王 琦 向 波 李亞楠 趙一洋

·基礎(chǔ)研究·

偽狂犬病毒法示蹤成年大鼠排便反射神經(jīng)通路的研究

王 琦 向 波 李亞楠 趙一洋

目的 通過偽狂犬病毒示蹤技術(shù)，探索成年大鼠排便反射相關(guān)的神經(jīng)通路。 方法 選擇正常成年SD大鼠（體重230～250 g）14只，隨機分為實驗組和對照組，實驗組（10只）于末端直腸壁內(nèi)注射偽狂犬病毒（Bartha株）10～20μL；對照組A（2只）經(jīng)肛門向直腸腔內(nèi)注射偽狂犬病毒（Bartha株）20μL，對照組B（2只）于腹腔內(nèi)注射偽狂犬病毒（Bartha株）20μL。兩組大鼠均于注射病毒96 h后處死，取出腦干及脊髓，進行免疫組化染色分析。 結(jié)果 實驗組大鼠的脊髓各節(jié)段中均出現(xiàn)偽狂犬病毒陽性的神經(jīng)元細胞，其中T13～L1、L6～S1節(jié)段中病毒陽性的神經(jīng)元數(shù)量較多（T13：47.5±2.9；L1：64.5±2.5；L6：30±2.1；S1：68.5±3.5），腦干Barrington氏神經(jīng)核團處亦出現(xiàn)偽狂犬病毒陽性的神經(jīng)元細胞（143.5±8.1）。對照組大鼠的脊髓及腦干內(nèi)均未檢測出偽狂犬病毒陽性細胞。 結(jié)論 實驗組的偽狂犬病毒示蹤結(jié)果具有較高的特異性；成年大鼠的排便反射神經(jīng)通路在脊髓內(nèi)與L6至S1以及T13至L1節(jié)段關(guān)系密切，在腦干內(nèi)則與Barrington氏神經(jīng)核團關(guān)系密切。

狂犬病病毒；大鼠；排便；反射；神經(jīng)通路；脊髓

排便反射通常是在大腦的高級中樞以及脊髓低級中樞共同調(diào)節(jié)下完成，當(dāng)直腸壁內(nèi)的感受器受到刺激時，感覺沖動傳導(dǎo)至位于脊髓的低級排便中樞，同時也傳導(dǎo)至位于大腦的高級中樞。當(dāng)環(huán)境允許時，大腦內(nèi)的高級中樞一方面發(fā)出沖動調(diào)節(jié)脊髓低級排便中樞加強其活動，另一方面則下傳沖動至肛門外括約肌，使其松弛，完成排便過程［1-2］。本實驗使用具有逆向跨突觸傳播、自我復(fù)制和特異性傳導(dǎo)三大特點的偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）作為神經(jīng)示蹤劑，以直腸末端為靶器官，逆向示蹤調(diào)節(jié)末端直腸活動的相關(guān)神經(jīng)元位于脊髓及腦干中的位置，從而了解大鼠排便反射神經(jīng)通路概況［3-7］。

材料與方法

一、實驗材料

SPF級正常成年SD大鼠14只，體重230～250g，雌雄不限，隨機分為實驗組（10只）和對照組（4只），偽狂犬病毒（PRV）Bartha株，108／mL，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，病毒液分為50～100μL每等份，-80℃保存，每次注射前僅取出1等份溶解備用，注射后剩余的病毒做滅菌處理并廢棄［6-8］。

二、病毒注射及取材

實驗組大鼠使用10%水合氯醛，按照0.03 mL／kg的劑量行腹腔注射麻醉后固定，并適當(dāng)擴肛，再用25μL微量注射器將10～20μL左右的偽狂犬病毒液，分4～5處注射于距肛門1 cm范圍內(nèi)的直腸壁黏膜下層或肌層內(nèi)，每處注射病毒液3～5 uL，注射后針頭均在注射位點停留15 s左右，再緩慢出針，以防病毒液外滲。對照組A中2只大鼠直接于腹腔內(nèi)注射偽狂犬病毒液20μL，對照組B中2只大鼠直接于直腸腸腔內(nèi)注射偽狂犬病毒液20 μL［6-7］。

注射病毒液96 h后，兩組大鼠均在10%水合氯醛麻醉下，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注處死，并取出脊髓及腦干。再在顯微鏡下按照脊神經(jīng)根的分布，將脊髓分離為各個節(jié)段。最后上述標(biāo)本均經(jīng)過固定、脫水、浸蠟、包埋為石蠟標(biāo)本塊，切片后進行免疫組化染色。

三、免疫組化染色及分析方法

1.主要儀器及試劑：兔抗偽狂犬病毒多克隆抗體（Abcam）、PV—9001超敏二步法免疫組化檢測試劑及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）、LEICA RM2235型石蠟切片機（德國LEICA公司）、LEICA—DM750光學(xué)顯微鏡（德國LEICA公司）。

2.免疫組化染色及分析方法：免疫組化染色步驟均按照試劑盒說明書進行［9］。對染色結(jié)果采集圖像后，使用IPP 6.0圖形分析軟件對染色結(jié)果中的陽性細胞進行計數(shù)。

結(jié) 果

兩組大鼠于注射病毒后均存活至96 h。實驗組大鼠的脊髓各節(jié)段中均出現(xiàn)偽狂犬病毒陽性的神經(jīng)元細胞，胞核為棕黃色著色者即為陽性細胞。其中T13至L1，L6至S1節(jié)段中病毒陽性的神經(jīng)元數(shù)量較多（T13：47.5±2.9；L1：64.5±2.5；L6：30±2.1；S1：68.5±3.5）；T13至S1節(jié)段脊髓前角（anterior horn，AH）處病毒陽性神經(jīng)元較多，形態(tài)多為較大的多角形細胞以及少量較小的橢圓形細胞，其余脊髓節(jié)段前角處病毒陽性神經(jīng)元較少；中間帶（intermediate zone，IMZ）處病毒陽性神經(jīng)元多為橢圓形或紡錘形；脊髓后角（posterior horn，PH）處病毒陽性神經(jīng)元多為個體較小的橢圓形或卵圓形（圖1 A—D）。

腦干Barrington氏神經(jīng)核團處亦出現(xiàn)較多偽狂犬病毒陽性神經(jīng)元（143.5±8.1），形態(tài)多為卵圓形或橢圓形；其中三叉神經(jīng)中腦核（Me5）處病毒陽性神經(jīng)元則呈較大的卵圓形（圖1E）。

對照組大鼠的脊髓及腦干內(nèi)免疫組化染色結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)細胞核黃染的偽狂犬病毒陽性神經(jīng)元（圖1F）。

圖1 免疫組化染色結(jié)果，A：實驗組L1節(jié)段脊髓免疫組化染色結(jié)果（×100）；B：實驗組L1節(jié)段脊髓中PRV陽性的神經(jīng)元（×400）；C：實驗組S1節(jié)段脊髓免疫組化染色結(jié)果（×100）；D：實驗組S1節(jié)段脊髓中PRV陽性的神經(jīng)元（×400）；E：實驗組腦干Barrington氏核團染色結(jié)果，箭頭所指即為Barrington氏核團（×400）；F：對照組腦干Barrington氏核團部位染色結(jié)果（均為藍色陰性，×400）注：AH（anterior horn）：前角；IMZ（intermediate zone）：中間帶；PH（posterior horn）：后角；CC（central canal）：中央管；4V：第四腦室；Bar：Barrington氏神經(jīng)核團；Me5：三叉神經(jīng)中腦核Fig．1 Immunohistochemical results of PRV

討 論

排便是由中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)以及結(jié)直腸平滑肌和肛門括約肌等共同參與的一個復(fù)雜過程，其中樞神經(jīng)包括脊髓內(nèi)的低級中樞以及顱腦內(nèi)的高級中樞［1-2］。此外，排便與排尿過程也有著緊密的聯(lián)系，與二者相關(guān)的組織器官不僅在解剖位置上緊密相鄰，而且在神經(jīng)反射通路方面也較為相似。這就要求在示蹤排便反射神經(jīng)通路時，所選擇的神經(jīng)示蹤劑以及示蹤方法既要保證示蹤過程的特異性，避免示蹤劑局部擴散出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，又要保證示蹤劑能夠跨越多級神經(jīng)元最終到達顱腦內(nèi)的高級中樞，從而完整反映出整個神經(jīng)通路的概況。而一般的神經(jīng)示蹤劑如辣根過氧化物酶，熒光染料等均無法滿足以上要求［10］，故本次實驗選用了偽狂犬病毒的減毒株（Bartha株）作為神經(jīng)示蹤劑。它作為一種嗜神經(jīng)病毒，能夠在神經(jīng)元細胞內(nèi)自我復(fù)制，從而保證了示蹤過程中有足夠濃度的報告蛋白以顯示整個神經(jīng)通路而不會出現(xiàn)信號衰減的現(xiàn)象；此外，它還能夠跨越突觸傳播至與其有突觸連接的神經(jīng)細胞，而不會擴散到周圍無突觸連接的神經(jīng)元，從而保證了其示蹤過程的特異性；最后該病毒的減毒株，在大大削弱了病毒毒力的同時又保留了其逆向跨突觸傳播的能力，從而延長了被感染動物的存活時間，使病毒有足夠的時間來逆向感染示蹤整個與靶器官相關(guān)的神經(jīng)通路。該病毒不僅能夠較為完全的顯示與排便反射相關(guān)的整個神經(jīng)通路，而且能夠保證示蹤結(jié)果的特異性，是一種較為理想的神經(jīng)示蹤劑［3-4］。但其最后示蹤結(jié)果的檢測仍然需要免疫組化染色，而影響免疫組化染色結(jié)果的各種因素勢必也會對示蹤結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，這也是本次實驗的不足之處。近期一些偽狂犬病毒的基因重組體如PRV—152和PRV—614，分別標(biāo)記了GFP（綠色熒光蛋白）基因和RFP（紅色熒光蛋白）基因的出現(xiàn)，使得病毒的示蹤結(jié)果可以在熒光顯微鏡下直接觀察而無需進一步染色處理，從而增加了神經(jīng)傳導(dǎo)檢測的可靠性，以后將會得到廣泛的應(yīng)用［11］。

目前，普遍認為控制排便的低級中樞位于脊髓的腰骶段，且包括本次實驗在內(nèi)的多項研究均證實該反射通路與脊髓L6至S1節(jié)段關(guān)系密切。更有學(xué)者認為與L6節(jié)段相比，排便反射的傳入與傳出神經(jīng)更多的起源于S1節(jié)段，這也為骶副交感神經(jīng)核團控制盆腔臟器功能的學(xué)說提供了依據(jù)。在本次大鼠實驗中不僅在腰骶段，同時在胸腰段脊髓的T13至L1節(jié)段發(fā)現(xiàn)了大量偽狂犬病毒陽性的神經(jīng)元，這可能與胸腰段的交感神經(jīng)節(jié)及內(nèi)臟神經(jīng)向盆腔內(nèi)所投射的交感神經(jīng)纖維有關(guān)［7］。而控制排尿、排便以及生殖功能的交感／副交感神經(jīng)通路在功能與解剖上緊密相連，仍需要進一步的研究以明確區(qū)分。

在本次試驗中我們在大鼠腦干的Barrington氏神經(jīng)核團內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量偽狂犬病毒陽性的神經(jīng)元，說明這之前被認為是腦干排尿中樞的神經(jīng)核團在排便的控制方面也起著重要的作用［5，7-8］。也有學(xué)者使用在膀胱和結(jié)腸進行雙標(biāo)記的方法進一步證實在該核團內(nèi)至少存在三塊區(qū)域，即分別控制排尿與排便的相對獨立的區(qū)域，以及共同調(diào)控二者功能的區(qū)域［8］。而這一功能區(qū)域劃分的詳細情況仍需要進一步研究。此外，由于動物和人類排便控制條件的不同，本次實驗并未涉及偽狂犬病毒向大腦皮層內(nèi)的示蹤結(jié)果，而排便反射神經(jīng)通路在高級中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的部分，對研究某些與排便相關(guān)的先天性畸形如先天性巨結(jié)腸、先天性肛直腸畸形等疾病的發(fā)病原因、診療方法以及預(yù)后情況等方面具有至關(guān)重要的作用，這也是今后需要努力研究的方向［12-13］。

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A study of defecation neural pathway of inoculating pseudorabies virus into rectum in adult rats．

WangQi，Xiang Bo，Li Yanan，Zhao Yiyang.Department of Pediatric Surgery，West China Hospital of Sichuan University，Chengdu 610041，China，Corresponding author：Xiang Bo，E-mail：xbljx＠hotmail.com

Objective To explore the defecation neural pathway in spine and brainstem by inoculating pseudorabies virus（PRV，Bartha strain）into rectum in adult rats.Methods A total of 14 normal adult SD rats（male or female，weight：230～250 g）were random ly divided into two groups.The experimental group（n =10）received an inoculation of10～20μL PRV into rectalwall.The control group A had an injection of20 μl PRV into peritoneal cavity（n=2）while the control group B 20μL PRV into rectal cavity（n=2）.At96 h post-injection，the rats were sacrificed for harvesting spine and brainstem for immunohistochemical staining and analysis.Results PRV-immunoreactive（IR）cellswere localized into almost every spinal cord in experimental rats，especially spinal segments of T13～L1 and L6～S1（T13：47.5±2.9；L1：64.5±2.5；L6：30 ±2.1；S1：68.5±3.5）.And PRV—IR cells were also detected in Barrington’s nucleus（143.5±8.1）in brainstem of experimental rats.And PRV—IR cellswere not detected in control rats.Conclusions PRV transneuronal tracing has a high specificity in experimental rats.And the defecation neural pathway is closely associated with spinal segments of T13—L1 and L6—S1 and Barrington’s nucleus in adult rats.

Rabies virus；Rats；Defecation；Reflex；Neural Pathways；Spinal Cord

2016—04—16）

（本文編輯：仇 君）

王琦，向波，李亞楠，等.偽狂犬病毒法示蹤成年大鼠排便反射神經(jīng)通路的研究［J］.臨床小兒外科雜志，2017，16（2）：185-188.

10.3969／j.issn. 1671—6353.2017.02.019.

Citing this article as：Wang Q，Xiang B，Li YN，et al. Study of defecation neural pathway by inoculating pseudorabies virus into rectum in adult rats［J］.J Clin Ped Sur，2017，16（2）：185-188.DOI：10.3969／j.issn.1671-6353.2017.02.019.

10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.019

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（2014JY0211）

四川大學(xué)華西醫(yī)院小兒外科（四川省成都市，610041）

向波，E-mail：xbljx＠hotmail.com