比成年大鼠低(P＜0．05)。

3．討論

機體的間充質(zhì)干細(xì)胞在各種刺激因子的調(diào)控下分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的分化成熟及礦化是骨發(fā)生的基礎(chǔ)，該過程通過眾多調(diào)控因子組成的信號傳導(dǎo)途徑啟動骨特異性轉(zhuǎn)錄因子和生長因子的表達(dá)[4，5]。其中BMP/Smads通路是主要的信號傳導(dǎo)途徑，該通路包括的因子較多，例如BMP-2、Smads、Runx2、M sx2、Osterix等，上述因子相互作用構(gòu)成BMP-Smad通路的分支較多，但構(gòu)成該通路主干的代表性基因為BMP-2、Runx2、Osterix，三種基因的表達(dá)趨勢能夠很好的代表機體成骨的活性[2]。

通過對不同月齡大鼠上述三者基因的檢測可以達(dá)到研究增齡對于BMP-Smad成骨信號通路影響的目的。按照美國國家衰老研究所(NIA)標(biāo)準(zhǔn)[6]，對于SD大鼠而言，成年大鼠的指標(biāo)為6-8月齡，老年大鼠的指標(biāo)為20-26月齡，而介于二者之間的則為中年大鼠。本實驗結(jié)合檢測指標(biāo)特性，同時參考國際學(xué)者普遍采用的鼠齡[7]，選取6月齡、12月齡以及20月齡分別作為成年大鼠、中年大鼠以及老年大鼠標(biāo)準(zhǔn)[8]。

Runx2和Osterix基因均是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對于骨組織的形成和重建起到重要作用。早在2004年國外學(xué)者Enomoto等[9]就明確發(fā)現(xiàn)，Runx2基因敲除的小鼠無法有效的形成成骨細(xì)胞，即使在BMP-2因子存在的情況下，這點在顱骨組織中表現(xiàn)的尤其突出，但該因子的缺乏卻保留了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為正常脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的能力。Osterix因子同樣是機體成骨不可或缺的因子，其對于機體成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)，需要首先經(jīng)過雙向潛能或多項潛能的分化[10]。Runx2在骨形成中的主要作用體現(xiàn)在軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs, mesenchymal stem cells)向成骨細(xì)胞的分化，以及刺激肥大軟骨細(xì)胞的分化，因而Runx2的突變引起的骨異常是二者共同作用的結(jié)果，而Osterix的突變雖然同樣抑制成骨細(xì)胞的分化，但破骨細(xì)胞、血管侵入以及軟骨分化均是正常的。雖然二者的機理不同，但是Runx2和Osterix基因的突變都是以骨形成缺失和成骨細(xì)胞分化數(shù)量減少為特征的，Nakash ima[11]和Katagiri[12]等的實驗發(fā)現(xiàn),Runx2因子的缺乏并未檢測到Osterix的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但Osterix因子的缺乏卻能夠檢測到正常的Runx2表達(dá)量，因而得出Osterix位于Runx2的下游發(fā)揮機體成骨誘導(dǎo)。該實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在增齡性改變的情況下，Runx2與Osterix的表達(dá)均表達(dá)為下降趨勢，符合機體增齡性成骨分化的特點。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP，bone morphogenetic p rotein)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族最大的一類，是一種分泌性多功能蛋白，該因子作為BMP信號通路的首發(fā)因子在成骨誘導(dǎo)和分化過程中至關(guān)重要，具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，促進成骨細(xì)胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長發(fā)育及其重建過程，進而加速骨缺損的修復(fù)[13]。但相關(guān)研究表明，BMP因子并不是成骨專屬因子，BMP-2和BMP-4能夠促進多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向分化，該路徑通過BMPR-ⅠA實現(xiàn)，其與經(jīng)典成骨通路中的BMP通路存在共性：上游基因均是BMP-2和Smads，根據(jù)后續(xù)基因的不同分別發(fā)揮成骨和成脂作用[14，15]，因而，隨著機體增齡性改變，成骨能力的下降和成脂能力的增強促使BMP-2基因的表達(dá)趨于穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)后續(xù)增高的現(xiàn)象。

脂肪細(xì)胞的分化主要通過MAPK通路，在該通路中，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ，peroxisome proliferator-activated receptor)是異常關(guān)鍵的信號因子[16]。PPARγ不但能促進前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，而且與成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪形成密切相關(guān)，在成脂的終末分化過程中，各種激素如糖皮質(zhì)激素和胰島素等和多種炎癥因子如前列腺素和白介素1等都可直接或間接通過調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)來促進或抑制成脂[17]，隨著機體增齡性改變，脂肪細(xì)胞的分化能力逐漸增強，相對應(yīng)的，來源于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的PPARγ因子的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢[18]，但是PPARγ因子同樣可以在骨組織中表達(dá)，雖然其表達(dá)量要比脂肪組織的中的量低得多[19]，本實驗中的PPARγ基因的mRNA來源于股骨組織而非來源于脂肪組織，所以該產(chǎn)物的表達(dá)情況并不能如實反映機體的成脂活性，只能代表骨組織中成脂活性的改變[20]，結(jié)果提示，源于骨組織的PPARγ基因的表達(dá)隨著增齡呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，與脂肪組織來源的PPARγ表達(dá)相反。

成骨細(xì)胞周期能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，同樣可以反應(yīng)機體的成骨活性[21]：G0期細(xì)胞屬于靜止期細(xì)胞，尚未進入增殖狀態(tài)，G1期代表DNA合成前期，S期為DNA合成期，G2期為DNA合成后期，此期DNA成為四倍體，其中S期和G2期為細(xì)胞周期的兩個限制點，代表了細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞能否越過此限制點是增殖的關(guān)鍵[22]。實驗中顯示，成年大鼠處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例要明顯高于中年大鼠，增殖指數(shù)更高，表明成年大鼠更多成骨細(xì)胞進行分化中年大鼠的成骨細(xì)胞大多數(shù)被阻滯在G0/G1期，該實驗提示成骨細(xì)胞活性隨著增齡逐漸降低甚至停滯。

本實驗中老年大鼠則難以培養(yǎng)出成骨細(xì)胞。當(dāng)前，對于老年鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)多集中于小鼠[23]，采用常規(guī)的酶消化法已經(jīng)可以獲得形態(tài)良好的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，細(xì)胞活性與機體活力相一致[24]。而對于老年大鼠的成骨細(xì)胞培養(yǎng)則鮮有報道。因而我們推測是大鼠相對于小鼠過快的代謝率導(dǎo)致細(xì)胞活性過低的緣故[25]，但其中的具體機理仍需要進一步實驗進行探討。

上述成骨因子的表達(dá)特性并非該實驗所特有，前期學(xué)者同樣研究了機體在系統(tǒng)性疾病狀態(tài)下成骨因子的表達(dá)變化。李傳潔等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在雌激素缺乏導(dǎo)致大鼠機體出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的狀況下，以Runx2、ALP為代表的成骨因子表達(dá)趨勢下降，骨密度減低，成骨能力減弱，而成脂能力增強；魏澤寧等[27]同樣發(fā)現(xiàn)，在一型糖尿病大鼠模型中，成骨相關(guān)因子例如Runx2、一型膠原(COL2A 1)、BGP、Osterix等表達(dá)活力下降，成骨標(biāo)記產(chǎn)物降低。

成骨通路中另外一條同等重要的路徑便是W nt/β-catenin通路，目前的研究證實該通路不但促進成骨，而且還能夠抑制脂肪細(xì)胞的分化[28]，很多相關(guān)實驗證明二者在相同因素下的表達(dá)趨勢是一致的，但能否說明增齡對于W nt/β-catenin通路的作用是否同BMP-Smad相同則有待進一步探討。

4．總結(jié)

機體隨著增齡性改變，成骨細(xì)胞的增殖指數(shù)和活性逐漸降低甚至出現(xiàn)停滯；構(gòu)成BMP-Smad通路因子的Runx2和Osterix的表達(dá)伴隨機體的增齡呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而BMP-2因子在步入老年后的的表達(dá)出現(xiàn)了回升，主要是由于此時機體的成脂作用逐漸增強的緣故；來源于骨組織的PPARγ因子的表達(dá)伴隨著增齡亦呈現(xiàn)下降趨勢，此時該因子代表的是骨組織而非脂肪組織的成脂活性的改變。

本實驗彌補了增齡狀態(tài)下BMP-Sm ad信號通路因子的表達(dá)改變，有望為骨組織工程學(xué)研究提供一個新的思路。

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Theeffectsofaging on theexpression of BMP-Smad signalpathway gene

ZHANG Feng-cheng,WEIZe-ning,LIChuan-jie,LIYa-nan(Medical Research Center of Stomatology,Chinese PLA GeneralHospital,Beijing 100853,China)

Objective:Through detecting the expression of BMP-Smad in the body under the influence of a single factor variable (aging), to investigate the effect of aging on the pathway factor. Methods:Selcting 4 male and female virgin SD rats in adult, m idd le age and old age, then get the calvaria and femur of rats after the execution. Culturing the osteoblasts w ith tissue block method and analysising cell cycle w ith flow cytometry; Q-PCR were used to detect the expression of relevant genes and map the trend. Results:Cell cycle of the adult rats are more active, their DNA synthesis phase (S phase) of the osteoblast cell ratio was significantly higher than that of middle-aged rats (P＜0.01); the expression of osteogenic related genes in BMP-Smad significantly decrease with aging,but the initiating factor of BMP-Smad pathwaythe-BMP-2 does not change obviously, it even rise when the body enters old age; the adipohenic related genes derived from bone tissue also declines w ith aging as well as the osteogenic factors. Conclusion:Aging could lead to the reduction of the osteogenic ability and the decline of the osteoblast activity; The expression of Osteogenic factor in BMP-Smad signaling pathw ay gradually decreased w ith increasing age. BMP-2 express stablely even rise due to the decline of osteogenic ability and the enhancement of adipogenic ability.

Aging; BMP-2; Runx2; Osterix; PPARγ; Cell Cycle

R783

A

1672-2973(2017)02-0107-06

2016-10-19)

張鳳成 解放軍總醫(yī)院口腔科碩士生北京100853

魏澤寧 解放軍總醫(yī)院口腔科碩士生北京100853

李傳潔 解放軍總醫(yī)院口腔科碩士生北京100853

李亞男 通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔科副主任醫(yī)師副教授北京100853