劉光輝 程俊貞 寧長申

摘要[目的]掌握河南省豬等孢球蟲的分子變異規(guī)律。[方法]從河南省豫東、豫南、豫西、豫北及豫中地區(qū)的部分規(guī)?；i場(chǎng)采集糞便樣品，進(jìn)行豬球蟲卵囊的分離與純化；從分離到的8株豬球蟲分離株中提取核酸并進(jìn)行測(cè)序，并與豬等孢球蟲擴(kuò)增株基因序列及其他相關(guān)原蟲基因序列進(jìn)行比對(duì)。[結(jié)果]河南省不同地區(qū)的8個(gè)豬球蟲株均為豬等孢球蟲，并且沒有明顯遺傳差異。I.suis與其他7種原蟲差異較大，不屬于同一個(gè)生物型，同一種動(dòng)物所感染的不同種類原蟲之間的同源性較低。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為有效預(yù)防和控制仔豬球蟲病提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞豬等孢球蟲；純化；擴(kuò)增；基因序列

中圖分類號(hào)S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0093-03

Abstract[Objective] To master the molecular variation laws of Isospora suis in Henan Province. [Method] The pig manure samples were collected from some largescale pig farms in eastern， western， southern， northern and central regions of Henan Province to isolate and purify porcine coccidian oocysts. 8 isolated strains of swine coccidiosis were used to extract nucleic acid and sequence. The gene sequence of I. suis were compared with that of other related protozoon. [Result] 8 swine coccidian strains from different regions of Henan Province were identified as I. suis and there was no obvious genetic differences. I. suis had greater differences with other 7 kinds of protozoon. I. suis and other 7 kinds of protozoon belonged to different biotypes. The homology of different kinds of protozoon infected in the same kinds of animals was lower. [Conclusion] The research results can provide scientific basis for effective prevention and control of piglet coccidiosis.

Key wordsIsospora suis；Purification；Amplification；Gene sequence

近年來，哺乳仔豬患球蟲病是養(yǎng)豬場(chǎng)的常見問題之一，引起哺乳仔豬患球蟲病的主要病原是豬等孢球蟲[1-2]，主要發(fā)生在8～15日齡仔豬上，感染日齡越小，病情越嚴(yán)重。發(fā)病仔豬排出黃色至灰色糞便，開始時(shí)糞便松軟或呈糊狀，隨著病情的加重，糞便變成液狀，并發(fā)出腐敗乳汁樣酸臭味；吮乳減少，被毛粗亂，脫水，體增重下降，從而導(dǎo)致新生仔豬死亡率增加，斷奶時(shí)營養(yǎng)不良仔豬成為僵豬，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

為掌握河南省豬等孢球蟲的分子變異規(guī)律，筆者從河南省豫中地區(qū)的漯河和許昌，豫南地區(qū)的南陽、信陽及駐馬店，豫西地區(qū)的洛陽，豫北地區(qū)的鶴壁，豫東地區(qū)的周口等8個(gè)市的部分規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行采樣，收集豬等孢球蟲卵囊，并進(jìn)行純化。利用分子生物學(xué)方法對(duì)其18S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，然后利用DNAstar、ClustalX、Paup、Phyplip等軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，構(gòu)建分子基因樹，分析河南省不同地區(qū)豬等孢球蟲分離株的遺傳特征，闡明豬等孢球蟲病的分子變異規(guī)律，旨在為有效預(yù)防和控制仔豬球蟲病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑。試驗(yàn)所用試劑有飽和糖-鹽水溶液、DNA提取試劑盒等。

1.1.2儀器。試驗(yàn)所用儀器有顯微鏡、PCR儀等。

1.2方法

1.2.1樣品采集。采用直腸取糞法，采集1～30日齡仔豬的糞樣或剛排出的新鮮糞便50～100 g，分別裝入干凈塑料袋中，標(biāo)注豬場(chǎng)名稱、編號(hào)以及豬的年齡，置于4 ℃冰箱內(nèi)，備用。

1.2.2卵囊收集。用飽和糖-鹽水溶液漂浮法收集球蟲卵囊[3-5]。在陽性糞樣中加入4～5倍體積的水?dāng)嚢杈鶆?，在裝有80目和130目雙層金屬篩的漏斗中過濾，將濾液置于離心管中以3 000 r/ min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取出離心管，棄上清，再加入約50 mL的飽和糖-鹽水溶液，用干凈的玻璃棒攪拌均勻，再以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，然后用專門收集卵囊用的鐵絲圈網(wǎng)多次蘸取上層表面液在裝有約100 mL自來水的燒杯中涮洗，即將卵囊收集到燒杯中，制成卵囊混懸液；最后，將卵囊混懸液以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后取出離心管，棄去上清，即為球蟲卵囊。

1.2.3卵囊的純化。取收集的卵囊液，采用飽和糖水溶液漂浮法和梯度離心法進(jìn)行純化。取收集的卵囊液置于10 mL離心管中，以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后取出離心管，取上層（卵囊層）和上清液及中間層置于1個(gè)燒杯中，之后再加入等量的PBS工作液，混勻，備用。在10 mL離心管中先后加入3 mL飽和糖水溶液（飽和糖水溶液∶自來水=1∶12）、3 mL 1∶2飽和糖水溶液（飽和糖水溶液∶自來水=1∶2）和3 mL上述卵囊液，以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上面卵囊層和上清液置于1個(gè)燒杯中，此后再加入4倍量的PBS工作液，混勻后以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取沉淀即為濃集的卵囊，于-20 ℃下保存，備用。

1.2.4PCR擴(kuò)增。

1.2.4.1豬等孢球蟲DNA的提取。取上述濃集的卵囊，加入約5 mL的PBS液，混勻后用超聲波粉碎儀將豬等孢球蟲卵囊打碎，以16 000 r/min的轉(zhuǎn)速高速離心30 min，棄上清，取沉淀，在沉淀物中加入200 μL裂解液，振蕩數(shù)次，混勻。5次反復(fù)凍融（液氮中5 min，37 ℃水浴中5 min），然后按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。重溶DNA置于適量的緩沖液（pH 8.0）中，于-20 ℃下保存。

1.2.4.2PCR反應(yīng)。參照劉光輝等[6]PCR擴(kuò)增豬等孢球蟲18S rRNA基因全序列的方法，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1.5 min，72 ℃ 2 min，共37個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃，10 min。將反應(yīng)液充分混勻，短暫離心后，置于94 ℃預(yù)變性8 min，再加入5 U/μL TaKaRa Ex Taq混勻，離心后將反應(yīng)管置于PCR儀中按照相應(yīng)程序進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，結(jié)束后將樣品置于4 ℃下保存。

1.2.5序列測(cè)定與分析。

1.2.5.1PCR產(chǎn)物測(cè)序。PCR產(chǎn)物及測(cè)序用引物直接送交寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫上登錄的相關(guān)原蟲序列，使用DNAstar 4.0軟件比較其同源性，經(jīng)過ClustalX 1.81軟件序列比對(duì)，使用Paup 4.0、Treeview 30、Phylip種系發(fā)育關(guān)系軟件進(jìn)行聚類分析，繪制基因樹。

1.2.5.2PCR產(chǎn)物序列及GenBank下載的其他原生動(dòng)物18S rRNA基因序列。①豬等孢球蟲擴(kuò)增傳代株（以下簡稱KZ株）；②豬等孢球蟲漯河地區(qū)分離株（以下簡稱LH株）；③豬等孢球蟲許昌地區(qū)分離株（以下簡稱XC株）；④豬等孢球蟲南陽地區(qū)分離株（以下簡稱NY株）；⑤豬等孢球蟲信陽地區(qū)分離株（以下簡稱XY株）；⑥豬等孢球蟲駐馬店地區(qū)分離株（以下簡稱ZMD株）；⑦豬等孢球蟲洛陽地區(qū)分離株（以下簡稱LY株）；⑧豬等孢球蟲鶴壁地區(qū)分離株（以下簡稱HB株）；⑨豬等孢球蟲周口地區(qū)分離株（以下簡稱ZK株）；⑩L76471 I.felis；U97523 I.suis；U94787 I.belli；AF029303 I.ohioensis；M97703 T.gondii；AF080612 I.robini； AF108861 C.pig； L16996 C.parvum。

2結(jié)果與分析

2.1卵囊純化結(jié)果經(jīng)過4～5次純化，在濃集的球蟲卵囊液中仍含少量的微粒雜質(zhì)，具體純化效果如圖1所示。

2.2不同地區(qū)豬等孢球蟲分離株18S rRNA基因的 PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株都能擴(kuò)增出特異性DNA帶，大小在1 800 bp左右（圖2），符合預(yù)期的目的條帶大小。

2.3測(cè)序結(jié)果經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株及KZ株的豬等孢球蟲18S rRNA基因的PCR產(chǎn)物由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下：①I.suis LH株（測(cè)序編號(hào)為ZZS340）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 720 bp；②I.suis XC株（測(cè)序編號(hào)為ZZS341）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 721 bp；③I.suis NY株（測(cè)序編號(hào)為ZZS342）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 723 bp；④I.suis XY株（測(cè)序編號(hào)為ZZS343）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 659 bp；⑤I.suis ZMD株（測(cè)序編號(hào)為ZZS344）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 710 bp；⑥I.suis LY株（測(cè)序編號(hào)為ZZS345）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 724 bp；⑦I.suis HB株（測(cè)序編號(hào)為ZZS346）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 727 bp；⑧I.suis ZK株（測(cè)序編號(hào)為ZZS347）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 708 bp；⑨I.suis KZ株（測(cè)序編號(hào)為ZZS348）18S rRNA基因序列，測(cè)序長度為1 725 bp。

2.4序列比對(duì)結(jié)果試驗(yàn)測(cè)定9株豬等孢球蟲序列，結(jié)合從GenBank下載的其他原生動(dòng)物18S rRNA基因序列，以L16996（C.parvum）作為外群，用DNAstar 4.0軟件比較其同源性，經(jīng)過ClustalX 1.81序列比對(duì)，使用Paup 4.0、Treeview 3.0、Phylip種系發(fā)育關(guān)系軟件分析進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建基因樹（圖3）。從圖3可以看出，17種原蟲分別處在3個(gè)進(jìn)化枝上。其中，KZ株單獨(dú)作為第1枝；I.felis、I.suis（下載）、T.gondii、I.robini、C.parvum、C.pig、I.belli、I.ohioensis形成第2枝，而LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株作為第3枝。第3枝，LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株之間差異不顯著，同源性較高，為99.7%～100%，形成一個(gè)單種系；其中，XC株和XY株、HB株和LY株之間的同源性高達(dá)100%。LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株、ZK株和KZ株雖不在同一個(gè)進(jìn)化枝上，但通過同源性比較和差異性分析，第3枝與第1枝的的同源性為98.6%，與I.suis（下載）的同源性為96.3%，說明擴(kuò)增的18S rRNA基因序列符合預(yù)期目的要求，并且LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株、ZK株和KZ株之間沒有變異，分離株為豬等孢球蟲。此外，I.suis與其他7種原蟲之間差異較大，同源性較低，為79.6%～85.2%，說明I.suis與其他7種原蟲不屬于同一個(gè)生物型。

3結(jié)論

（1）從分離的8株豬等孢球蟲（LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株）提取DNA后，通過PCR擴(kuò)增都能擴(kuò)增出大小約1 800 bp、特異性的目的DNA條帶，并測(cè)得其18S rRNA基因全序列。

（2）經(jīng)過ClustalX 1.81序列比對(duì)，使用Paup 4.0、Treeview 3.0、Phylip和DNAstar 4.0等分子生物學(xué)軟件分析，發(fā)圖3基于18S rRNA基因序列的Isospora suis和相近原蟲的的聚類分析結(jié)果

Fig.3The clustering results of 18S rRNA gene sequence between Isospora suis and other related protozoon現(xiàn)8株豬等孢球蟲18S rRNA基因序列之間的同源性較高，為99.7%～100%，說明河南省豬等孢球蟲不同分離株之間不存在基因變異；與GenBank上登錄的I.suis 18S rRNA基因序列相比，同源性為96.3%，說明所擴(kuò)增的18S rRNA基因序列符合預(yù)期目的要求。I.suis與其他7種原蟲之間差異較大，同源性較低，為79.6%～85.2%，說明I.suis與其他7種原蟲不屬于同一個(gè)生物型，證實(shí)同一種動(dòng)物所感染的不同種類原蟲之間的同源性較低。

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