馮明玉++韋平++倪瓊秀++楊玲蓉

[摘要]目的 探討LncRNA BCYRN1在小兒哮喘患者血清中的表達(dá)及對(duì)小兒哮喘病情及預(yù)后的影響。方法 選擇2012年1月～2015年12月于我院隨訪的120例穩(wěn)定期哮喘患兒（間歇發(fā)作30例、輕度持續(xù)發(fā)作30例、中度持續(xù)發(fā)作30例、重度持續(xù)發(fā)作30例）和30例健康對(duì)照兒童的血清樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT-PCR）檢測(cè)血清中LncRNA BCYRN1與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達(dá)水平，分析LncRNA BCYRN1的表達(dá)對(duì)患兒預(yù)后的影響及其與TNF-α、IL-4、IgE的表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 LncRNA BCYRN1在哮喘患兒血清中的表達(dá)較健康對(duì)照兒童明顯增高，LncRNA BCYRN1表達(dá)隨轉(zhuǎn)歸加重呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LncRNA BCYRN1隨轉(zhuǎn)歸加重呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LncRNA BCYRN1的表達(dá)與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達(dá)成正相關(guān)（r=0.712、0.770、0.748，均P<0.001）。結(jié)論 LncRNA BCYRN1表達(dá)水平與小兒哮喘病情嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)臨床小兒哮喘預(yù)后的判斷具有一定作用。

[關(guān)鍵詞]小兒哮喘；LncRNA BCYRN1；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R725.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）04（b）-0009-04

Expression and clinical significance of LncRNA BCYRN1 in serum of children with asthma

FENG Ming-yu1 WEI Ping1 NI Qiong-xiu1 YANG Ling-rong2▲

1.Department of Pediatrics，Shuangliu District Hospital of Traditional Chinese Medicine in Chengdu City，Sichuan Province，Chengdu 610200，China；2.Department of Pediatrics，the Third People′s Hospital of Sichuan，Chengdu 610000，China

[Abstract]Objective To investigate the expression of serum LncRNA BCYRN1 in children with asthma and the influence on the situation and prognosis.Methods Serum samples of 120 children with stable asthma from January 2012 to December 2015 in our hospital （including 30 cases of intermittent episodes，30 cases of mild sustained episodes，30 cases of moderate sustained episodes，30 cases of severe persistent episodes） and 30 cases of healthy children as health control were collected.The expression levels of LncRNA BCYRN1 and TNF-α，IL-4，IgE were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） and the effect of LncRNA BCYRN1 expression on the prognosis were also analyzed.Meanwhile，the relationship between serum LncRNABCYRN1 expression and inflammatory factors IgE，IL-4 and TNF-α were analyzed.Results The expression of LncRNA BCYRN1 in the serum of asthmatic children was significantly higher than that in the children of health control （P<0.05）.The expression level of LncRNA BCYRN1 increased gradually with the aggravation of the disease （P<0.05）.A positive correlation was also found between LncRNA BCYRN1 expression and inflammatory factors TNF-α，IL-4，IgE （r=0.712，0.770，0.748，all P<0.001）.Conclusion The expression of LncRNA BCYRN1 level associated with children asthma.LncRNA BCYRN1 can be as a predict biomarker of prognosis in children asthma.

[Key words]Children asthma；LncRNA BCYRN1；Prognosis

哮喘是兒童最為常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病之一，主要以反復(fù)發(fā)作的氣道梗阻、支氣管高反應(yīng)性、氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、胸悶、咳嗽、胸部緊迫感和氣促等癥狀[1-2]。近年來(lái)，小兒哮喘的發(fā)病率逐年增加。美國(guó)報(bào)道其小兒哮喘及喘息癥狀的發(fā)病率高達(dá)9.4%（約為7百萬(wàn)），每年哮喘相關(guān)的死亡達(dá)7000人[3]。香港13～14歲兒童哮喘發(fā)病率最高約為11.0%，北京地區(qū)高達(dá)10.7%，嚴(yán)重影響小兒的身心健康。其發(fā)病機(jī)制包括遺傳因素及環(huán)境中的變應(yīng)原等[4]。目前雖然對(duì)于小兒哮喘防治有一些有效的治療措施，但哮喘發(fā)病率依然逐年升高，且哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素及其具體機(jī)制不清楚。近年來(lái)的研究表明，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNAs）在哮喘的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，Lnc RNA）是長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上的非編碼RNA。近年來(lái)的研究主要集中在LncRNA作為癌癥的生物標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可以作為癌癥的早期篩選、診斷、預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物[6-7]。然而關(guān)于LncRNA在哮喘中的研究很少，LncRNA對(duì)這種不使用病理檢驗(yàn)進(jìn)行診斷的疾病，提供一種在體液中即可進(jìn)行早期篩選的分子標(biāo)志物將對(duì)哮喘疾病的診斷提供重要意義[8]。研究報(bào)道，LncRNA BCYRN1作為microRNA海綿影響支氣管平滑肌的功能[9]，然而關(guān)于LncRNA BCYRN1在哮喘患兒血清中的表達(dá)及與臨床預(yù)后的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將進(jìn)一步檢測(cè)正常及哮喘患兒血清中LncRNA BCYRN1的表達(dá)，分析其與哮喘早期診斷及臨床預(yù)后評(píng)估的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

選擇2012年1月～2015年12月于我院隨訪的120例穩(wěn)定期哮喘患兒，其中男65例，女55例；平均年齡（8.3±3.7）歲；間歇發(fā)作30例[男性16例，女性14例，平均年齡（8.0±3.2）歲]，輕度持續(xù)發(fā)作30例[其中男性17例，女性13例，平均年齡（7.9±3.9）歲]，中度持續(xù)發(fā)作30例[男性18例，女性12例，平均年齡（8.0±4.0）歲]，重度持續(xù)發(fā)作30例[男性17例，女性13例，平均年齡（8.0±3.0）歲]。同時(shí)選擇30例健康兒童作為健康對(duì)照進(jìn)行研究，其中男17例，女13例，平均年齡（8.0±4）歲。哮喘患兒與對(duì)照組兒童之間性別構(gòu)成、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。間歇、輕度持續(xù)發(fā)作、中度持續(xù)發(fā)作及重度持續(xù)發(fā)作組患兒年齡、性別構(gòu)成比之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。各組患兒及健康對(duì)照兒童之間均無(wú)其他基礎(chǔ)性疾病及合并癥。收集兒童血液標(biāo)本進(jìn)一步研究。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒的家屬均簽署了知情同意書(shū)?；純浩渌闆r無(wú)特殊。轉(zhuǎn)歸及隨訪治療2年以上患兒無(wú)哮喘發(fā)作視為完全緩解。未完全緩解者按照哮喘控制標(biāo)準(zhǔn)[10-11]歸類為好轉(zhuǎn)、持續(xù)和加重。采用電話及門(mén)診復(fù)診的方法進(jìn)行隨訪，電話隨訪時(shí)間為3個(gè)月1次，1年隨訪4次。隨訪期間120例哮喘患兒中完全緩解28例，好轉(zhuǎn)42例，持續(xù)25例，加重25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的支氣管哮喘防治常規(guī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。②實(shí)驗(yàn)前2周內(nèi)均未使用過(guò)茶堿、丙種球蛋白、糖皮質(zhì)激素、色甘酸鈉、白三稀拮抗劑等免疫調(diào)節(jié)藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他心肺疾病患者、患有自身免疫性疾病史、腫瘤等惡性病史的患兒予以排除；②自身過(guò)敏及過(guò)敏性家族史的患兒予以排除。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集和處理 符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患兒分別于首診時(shí)或治療前24 h內(nèi)及經(jīng)過(guò)3～6個(gè)月的控制治療后患兒清晨空腹肘靜脈血3～5 ml，4℃，3000 r/min，離心10 min，取上層血清。取到上層血清之后加入Trizol混勻后置于-80℃冰箱保存，以備提取RNA。

1.2.2采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定炎性因子的表達(dá) 患兒均在入院的第2天清晨空腹抽靜脈血3 ml，置于4℃冰箱內(nèi)約30 min，血液凝集后3000 r/min，離心15 min，分離血清，取血清，測(cè)定患兒的血清4℃水平，采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-4、IgE的表達(dá)，具體測(cè)定步驟均按照試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）提供的步驟進(jìn)行。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析miRNAs的表達(dá) 根據(jù)Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takala，大連寶生生物）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Takala，大連寶生生物）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，在20 μl體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?6℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，置于-20℃冰箱備用。Real-time PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μl體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，PCR反應(yīng)在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?5℃，3 min）；40 cycles×（95℃ 12 s，62℃ 1 min）；95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布者組間比較采用Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 LncRNA BCYRN1在不同哮喘狀態(tài)及健康對(duì)照兒童中的差異的表達(dá)

QRT-PCR檢測(cè)LncRNA BCYRN1在不同哮喘狀態(tài)患兒以及健康對(duì)照兒童血清中的表達(dá)，結(jié)果顯示LncRNA BCYRN1在健康對(duì)照兒童中的表達(dá)為1.007±0.034，較哮喘患兒中的表達(dá)明顯降低，LncRNA BCYRN1表達(dá)隨轉(zhuǎn)歸加重呈升高趨勢(shì)，LncRNA BCYRN1在間歇發(fā)作期、輕度持續(xù)發(fā)作、中度持續(xù)發(fā)作及中度持續(xù)發(fā)作期的表達(dá)分別為3.750±0.200、5.450±0.450、8.230±0.034、14.890±0.770，與健康對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖1）。

2.2 LncRNA BCYRN1在不同轉(zhuǎn)歸患兒血清中的表達(dá)情況

QRT-PCR檢測(cè)LncRNA BCYRN1在不同轉(zhuǎn)歸患兒血清中的表達(dá)，結(jié)果提示隨訪2年期間120例哮喘患兒中完全緩解28例（其中男性15，女性13例），好轉(zhuǎn)42例（其中男性20，女性22例），持續(xù)25例（其中男性15，女性10例），加重25例（其中男性15，女性10例）。LncRNA BCYRN1隨轉(zhuǎn)歸加重呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 LncRNA BCYRN1的表達(dá)與炎性因子IgE、IL-4和TNF-α的相關(guān)性

哮喘患兒血清中LncRNA BCYRN1的表達(dá)與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達(dá)成正相關(guān)（r=0.712，P<0.001；r=0.770，P<0.001；r=0.748，P<0.001）（圖3）。

3討論

哮喘是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，其特征是反復(fù)發(fā)作性喘息、可逆的氣道梗阻和氣道重塑。哮喘發(fā)生的根本原因尚不明確，治療以對(duì)癥治療為主。哮喘發(fā)病機(jī)制涉及組織學(xué)、分子和基因變化及蛋白表達(dá)，近年來(lái)非編碼RNA（ncRNA）在哮喘病因?qū)W的研究中也逐漸受到重視，其可能為哮喘的病理研究和治療方法帶來(lái)根本性改變[13-15]。

LncRNA是真核細(xì)胞中的一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編RNA，無(wú)蛋白編碼功能，在哺乳動(dòng)物基因組中普遍被轉(zhuǎn)錄[16]。LncRNA曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。但目前越來(lái)越多的研究證實(shí)LncRNA具有重要的生物學(xué)功能，其在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞分化和細(xì)胞周期調(diào)控等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[17-18]。LncRNA具有多樣生物學(xué)功能：參與X染色體失活，調(diào)控mRNA降解，構(gòu)成細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)骨架，作為染色質(zhì)重塑的調(diào)控因子等，并且與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[19-21]。研究表明LncRNAs具有多樣的生物學(xué)功能，其機(jī)制主要有染色質(zhì)重塑、基因印記、細(xì)胞周期調(diào)控和翻譯調(diào)控等[22]，然而正因?yàn)長(zhǎng)ncRNAs作用機(jī)制的多樣性和復(fù)雜性，目前對(duì)于LncRNAs的作用機(jī)制的了解也只是冰山一角，對(duì)于其調(diào)控與被調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。目前的研究多集中在腫瘤方面，關(guān)于LncRNA與小兒哮喘的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚少。本研究選擇2012年1月～2015年12月隨訪的120例穩(wěn)定期哮喘患兒（間歇發(fā)作30例、輕度持續(xù)發(fā)作30例、中度持續(xù)發(fā)作30例、重度持續(xù)發(fā)作30例）和30例健康兒童作為對(duì)照進(jìn)行研究。采集各組研究對(duì)象入組時(shí)及隨訪結(jié)束時(shí)的血清樣本采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)哮喘患兒及健康對(duì)照兒童血清中LncRNA BCYRN1的表達(dá)水平，分析LncRNA BCYRN1的表達(dá)對(duì)患兒預(yù)后的影響，重在探討小兒哮喘中LncRNA的炎癥調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA BCYRN1在哮喘患兒血清中的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，LncRNA BCYRN1隨病情加重表達(dá)水平逐漸升高，LncRNA BCYRN1隨轉(zhuǎn)歸加重呈升高趨勢(shì)，LncRNA BCYRN1的表達(dá)與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達(dá)成正相關(guān)。

綜上所述，LncRNA BCYRN1表達(dá)水平與小兒哮喘病情有關(guān)，可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)臨床小兒哮喘預(yù)后的判斷具有一定作用。但由于本研究的臨床病例有限，關(guān)于LncRNA BCYRN1對(duì)小兒哮喘的影響尚需擴(kuò)大樣本量及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-01-03 本文編輯：任 念）