陳致印,羅 瑩,劉廣軍,李魏巍,譚顯勝

(湖南人文科技學院,湖南省農(nóng)田雜草防控技術與應用協(xié)同創(chuàng)新中心∕農(nóng)藥無害化應用省高校重點實驗室,湖南417000)

土黨參為桔?？浦参镅蛉?Codonopsis lanceolataTrautv.)的根,別名山海螺、四葉參、羊乳參等[1]。據(jù)谷紅霞等[2]研究,土黨參中主要含有生物堿、甾萜類、黃酮類、揮發(fā)油、多種氨基酸、微量元素、多糖和蛋白質等成分。蛋白質是構成人體細胞、組織、器官的重要成分[3-4]。本試驗參照呂薇等[5]、楊志偉等[6]、張治強等[7]對蛋白質提取采用的設計方法,采用磷酸緩沖液代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鹽或堿提取液,通過Box-Behnken旋轉中心組合試驗優(yōu)化土黨參蛋白質微波輔助提取工藝,為土黨參蛋白粉生產(chǎn)或其他參類植物蛋白質利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土黨參:婁底市新化縣土黨參試驗田;牛血清白蛋白(生化試劑):國藥集團化學試劑有限公司;溴甲酚綠、甲基紅、考馬斯亮藍G-250:天津市光復科技發(fā)展有限公司;氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、無水碳酸鈉:國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸、濃硫酸:湖南匯虹試劑有限公司;無水乙醇、硼酸、磷酸、石油醚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純:天津市化學試劑工廠。

1.2 主要設備

KDN系列凱氏定氮儀:上海洪紀儀器設備有限公司;雷磁25-S酸度計:上海儀電科學儀器股份有限公司;Mini-1240紫外分光光度:島津公司;Anton Paar微波消解萃取儀:安東帕公司;SHIMADZU AUW120D分析天平:日本島津公司;LDZ5-2低速自動平衡離心機:北京雷勃爾離心機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 技術路線

土黨參→預處理→50℃烘干至恒重→粉碎過80目篩→石油醚在35—40℃下回流90 min去脂→乙醇洗滌2—3次→在鼓風干燥箱中50℃烘干→加入提取劑在微波消解儀中提取→3 800 r∕min離心18 min→收集上清液→測定蛋白質含量。

1.3.2 單因素試驗

準確稱取1 g土黨參粉,考察提取液分別為蒸餾水,磷酸緩沖溶液(0.2 mol∕L,pH 7),10%NaCl溶液,NaOH 溶液(0.2 mol∕L,pH 10);pH 為 6、7、8、9、10、11;提取時間(min)為 2、6、10、14、18、22;提取溫度(℃)為 46、48、50、52、54、56;液料比(mL∕g)為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1時,固定微波功率為305 W,測定蛋白質含量,考察不同參數(shù)對土黨參蛋白質提取率的影響。每個水平重復3次。

1.3.3 旋轉中心設計優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理,結合單因素影響試驗結果,考慮到溫度對提取率影響不大,且不好控制,溫度不作為響應面法的影響因素。固定溫度為50℃,選取pH、時間、液料比作響應面試驗,因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.4 蛋白質含量的測定

以牛血清蛋白為標品,采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量。以牛血清蛋白質量濃度(μg∕mL)為橫坐標(x),吸光度為縱坐標(y)繪制濃度-吸光度標準曲線。用紫外分光光度計測定吸光度,代入蛋白質標準曲線中,計算得出土黨參蛋白質含量。

蛋白提取率=提取的土黨參蛋白含量∕土黨參粉中總蛋白含量×100%

土黨參粉中總蛋白含量,采用微量凱氏定氮GB 5 009.5—2010《食品中蛋白質的測定》的方法測定。

1.3.5 響應面分析

運用Design-Expert 8.05b數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析對試驗結果進行多元回歸擬合,回歸模型方差分析,回歸系數(shù)顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

采用微量凱氏定氮GB 5 009.5—2010《食品中蛋白質的測定》的方法,測得土黨參中總蛋白質的含量為7.29%。 當以牛血清蛋白質量濃度(μg∕mL)分別為0、20、40、60、80、100 時,得到標準曲線,見圖 1。 標準曲線方程:y=0.0067x+0.0005,R2=0.9994。結果表明,牛血清蛋白標準溶液的質量濃度在0—100 μg∕mL范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

2.2 提取劑的選取

由圖2可見,4種提取溶液對土黨參中蛋白質的提取有明顯的差異,其中磷酸緩沖溶液提取率最高,達到8.85%,蒸餾水提取率最低,為4.45%,而NaCl溶液和NaOH溶液提取率在兩者之間。因此,后續(xù)試驗以磷酸緩沖溶液為提取劑,進一步優(yōu)化提取條件。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum protein

圖2 不同提取液對土黨參蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of extracting solutions on extraction rate of lance asiabell root proteins

2.3 pH對提取率的影響

不同pH對蛋白質提取率的影響顯著,與一般植物蛋白在堿溶條件下提取規(guī)律相符。如圖3所示,隨著pH的增加,提取率先增加后逐步下降后又上升,pH為8時達到最大。這可能是因為在pH為9及以后的溶液添加了強堿氫氧化鈉,導致提取率有所上升,但考慮蛋白質的活性,當pH大于11時,其強堿作用對蛋白質活性有影響,降低其商業(yè)價值,故pH大于11后不再試驗。所以綜合考慮選取pH為8的緩沖溶液為響應面法中心點。

2.4 時間對提取率的影響

如圖4所示,當微波時間在2—22 min時,隨著時間的延長,蛋白質提取率有拐點出現(xiàn),即在6 min時達到8.62%,隨后大幅度降低。這可能是因為蛋白質隨著時間延長溶出達到飽和,再延長時間蛋白質在微波消解儀的變性分解,使蛋白質提取率下降,或者是因為蛋白質和淀粉結合,使蛋白質難以溶出。所以選擇6 min為響應面法中心點。

圖3 pH對土黨參蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of lance asiabell root proteins

圖4 提取時間對土黨參蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of extracting time on extraction rate of lance asiabell root proteins

2.5 溫度對提取率的影響

如圖5所示,不同溫度對蛋白質提取率的影響較小,在46—56℃范圍內,隨著溫度的升高,蛋白質提取率變化的幅度不大,最高點為50℃時8.61%,而最小者在46℃時8.43%,說明在46—50℃這個溫度區(qū)間內,由熱變性而造成的提取率降低影響不大,50℃以上可能有部分蛋白質變性,導致提取率下降明顯?？紤]到溫度對提取率影響不大,且不好控制,溫度不作為響應面法的影響因素。

2.6 液料比對提取率的影響

不同液料比對蛋白質提取率的影響見圖6。當液料比從10∶1增加到35∶1時,隨著液料比的增大,蛋白質提取率逐漸增大,到25∶1的拐點時,達到最大值,后出現(xiàn)下降趨勢。原因可能是蛋白質隨溶劑分子的增多,相互作用力增強,不易析出。所以綜合考慮選25∶1的液料比為響應面法中心點。

圖5 提取溫度對土黨參蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of extracting temperature on extraction rate of lance asiabell root proteins

圖6 液料比對土黨參蛋白質提取率的影響Fig.6 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of lance asiabell root proteins

2.7 數(shù)據(jù)分析

按照試驗設計每個處理重復試驗3次,提取率取平均值,試驗結果見表2。對響應面法模型進行方差分析和回歸系數(shù)顯著分析,見表3。

表2 試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and result

表3 回歸模型的方差分析和回歸系數(shù)的顯著檢驗Table 3 Variance analysis of regression model and significance test for regression coefficients

對表2的試驗結果采用Design-Expert 8.05b軟件進行多元回歸擬合,得到土黨參蛋白質得率(Y)對pH(A)、時間(B)、液料比(C)的二元多項式回歸模型為:

Y=10.52-0.53A+0.11B+0.32C+0.05AB-0.15AC-0.081BC-1.19A2-0.4B2-0.78C2

由表3方差分析可以檢測該模型的擬合度。由表3可知,試驗所選模型F=87.77,P=0.0001＜0.01,表明模型極顯著,模型P=0.0001,失擬項P=0.9786＞0.05,表明該模型對試驗的干擾僅0.01%,可以忽略不計,模型的決定系數(shù)R2=0.9912,說明該模型能解釋99.12%響應面值的變化是由pH、時間、液料比引起的,說明該模型能較好地擬合提取率和實驗因素之間的關系,并預測出最優(yōu)的工藝條件組合。其中,當回歸系數(shù)P＜0.01時,表明該項回歸系數(shù)差異極顯著;當回歸系數(shù)P＜0.05時,表明該項回歸系數(shù)顯著。因此,A、C對土黨參蛋白提取影響是極顯著的,二次項A2、B2、C2對土黨參蛋白提取的曲面效應極顯著,B對土黨參蛋白提取影響顯著,而此3個因素的交互作用AB、AC、BC對提取的影響不顯著。同時還可得出,影響土黨參蛋白提取率的主次因素依次為A＞C＞B,即pH＞液料比＞時間。

2.8 響應面分析

根據(jù)回歸模型作出響應面圖和等高線圖,考察擬合響應面形狀,分析各因素對土黨參蛋白提取率的影響,結果見圖7—9。

圖7 pH和時間對土黨參蛋白提取率的影響Fig.7 Effects of pH and extracting time on extraction rate of lance asiabell root proteins

圖8 pH和液料比對土黨參蛋白提取率的影響Fig.8 Effects of pH and liquid-material ratio on extraction rate of lance asiabell root proteins

圖9 時間和液料比對土黨參蛋白提取率的影響Fig.9 Effects of extracting time and liquid-material ratio on extraction rate of lance asiabell root proteins

由圖7可知,提取液料比為25∶1時,隨著pH的升高,土黨參蛋白提取率隨時間的延長增加,然后下降。由圖8可知,在時間為6 min時,隨著pH的升高,土黨參蛋白提取率隨液料比的增加而增加。由圖9可知,在pH為8時,隨著時間的延長,土黨參蛋白提取率隨液料比的增加而增加,達到峰值后下降。

利用Design-Expert 8.05b軟件結合回歸模型,預測土黨參蛋白提取率的最佳提取工藝參數(shù)為pH為7.77,提取時間為6.41 min,液料比為26.1∶1(mL∕g),土黨參蛋白理論提取率達到10.62%。對優(yōu)化參數(shù)進行3次重復驗證,得到土黨參蛋白提取率為10.58%,與理論值沒有顯著差異,進一步驗證了回歸模型的合理性。

3 結論

通過單因素試驗,確定各因素的范圍,利用旋轉中心組合設計-響應面法分析對pH、液料比、時間3個因素對土黨參蛋白提取率的影響進行分析。最終確定微波輔助最佳提取工藝參數(shù)為pH 7.77,提取時間6.41 min,液料比26.1∶1(mL∕g),溫度50℃,微波功率為305 W,該工藝條件下的土黨參蛋白提取率為10.58%。

曹川等[8]利用響應面優(yōu)化微波輔助提取貽貝蛋白的工藝研究,最大的蛋白質回收率為74.83%。張治強等[7]利用響應面法優(yōu)化苦瓜籽蛋白質提取工藝,采用了鹽溶法提取苦瓜籽蛋白質,最后提取率為23.80%,較優(yōu)化前提高了3.24倍。通過研究可以得出響應面分析是能優(yōu)化蛋白質提取率的。本研究為提取土黨參蛋白及其應用提供了理論依據(jù),但試驗只研究了土黨參蛋白質的提取工藝,沒有對其進行純化和鑒定,也沒有對其結構和性質進行探究,可以作為下一步研究方向。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草:第20卷[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1999.

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