劉友勛等

摘要：對白腐菌（Trametes sp.）菌株B1的固體發(fā)酵粗酶液進行活性電泳后發(fā)現(xiàn)含有5種漆酶同工酶。硫酸銨沉淀、離子交換柱層析和Sephadex G100柱層析的收集液中包含有2種帶電荷和分子量接近的漆酶同工酶，進一步利用活性電泳切膠法純化出這2種同工酶，用SDS-PAGE證明為單一漆酶，它們的分子量分別為64 ku（Lac1）和62 ku（Lac2），并對其理化性質進行了研究。Lac1漆酶反應的最適pH值為2.2，最適溫度為50 ℃，氧化ABTS 的Km值為1.952 mmol/L；Lac2漆酶反應的最適pH值為2.2，最適溫度為40 ℃，氧化ABTS的Km值為0.255 mmol/L。

關鍵詞：白腐菌；漆酶同工酶；純化；活性電泳；酶學性質

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0054-04

收稿日期：2014-11-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：U1304302）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（編號：12B180030）。

作者簡介：劉友勛（1976—），男，湖北鄂州人，博士，副教授，主要從事酶工程及生物轉化研究。E-mail：liuyouxun@126.com。漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2）是一種多酚氧化還原酶，屬于銅離子氧化酶家族，該家族還包含抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍蛋白等，這類酶都含有多個銅離子且在結構和功能上存在許多相似之處[1-3]。漆酶以分子氧作為電子受體，能催化多種底物發(fā)生氧化反應，氧分子在反應中被還原成水。漆酶蛋白通常以單體形式存在，很少以聚合體形式存在，其分子量一般在52～110 ku之間，目前還沒有發(fā)現(xiàn)分子量低于50 ku的，但已發(fā)現(xiàn)分子量大于110 ku的漆酶蛋白[2-4]。在漆酶分子中，由于光譜和磁性特征的不同，可將4個銅離子分成3類：Ⅰ型Cu2+（1個）、Ⅱ型Cu2+（1個）、Ⅲ型Cu4+2（2個）。利用順磁共振檢測，發(fā)現(xiàn)前2種銅離子是單電子受體，呈順磁性，而Ⅲ型銅離子是反磁性的雙電子受體[4]。漆酶催化底物范圍廣，已報道有200種以上，包括酚類和非酚類，而且其催化性能也很特殊，對環(huán)境友好，因此在多個領域具有潛在的應用價值。近年來，漆酶已經(jīng)成為環(huán)境保護、藥物合成、生物傳感器等多個領域的研究熱點[5-6]。

漆酶最先在漆樹這種植物中被發(fā)現(xiàn)，后來研究表明在昆蟲、細菌和高等真菌中也廣泛存在，甚至有一些漆酶被發(fā)現(xiàn)存在于動物的器官和血清中[4]。由于真菌漆酶的催化性能獨特，在過去幾十年，對其漆酶進行了廣泛的研究，而其中作為真菌漆酶的代表，擔子菌亞門的白腐真菌漆酶研究報道最多[1-6]。來自于不同真菌的漆酶，生化特性具有很大的不同，甚至在同一種真菌中也可以產(chǎn)生多種不同的同工酶，這些漆酶同工酶的生化特性也會有很大的差異。目前，這些同工酶之間的作用和意義還知之甚少。對于漆酶同工酶特性的研究，有利于了解漆酶在真菌生理活動中的作用，同時為進一步應用漆酶打下基礎。蛋白質分離純化主要采取柱層析法，該法適合于較大樣品量的蛋白分離，且需要多步設計和條件優(yōu)化，操作也較復雜。對于一些漆酶同工酶通過柱層析法，并不能很好地將它們分離開，需要結合其他方法進行分離。本試驗對1株白腐真菌（Trametes sp.B1）的2種漆酶同工酶通過柱層析后，進一步通過活性電泳切膠純化法將它們分離，并研究了它們的部分生化特性。

1材料與方法

1.1供試菌株

白腐菌Trametes sp.B1（簡稱B1菌株）由筆者所在實驗室篩選和鑒定。

1.2試劑和儀器

1.2.1試劑2，2′-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸） （ABTS），Sigma公司，美國；DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex-G100 填料，GE Healthcare Bioscience，美國；牛血清蛋白，北京鼎國產(chǎn)品；低分子量蛋白質marker為北京康為世紀生物科技產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2主要儀器核酸蛋白檢測儀為江蘇省興化市分析儀器廠產(chǎn)品，冷凍干燥機為上海比朗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3產(chǎn)酶培養(yǎng)基

21 g稻草粉、3 g麩皮、0.12 g CaCl2、0.36 g MnSO4和60 mL蒸餾水混勻裝入500 mL搖瓶中。

1.4漆酶活力測定[7]

3 mL 反應混合液中，含5 mmol/L ABTS 0.2 mL，醋酸緩沖液（pH值4.0）2.7 mL，粗酶液0.1 mL，以1 min 內催化氧化1 μmol/L ABTS 的酶量為1個酶活單位（U），已知420 nm 處ABTS 的摩爾消光系數(shù)為3.6×104 mol/（L·cm）。

1.5蛋白濃度的測定

參照文獻[8]進行蛋白濃度測定，以牛血清蛋白作為標準蛋白質。

1.6電泳

SDS-PAGE參照文獻[9]進行，分離膠濃度均為10%，SDS-PAGE用考馬斯亮藍R250搖床染色2 h；PAGE 活性染色參照文獻[10]略加修改，使用底物分別為ABTS和愈創(chuàng)木酚。

1.7酶的分離與純化

1.7.1粗酶液的制備收集培養(yǎng)15 d的固體培養(yǎng)物，在固體培養(yǎng)物中加入蒸餾水，每500 mL搖瓶中加200 mL，浸泡 24 h 后用雙層濾紙過濾，收集濾液，4 ℃ 10 000 g離心 30 min，收集上清液即粗酶液備用。

1.7.2硫酸銨鹽析、透析80%飽和度硫酸銨沉淀，4 ℃靜置過夜。10 000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀溶解于蒸餾水中，透析過夜。

1.7.3DEAE-Sepharose Fast Flow 柱層析將上述所得酶液加到已用0. 01 mol/L 磷酸鈉緩沖液（PBS 7.0 ）平衡過的DEAE-Sepharose Fast Flow柱（1.8 cm×20 cm），先用PBS洗柱，后改用含0～0.5 mol/L NaCl 的PBS梯度洗脫，合并有酶活組分，將所得溶液冷凍干燥成粉。

1.7.4Sephadex G-100 柱層析將上述所得活力組分的凍干粉溶解于3 ml蒸餾水中，所得酶液加到平衡好的層析柱（2.0 cm×80 cm） 上，用上述緩沖液洗脫。將在280 nm 處有吸收峰的管子收集起來，用ABTS法測量其酶活，將有漆酶活性部分分步收集起來，超濾濃縮至5 mL。

1.7.5活性電泳切膠[10-12]在凝膠兩側中部各切出1 cm×6 cm規(guī)格的凝膠條，在漆酶活性染色液（愈創(chuàng)木酚）中進行顯色，出現(xiàn)清晰的顯色帶時立即將其放回原凝膠上所在位置。以兩側凝膠條上對應的顯色帶為標記，用鋒利的刀片切下凝膠上相應的漆酶電泳區(qū)帶。將切下的凝膠條放入1.5 mL EP管中，用玻璃棒碾碎后加入1 mL去離子水，4 ℃靜置浸提過夜，13 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.8酶學性質

1.8.1表觀分子量測定SDS-PAGE法測定漆酶的分子量，根據(jù)已知分子量的標準蛋白在SDS-PAGE中的相對遷移率Rf，作Rf-lgMr圖，求得其分子量。

1.8.2pH值對漆酶活性的影響在pH值2.2～5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中加入ABTS來測定酶活力。

1.8.3溫度對漆酶活性的影響在不同溫度（25～60 ℃）范圍下測定漆酶活力。

1.8.4動力學常數(shù)測定在pH值4.0緩沖液中，加不同濃度的ABTS進行反應，以計算酶反應的初速度，作出Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。

2結果與分析

2.1B1菌株漆酶同工酶

白腐菌B1菌株固體培養(yǎng)15 d后，將其培養(yǎng)物用蒸餾水浸泡，然后過濾收集粗酶液，進行Native-PAGE，然后通過底物ABTS進行活性染色，獲得漆酶同工酶酶譜（圖1）。在PAGE膠上，B1菌株產(chǎn)生的漆酶同工酶和ABTS發(fā)生反應而顯現(xiàn)出綠色條帶，根據(jù)譜帶顯色速度和條帶綠色深淺，可看出條帶a的漆酶含量最多（顯色速度快，綠色深），而條帶d的漆酶含量最少（顯色速度慢，綠色淺）；圖中有5條清晰的同工酶條帶，表明該菌株能合成至少5種不同分子量大小的漆酶同工酶，也可能還有其他同工酶由于表達量較少而用ABTS方法不能顯現(xiàn)出來。

2.2漆酶的分離純化

2.2.1離子交換柱層析和凝膠過濾粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析后所得樣品比活力為87 962.17 U/mg，純化倍數(shù)為10.35倍，活力回收率為12.90%（表1）。將所得的活性最大的58號、59號和60號收集管中的酶液合并進行回收（圖2），經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測（圖3-a）顯示，發(fā)現(xiàn)有2條靠得很近的蛋白帶，但未見到其他的蛋白條帶，表明絕大部分雜質已被除去。將所得樣品進行活性電泳顯示，這2條蛋白條帶分別是B1漆酶的2種同工酶，為獲得單一條帶，須進一步進行分離。這2種同工酶在同一個峰值收到，且該峰值活力最大，表明這2種同工酶所帶的電荷量比較接近。而其他漆酶同工酶由于電荷量不一樣，已經(jīng)被分離開了，但在收集管中酶含量低，故對其他幾種漆酶同工酶沒有進一步分離純化。

將粗酶液過離子交換柱后酶活性峰值收集液進行凍干，再進行SephadexG-100凝膠過濾，酶活性峰值出現(xiàn)在第23個收集管中，將其峰值酶液收集，然后用SDS-PAGE檢測收集液中漆酶的純度，Native-PAGE檢測蛋白活性，電泳結果（圖3-b）顯示，峰值收集液仍然存在有2條蛋白條帶，且這2條帶都顯示漆酶的活性，和離子交換柱層析后酶活性峰值收集液的電泳結果一樣，這表明該步驟中凝膠過濾的分子篩作用并沒有將2種同工酶完全分開，說明B1漆酶的這2種同工酶分子量相差很小。

2.2.2活性電泳切膠為了進一步將這2種同工酶分離開，本研究應用了活性電泳切膠法。將經(jīng)過SephadexG-100凝膠過濾后峰值收集液凍干后進行活性電泳，用底物（愈創(chuàng)木酚）活性顯色后顯示出漆酶的同工酶條帶，然后用切割凝膠的方法得到漆酶的2個同工酶：Lac1和Lac2。通過SDS-PAGE檢測切膠回收后的蛋白，能夠檢測到單一蛋白條帶，表明2種漆酶同工酶已被分離開（圖4-A）。其中Lac1的分子量大約為64 ku，而Lac2分子量大約為62 ku，這一結果證明了這2種同工酶的分子量比較接近?；钚噪娪具M一步顯示出，2條分離條帶都顯示出漆酶的活性。從條帶的顏色深淺可以看出，Lac1的蛋白濃度比Lac2的高，酶活性要比Lac2高（圖4-B和C）。本試驗證明通過活性電泳切膠法能將這2種同工酶分離。

2.3漆酶Lac1和Lac2的酶學性質

2.3.1最適pH值以ABTS作底物，在Na2HPO4-檸檬酸作緩沖液的反應體系下，分別檢測不同pH值下的酶活性，得到2種同工酶Lac1和Lac2的最適pH值均為2.2左右（圖5），由于Na2HPO4-檸檬酸緩沖液的最小pH值為2.2，因此未能比較pH值小于2.2的情況。

2.3.2最適溫度由圖6可見，Lac1在溫度為50 ℃時酶活最高，而Lac2在溫度為40 ℃時酶活最高，在20～60 ℃范圍內均顯示較高的酶活，大于60 ℃時，酶活力下降很快。

2.3.3動力學常數(shù)測定采用ABTS作為漆酶反應底物，在30 ℃、pH值 4.0 條件下取不同濃度的ABTS，測定其反應速度（v），用Linewear-Burk作圖法，得到1/v與1/[S]的關系曲線見圖7，Lac1的Km值為1.952 mmol/L，vmax為3.035 mmol/（L·min），Lac2的Km值為0.255 mmol/L，vmax為0.856 mmol/（L·min），Lac2的Km值要小于Lac1的Km值，表明Lac2對ABTS底物的親和力比Lac1高。

3結論與討論

漆酶是一類多酚氧化酶，也是一種含有銅原子的糖蛋白，漆酶廣泛分布于以擔子菌為主的白腐真菌中，參與木質素的生物降解。多數(shù)白腐菌具有2種以上的漆酶同工酶，其同工酶的產(chǎn)生與真菌的遺傳因素以及生理發(fā)育狀況有關，不同的白腐菌產(chǎn)生的同工酶數(shù)量會不一樣。本試驗中的白腐菌Trametes sp.B1在固體培養(yǎng)條件中能產(chǎn)生5條明顯的同工酶條帶。劉尚旭等報道了糙皮側耳屬不同菌株能產(chǎn)生4～9條同工酶[13]；楊建明等發(fā)現(xiàn)毛木耳AP菌株至少產(chǎn)生3種漆酶同工酶[14]；郭偉云等發(fā)現(xiàn)云芝菌能產(chǎn)生2種同工酶[15]；同一種屬不同菌株中漆酶同工酶譜的變化可以為分類學提供一定的借鑒，方自若等深入研究了側耳種群不同菌株的漆酶同工酶譜特征，發(fā)現(xiàn)這些菌株之間的差異，對于種的分類是很有價值的[16]。漆酶同工酶出現(xiàn)在次生代謝階段，屬于一類誘導酶，在培養(yǎng)條件和營養(yǎng)成分發(fā)生變化時，也會影響到同工酶數(shù)量的變化。本試驗中發(fā)現(xiàn)在木質素類固體培養(yǎng)條件下，該菌能產(chǎn)生5條同工酶，而在液體合成培養(yǎng)基中只產(chǎn)生2種同工酶，可能是木質素類對酶的誘導作用而產(chǎn)生的。另外，劉尚旭等認為漆酶活性的高低可能和漆酶同工酶之間存在密切的聯(lián)系，同時漆酶活性高的條帶也許是這個基因易于表達[13]。

很多文獻已經(jīng)報道了多種真菌的漆酶分離純化，利用蛋白分子量和所帶電荷的差異，主要采用2～3步柱層析的方式分離得到。郭偉云等采用DEAE-Sepharose Fast Flow和SephadexG-100凝膠過濾兩步柱層析，從云芝菌中得到2種漆酶同工酶，分子量分別是64 ku和60 ku[15]；楊建明等利用硫酸銨分級沉淀和離子交換柱層析，對毛木耳AP菌株的漆酶粗酶液進行純化，獲得了3種分子量不同的漆酶[14]；王方忠從香菇所發(fā)酵的粗酶液中，經(jīng)過丙酮分級沉淀、DEAE-纖維素離子柱層析和Sephadex G-100柱層析，獲得了2種漆酶同工酶[17]。這些能分離開的漆酶同工酶，彼此間的蛋白分子量和所帶電荷有明顯的差異，而在本試驗中采用DEAE-Sepharose Fast Flow和SephadexG-100凝膠過濾方式并未能將漆酶的2種同工酶分開，這一結果表明Trametes sp.B1產(chǎn)生的這2種同工酶蛋白分子量和所帶電荷差異很小。

切膠純化法是利用各種蛋白組分在凝膠電泳中由于遷移率不同而彼此分開，然后染色后使目標蛋白在凝膠上顯示出來，再將其所處位置的蛋白條帶切割下來，并回收凝膠中的目標蛋白，從而達到純化分離的目的[10]。本研究采用簡單的活性電泳切膠法，進一步將這2種同工酶分開，從而避免了復雜的柱層析分離，既快速有效又節(jié)省時間。將割下來的膠帶用超純水浸泡，回收的2種浸泡液在SDS-PAGE電泳圖中都只顯示1條條帶，這說明采用此法分離這2種同工酶切實可行。這種方法已經(jīng)有了很多成功的應用，陳敏等報道了切膠純化法分離了木質素降解酶[10]。當然這種方法的使用具有一定的局限性，首先需要樣品中大量的雜蛋白已被去掉，否則在切膠純化時得到的蛋白不純；其次切膠純化法分離出來的蛋白量較少，回收率不高。本研究中SDS-PAGE染色顯示出分離的2條蛋白條帶的顏色都比較淺，這表明從凝膠內溶解到水里的只是其中的一部分酶蛋白，有很大部分仍留在原來的凝膠內。檢測2種同工酶的回收率，分別為1.82%和2.28%，證明樣品回收率較低。如果在以后的研究中能找到一種辦法增大凝膠中酶的浸出率，那將對漆酶同工酶的分離純化帶來極大的意義。

多數(shù)真菌漆酶最適pH值在3～5之間，而細菌漆酶最適pH值會高一些，甚至可以在pH值5以上，王方忠等分離的漆酶同工酶最適pH值為4左右[17]。本研究分離的2種漆酶同工酶在以ABTS為底物時，最適pH值都在2.2，表明這2種漆酶同工酶可以在偏酸的體系下應用。這2種同工酶最適pH值差異較小，表明在同一種緩沖體系中所帶電荷量相似，并且分離的2種漆酶同工酶分子量分別是64 ku左右和 62 ku 左右，也比較接近，這一結果也進一步解釋了為什么采用DEAE-Sepharose fast flow和SephadexG-100凝膠過濾方式并不能將其分開。盡管這2種同工酶在最適pH值和分子量上差異較小，但其最適溫度和Km值不同，表明2種同工酶本質上有一定的差異。漆酶同工酶的差異主要由2種原因造成，一方面是編碼漆酶的基因差異，另一方面是由于基因表達翻譯后的糖蛋白修飾。漆酶同工酶在不同的物種和同一種內之間的差異性，表明了漆酶的多樣性，這有利于漆酶應用范圍的擴大。

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