史悅怡 任儀鵬 張蕾步 榮發(fā)

口腔鱗癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中Treg水平關(guān)系的研究*

史悅怡 任儀鵬 張蕾步 榮發(fā)

目的：初步探索口腔鱗狀細胞癌患者外周血中和腫瘤微環(huán)境中Treg免疫細胞的分布狀況。方法：對我院30例未經(jīng)其他治療的60歲以上口腔鱗癌患者進行標本及外周血采集，通過流式細胞術(shù)檢測相關(guān)細胞水平，采用ch iss2004軟件統(tǒng)計分析。結(jié)果：1． OSCC患者外周血中CD4+CD25highFox P3+細胞含量與對照組無明顯差異。2． OSCC患者外周血中CD4+CD25highCD127low細胞含量高于正常對照。3． Treg中CD31+Treg比例OSCC患者高于對照組。4． OSCC患者腫瘤局部微環(huán)境中存在T reg的浸潤。結(jié)論：OSCC患者存在T reg的水平異常，我們推斷Treg的浸潤有可能抑制了全身及局部微環(huán)境中抗瘤因素的抑瘤效應(yīng)。

口腔鱗癌；Treg免疫；細胞腫瘤微環(huán)境

頭頸腫瘤每年發(fā)病超過100萬例，約占全球成人惡性腫瘤的3%[1,2]。其中95%頭頸惡性腫瘤是鱗癌[3]。而口腔鱗狀細胞癌OSCC又在其中占約四分之一[4]。雖然放化療方法一直在進步，但是近40年來OSCC的5年生存率卻無很大改善[5]。于是學者們開始探索人體自身的免疫系統(tǒng)在頭頸鱗癌中的影響和機制，并且已有的研究成果發(fā)現(xiàn)機體免疫系統(tǒng)對頭頸部鱗癌的影響很大[6,7]，其疾病進展機制中很重要的一項就是對抗腫瘤免疫的免疫耐受以及免疫逃逸能力[8,9]。這提示我們必然存在調(diào)整這些免疫效應(yīng)的方法。

調(diào)節(jié)性T細胞Treg是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑制性T細胞，可以抑制其它T細胞的激活、增殖和效應(yīng)功能[10]。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對于有效免疫的抑制可能助長了腫瘤的免疫逃逸[11,12]。鼠腫瘤的研究證明了這一點：剔除Treg細胞可以促進鼠對幾種腫瘤的排斥，包括黑色素瘤、纖維肉瘤、非白血性白血病、骨髓瘤[13]。

目前對于OSCC患者的Treg分布是否存在異常還不明確。本實驗的目的就在于初步探索OSCC患者外周血中和腫瘤微環(huán)境中Treg的分布狀況，為明確OSCC患者免疫狀態(tài)異常狀況，尋找干預(yù)方法打下基礎(chǔ)。

1．病例及標本

1．1 血液標本全部血液標本取自解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科2015年10 月- 2016年4月的住院口腔鱗癌60歲以上患者。所有患者手術(shù)前均未行放射治療、化學治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。對照組來自輸血中心健康獻血者。兩組各30例。患者資料見表1。

表1 30例患者資料

1．2 組織標本全部腫瘤組織標本均取自上述30例患者，且經(jīng)病理學確診為鱗狀細胞癌。切取腫瘤實體部分，避開腫瘤周邊緣及壞死區(qū)域。所有患者手術(shù)前均未行放射治療、化學治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。

1．3 實驗方法

1．3．1 標本處理

血液樣本：空腹采取靜脈血5m l，保存于NH抗凝管，顛倒混勻六次，帶回實驗室立即進行處理，術(shù)后如病理診斷為鱗狀細胞癌則納入統(tǒng)計范圍。

組織樣本：所有組織標本取出后迅速放在含有10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基內(nèi)，帶回實驗室立即按下列步驟處理：

(1)取下標本后立即送實驗室進行細胞分離。將手術(shù)中取得的組織塊用PBS沖洗，洗去殘余的血液；

(2)然后用剪刀剪成0．1-0．2m c直徑大小；

(3)用混合的消化酶溶液(包含0．1%Ⅳ型膠原酶、0．002%I型DNA酶和0．01%V型透明質(zhì)酸酶，Sigma)在37℃下消化2小時；

(4)200目的消毒濾網(wǎng)過濾；

(5)用75%和100%fiacl液進行密度梯度離心(1500r/m in×15m in)，離心后收集75%和100% fiacl液交界界面上的細胞，即為淋巴細胞；

(6)PBS洗滌，1000r/m in×10m in離心后去上清，共2次，收集沉淀細胞待用。

1．3．2 流式細胞術(shù)檢測以血液樣本為例：采用兩步法標記。組織樣本處理時提取組織浸潤淋巴細胞后進行細胞計數(shù)，設(shè)定每管2×105個細胞進行抗體處理。

依據(jù)流式細胞儀操作說明書進行檢測。檢測時，標記了特異性熒光染料的單細胞懸液和鞘液，分別經(jīng)硅化管進入流動室，形成鞘液包裹細胞懸液的穩(wěn)態(tài)單細胞液柱，其以穩(wěn)定的層流形式通過噴嘴高速射下，液柱與水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，單個細胞上標記的熒光染料在通過激發(fā)光光斑時被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光，同時，由于混合細胞群中細胞大小和胞內(nèi)顆粒的多少會被激發(fā)而產(chǎn)生不同的散射光。被接收的光電信號被放大后進入計算機系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、儲存、分析、處理，并運用軟件程序?qū)Y(jié)果進行綜合分析從而獲得多參數(shù)數(shù)據(jù)和圖像。本研究中，每一個樣本收集分析2× 105個細胞，采用CellQuest分析軟件對結(jié)果進行分析并作圖。

1．4 統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)使用chiss2004軟件統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果用表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，采用直線相關(guān)分析量指標的相關(guān)性，P＜0．05 為有差異，P＞0．05 無差異。

2．結(jié)果

2．1 OSCC組及正常對照組細胞檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計軟件分析結(jié)果見表2。

表2 兩組標本細胞中Treg含量檢測結(jié)果的比較(x±s)

2．2 OSCC患者外周血中CD4+CD25highFoxP3+細胞含量與對照組無明顯差異外周血中Treg細胞含量(以CD4+CD25++FoxP3+表示)OSCC患者(5．38%±1．05%)和正常對照(4．42%±0．93%)比較，P=沒有統(tǒng)計學差異(圖1)。

圖1 以CD4+T細胞含量為100%進行流式分析

2．3 OSCC患者外周血中CD4+CD25highCD127low細胞含量高于正常對照以CD4+CD25highCD127low代表Treg，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25highCD127low細胞在OSCC患者外周血中含量(7．35%±1．97%)高于對照組(5．64%±0．88%)，P＜0．05(圖2)。

圖2 以CD4+T細胞含量為100%進行流式分析

2．4 Treg中CD31+Treg比例OSCC患者高于對照組OSCC患者CD31+Treg(CD31-CD4+ CD25highCD127lowCD31+)占22．2%±1．35%，對照組CD31+Treg占16．4%±1．17%，兩者差異有統(tǒng)計學意義，P＜0．05(圖3)。

圖3 以T reg(CD 4+CD 25highCD127low)含量為100%進行分析

2．5 OSCC患者腫瘤局部微環(huán)境中存在Treg的浸潤為了明確OSCC患者腫瘤微環(huán)境中是否存在Treg的浸潤，采用流式細胞術(shù)檢測了OSCC組織內(nèi)Treg的含量，以CD4+FoxP3+代表Treg細胞，發(fā)現(xiàn)OSCC腫瘤組織內(nèi)存在Treg細胞浸潤的現(xiàn)象。以CD4+T細胞為100%，其百分含量達到20．178±5．66%(圖4)。

圖4 以CD4+T細胞含量為100%進行流式分析

3．討論

3．1 OSCC患者外周血中Treg含量升高試驗中我們檢測了OSCC患者外周血中Treg水平以確定OSCC患者外周血液中Treg是否存在異常，結(jié)果顯示Treg水平較正常人升高。

我們知道Treg大概可以分為兩類：直接由胸腺釋放的natural Treg(nTreg)和由外周休眠CD4+T細胞受到特異性抗原刺激并在細胞因子的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化而來的induced Treg (iTreg)[14,15]。很多研究表明nTreg以細胞間接觸的方式發(fā)揮抑制作用，而iTreg則是以細胞因子依賴途徑發(fā)揮抑制作用[16,17]。所以進一步我們以區(qū)分Treg來源的CD31標記Treg細胞，發(fā)現(xiàn)OSCC患者外周血中CD31+的來自胸腺的nTreg比例比正常組要高。這說明外周血中的Treg水平升高主要是來自胸腺新近釋放的nTreg增多。雖然外周血中Treg細胞含量水平還是相對較低的，但總體的Treg水平提高也許提示機體處于一種免疫抑制的狀態(tài)，有效的免疫應(yīng)答受到一定的抑制，這在多大程度上以及通過何種途徑影響OSCC的發(fā)展還需要進一步研究。

還有一點值得提出的是Treg的檢測方法。在開始實驗的階段我們采用了CD4+CD25highFoxP3+作為Treg的選擇標準，結(jié)果顯示OSCC患者和正常人外周Treg沒有差異。但是進一步采用最近研究比較多的CD127進行標記，發(fā)現(xiàn)Treg水平存在差異。兩種檢測方法結(jié)果不同的原因在于在很多CD25低表達或不表達的CD4+ T細胞中, 甚至一定條件下的CD8+ T 細胞中也有Foxp3表達[18]。雖然不知道在其它疾病或者腫瘤中的狀況如何，但是我們認為在OSCC的研究中CD4+CD25highCD127low作為篩選Treg細胞的標準,既保證了Treg細胞的完整性,又避免了效應(yīng)性T細胞等非Treg細胞的干擾[19]。

3．2 OSCC腫瘤微環(huán)境中存在Treg的浸潤前期研究發(fā)現(xiàn)了OSCC患者外周血Treg水平升高，但在總體免疫細胞中占比較低，雖然這說明了機體存在明顯的免疫異常，但是在局部組織內(nèi)的免疫狀況如何卻不清楚。畢竟局部的免疫微環(huán)境更加直接的對腫瘤生長產(chǎn)生影響。所以我們進一步采用流式細胞術(shù)檢測了OSCC患者腫瘤組織內(nèi)的浸潤淋巴細胞TILs。發(fā)現(xiàn)局部腫瘤組織內(nèi)存在明確的Treg浸潤并且水平較高，達到了20%的比例水平。其原因可能是外周細胞的聚集，也可能是局部微環(huán)境利于Treg的分化。總之Treg的浸潤機制還不清楚，需要進一步探索。既往研究中提示初始CD4+T在TGF-β單獨作用下可以向Treg分化或許是機制之一[20]。

4．結(jié)論

綜上所述，OSCC患者存在Treg的水平異常，在外周血中水平升高，在瘤組織內(nèi)存在浸潤現(xiàn)象，根據(jù)以往的研究結(jié)果我們提出Treg的浸潤有可能抑制了全身及局部微環(huán)境中抗瘤因素的抑瘤效應(yīng)。在后續(xù)的研究中應(yīng)該著眼于這兩類因素的平衡，找到適當?shù)恼{(diào)控靶點，使其向著控制腫瘤生長的方向發(fā)展。參考文獻

[1] Sathiyasekar AC, Chandrasekar P, Pakash A, et al． Overview of immunology of oral squamous cell carcinoma． Journal of pharmacy & bioallied sciences[J]． 2016, 8(Suppl 1)：S8-s12

[2] Shin JM, Kamarajan P, Fenno JC, et al． Metabolom ics of Head and Neck Cancer：A M ini-Review[J]． Frontiers in physiology, 2016, 8(7)：526

[3] 尚丹丹, 陳鵬． 頭頸部鱗癌靶向治療的研究進展[J]． 中華老年口腔醫(yī)學雜志, 2016, 14(2)：120-124

[4] Lau A, Li KY, Yang W F, et al． Induction chemotherapy for squam ous cell carcinom as of the oral cavity：A cumu lative meta-analysis[J]． Oral oncology,2016, 61：104-114

[5] Warnakulasuriya S． Global epidem iology of oral and oropha-ryngeal cancer[J]． Oral oncology, 2009, 45(4-5)：309-316

[6] Loose D, Van de W iele C． The immune system and cancer[J]．Cancer b iotherapy & radiopharmaceuticals, 2009, 24(3)：369-376

[7] Dillman RO． Cancer imm unotherapy[J]． Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals, 2011, 26(1)：1-64

[8] Leibow itz MS, Nayak JV, Fer ris RL． H ead and neck cancer immunotherapy：clinical evaluation[J]． Current oncology reports, 2008, 10(2)：162-169

[9] Topping KP, Fletcher LM, Agada FO, et al． Head and neck tum ou r imm unology：basic concepts and new clin ical imp lications[J]． The Journal of laryngology and otology, 2009, 123(1)：9-18

[10] Ren CF, Zhao YX, H ou CF, et al． Expression of solub le programmed death-1 protein in peripheral blood regulatory T cells and its effects on rheum atoid arth ritis progression[J]．Molecular medicine reports, 2016：28

[11] Chen W, Jin W, H ardegen N, et al． Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regu latory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3[J]． The Journal of experimental medicine, 2003, 198(12)：1875-1886 [12] W ei S, K ry czek I, Zou W． Regulatory T-cell com partm entalization and trafficking[J]． Blood, 2006, 108(2)：426-431

[13] On izuka S, Taw ara I, Sh im izu J, et al． Tum or rejection by in vivo adm inistration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor alpha) m onoclonal antibody[J]． Cancer research, 1999, 59(13)：3128-3133

[14] Pank ratz S, Ruck T, M euth SG,et al CD4(+)H LA-G(+) regulatory T cells：Molecular signature and pathophysiological relevance[J]． H um an imm unology, Sep 2016, 77(9)：727-733 [15] 張素欣, 劉哲敏, 段玉芹, 等． 調(diào)節(jié)性T細胞在口腔鱗癌患者外周血及癌組織中的表達和意義[J]． 腫瘤防治研究． 2013(11)：1041-1045

[16] W ing K, Fehervari Z, Sakaguch i S． Emerging possibilities in the development and function of regulatory T cells[J]． International immunology, 2006, 18(7)：991-1000

[17] Singh UP, Singh NP, Guan H, et al． The emerging role of leptin antagon ist as potential therapeutic option for inflamm atory bow el d isease[J]． International review s of imm unology, 2014, 33(1)：23-33

[18] Seddik i N, Santner-Nanan B, M artinson J, et al． Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates betw een hum an regulatory and activated T cells[J]． The Jou rnal of experimental medicine, 2006, 203(7)：1693-1700

[19] H artigan-O'Connor DJ, Poon C, Sinclair E, et al． Human CD4+ regulatory T cells express low er levels of the IL-7 receptor alpha chain (CD127), allow ing consistent iden tification and sorting of live cells[J]． Journal of immunological m ethods, 2007, 319(1-2)：41-52

[20] W an S, Xia C, Morel L． IL-6 produced by dendritic cells from lupus-prone m ice inh ib its CD4+CD25+ T cell regulatory functions[J]． Journal of immunology (Baltimore, Md．：1950), 2007, 178(1)：271-279

Study on the relationship between Treg level in peripheralb lood and tumorm icroenvironment of patientsw ith oral squamouscell carcinoma

SHI Yue-yi,REN Yi-peng,ZHANG Lei,BU Rong-fa(Department of Stomatology,Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853,China)

Objective:o investigate the distribution of Treg immune cells in peripheral blood and tumor m icroenvironment of patients with oral squamous cell carcinoma (OSCC). M ethods:30samples of primary OSCC cancer patients were analyzed w ith flow cytometry for Treg expression. Result:1. There was no significant difference in CD4+CD25highFoxP3+ cells between the venous blood groups and control groups. 2. The CD4+CD25highCD127lowcells in venous blood groups were higher than control groups. 3. The proportion of CD 31+Treg of Treg in OSCC was higher than control groups. 4. There was Treg infiltration in local m icro-environment of OSCC patients. Conclusion:OSCC patients w ith abnormal levels of Treg, w e infer that the infiltration of Treg may inhibit the anti-tumor effects of anti-tumor factors in the whole body and local m icroenvironment.

oral squamous cell carcinoma;T-cell Infiltration;tumor micro-environment

R782

A

1672-2973(2017)02-0077-05

2016-10-26)

史悅怡 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科碩士生北京100853

任儀鵬 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科主治醫(yī)師北京100853

張蕾解 放軍總醫(yī)院口腔頜面外科副主任醫(yī)師北京100853

步榮發(fā) 通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科主任醫(yī)師教授北京100853