張安世　駱揚(yáng)　范定臣　張中海

摘要： 采用SCoT標(biāo)記分析了18個(gè)皂莢種質(zhì)的遺傳多樣性，并采用UPGMA法對(duì)18個(gè)皂莢種質(zhì)進(jìn)行了聚類分析。在此基礎(chǔ)上，通過篩選出的多態(tài)性條帶構(gòu)建了18個(gè)皂莢種質(zhì)的SCoT指紋圖譜。擴(kuò)增結(jié)果表明：從51個(gè)SCoT引物中篩選了15個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出226條帶，其中多態(tài)性條帶216條，多態(tài)性比率為96.61%。各引物多態(tài)性信息含量（PIC）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）和Shannons信息指數(shù)（I）的平均值分別為0.875 9、1.964 9、1.440 1、0.272 6、0.426 1。18個(gè)皂莢種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)在0.491 4～0.938 1之間，表明供試材料之間具有較豐富的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果表明： 在遺傳相似系數(shù)為0.60處可將18個(gè)皂莢種質(zhì)分為3組，其中野皂莢單獨(dú)為一組，山皂莢和皂莢T聚為一組，其它皂莢材料聚為一組。利用3個(gè)引物擴(kuò)增的8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了18份皂莢種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，可以將其區(qū)分并精準(zhǔn)鑒定。該研究結(jié)果為皂莢種質(zhì)的鑒定和新品種選育提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 皂莢， SCoT， DNA指紋圖譜， 遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： Q949.9， S718.46

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）11137808

Abstract： Genetic diversity of eighteen Gleditsia sinensis germplasms was analyzed based on SCoT markers， the cluster analysis on eighteen G. sinensis germplasms was carried out by UPGMA method， and the SCoT fingerprints of eighteen G. sinensis germplasms were constructed by the polymorphic bands. The results of amplification showed that， 226 SCoT bands were obtained from fifteen primers selected from 51 SCoT primers， including 216 polymorphic bands， with a polymorphism rate of 96.61%. The average of the polymorphism information content（PIC）， observed number of alleles（Na）， effective number of alleles（Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannons information index （I） were 0.875 9， 1.964 9， 1.440 1， 0.272 6 and 0.426 1， respectively. The genetic similarity coefficients of these samples were between 0.491 4 and 0.938 1. Therefore， it indicates that there are rich genetic diversities among these materials. The results of cluster analysis showed that， eighteen G. sinensis germplasms could be divided into three groups when the genetic similarity coefficient was 0.60. G. heterophylla formed the first group， G. melanacantha and ZaojiaT formed the second group， and the others formed the third group. DNA fingerprints of eighteen samples were constructed from eight polymorphic loci amplified by three primers， and these materials could be distinguished and identified accurately. All these results provide the important information for the identification and breeding for new cultivars of G. sinensis.

Key words： Gleditsia sinensis， SCoT， DNA fingerprint， genetic diversity

皂莢屬（Gleditsia Linn.） 系豆科蘇木亞科， 全世界約12種， 主要分布于亞洲、美洲和熱帶非洲（顧萬春等，2003）。中國(guó)產(chǎn)8種， 引進(jìn)1種， 其中中國(guó)皂莢是分布在我國(guó)的特有種， 廣泛分布于我國(guó)東北、華北、華東、華南等地， 多生長(zhǎng)于平原、山谷及丘陵地區(qū)。皂莢能抗旱、耐鹽、耐高溫，具有多種多樣的生態(tài)屬性，遺傳多樣性程度高，是經(jīng)濟(jì)林、用材林、防護(hù)林及園林綠化的理想樹種（顧萬春等，2003；楊海東，2003）。皂莢具有很高的藥用價(jià)值，皂莢、皂刺、皂根、皂葉均可入藥，特別是棘刺是中醫(yī)治療乳腺癌、肺癌等多種癌癥的常用配伍藥之一， 被列為抗癌中草藥（蔣建新等，2003）。同時(shí)，皂莢還是優(yōu)良的城市抗污染劑和日用化工原料（王薊花等，2008）， 殺蟲、殺鼠效果也非常好（張宏利等，2013）。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)皂莢的研究主要集中在皂莢果實(shí)與皂刺中活性成分（張宏利等，2013； 余俐佳等， 2016）、引種栽培（范定臣等，2015）及生態(tài)屬性（楊海東，2003）等方面，并開展了相關(guān)的遺傳學(xué)研究（蘭彥平和顧萬春，2006； 李偉等，2013）。最近，分子標(biāo)記技術(shù)也已開始在皂莢研究中得到應(yīng)用。邢俊連等（2017）成功地進(jìn)行了皂莢ESTSSR引物的開發(fā)與篩選，且證實(shí)這些引物在其近緣種間具有很高的通用性，為以后開展皂莢種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究提供有效的分析方法和手段。李偉等（2017）利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)10個(gè)南方皂莢群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明群體內(nèi)的變異是皂莢遺傳變異的主體，皂莢群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的形成不僅與其分布廣泛、種子特性及生活史有關(guān)，而且與人為的砍伐、引種、生境片段化等因素有重要關(guān)系，并由此提出了皂莢的保護(hù)策略。就目前而言，分子標(biāo)記技術(shù)在皂莢的系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)資源鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等方面還缺乏有效利用。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，大量的分子標(biāo)記技術(shù)被開發(fā)利用，每種分子標(biāo)記技術(shù)都各有其特點(diǎn)。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism， SCoT）是由Collard & Mackill（2009）開發(fā)的新目的基因分子標(biāo)記技術(shù)，并首先在水稻上得以應(yīng)用，是一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù)。SCoT具有操作簡(jiǎn)單、通用性良好、多態(tài)性豐富、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又能對(duì)性狀進(jìn)行跟蹤，有利于分子輔助育種，已在多種植物上得到成功應(yīng)用（楊祥燕等，2013； 王健勝等，2015； 王發(fā)明等，2017）。因此，本試驗(yàn)采用SCoT標(biāo)記對(duì)河南省18份皂莢種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為皂莢種質(zhì)資源的鑒定和優(yōu)良品種的選育等研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

材料包括3個(gè)種共18份，具體見表1。除野皂莢、山皂莢和皂莢T為實(shí)生苗外，其余的15份材料是以單株產(chǎn)量高、單刺（或單果）平均重量重的皂莢植株為接穗、野皂莢為砧木（濟(jì)科除外）嫁接而獲得的無性系， 其中部分品種已經(jīng)通過河南省

林木品種審定委員會(huì)審定。另外皂莢T是從土耳其引進(jìn)種子的3年生實(shí)生苗，曾被當(dāng)做皂莢品種，但其所表現(xiàn)出的形態(tài)特征與皂莢有較大差異，而與山皂莢極為相似。所有材料均隨機(jī)選取3株，每株采集2片健康、幼嫩葉片，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑為2×Taq MasterMix（含有Taq DNA Polymerase， 2×Taq PCR Buffer， 3 mmol·L1 MgCl2和400 μmol·L1 dNTP mix）購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，SCoT引物根據(jù)蘇亞春等（2012）公布的40條引物序列由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

1.2 皂莢基因組DNA的提取

每個(gè)皂莢品種取3片不同植株的幼嫩葉片等量混合，采用改良CTAB法（張安世等，2009）提取皂莢基因組DNA，并將模板DNA濃度稀釋至20 ng·μL1，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SCoTPCR分析

選用40個(gè)SCoT單引物（SC1SC40）和11個(gè)由SCoT單引物搭配而成的引物組合共計(jì)51個(gè)引物對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體積 10 μL，其中DNA 1.0 μL，引物 1.4 μL，2×Taq MasterMix 5.0 μL，RNaseFree water 2.6 μL。SCoTPCR擴(kuò)增程序：首先94 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min。最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分離。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行條帶的統(tǒng)計(jì)分析。在電泳圖相同位置上若出現(xiàn)DNA條帶記為“1”， 無記為“0”，形成1，0矩陣，將此矩陣導(dǎo)入POPGENE1.32軟件進(jìn)行多態(tài)性百分率（PPL）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、

有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性（H）和Shannons信息指數(shù)（I） 等遺傳多樣性參數(shù)分析，參照黃秀等（2014）方法計(jì)算引物多態(tài)性信息含量（PIC），通過NTSYSpc 2.0軟件依據(jù)UPGMA法進(jìn)行聚類分析，同時(shí)參照云天海等（2013）的方法構(gòu)建18個(gè)皂莢種質(zhì)DNA指紋圖譜。

2結(jié)果與分析

2.1 SCoT引物篩選與多態(tài)性分析

選用51個(gè)SCoT引物對(duì)18份皂莢種質(zhì)材料進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，最終篩選出了條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的15個(gè)引物，其中，包括10個(gè)SCoT單引物和5個(gè)引物組合。所用引物序列及多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。15個(gè)引物共擴(kuò)增出226個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶216個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）為96.61%。多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.783 0～0.925 6，平均值為0.875 9。說明所選引物在18個(gè)皂莢種質(zhì)間具有很高的SCoT多態(tài)性。觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）的變化范圍為1.812 5～2.000，平均值為1.964 6；有效等位基因數(shù)（Ne）的變化范圍為1.319 1～1.591 0，平均值為1.440 1；Neis基因多樣性指數(shù)的變化范圍為0.215 4～0.345 0，平均值為0.272 6；Shannons信息指數(shù)的變化范圍為0.349 0～0.516 8，平均值為0.426 1。上述結(jié)果表明，18個(gè)皂莢種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性。同時(shí)，利用SPSS17.0軟件對(duì)4個(gè)主要遺傳多樣性參數(shù)多態(tài)性信息含量、有效等位基因數(shù)、Neis 基因多樣性指數(shù)和Shannons信息指數(shù)進(jìn)行非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，結(jié)果顯示18個(gè)皂莢種質(zhì)之間遺傳多樣性水平存在顯著性差異（X2=49.795，P=0.000﹤0.001），表明上述分析得到的各參數(shù)值能很好地說明皂莢種質(zhì)間遺傳多樣性水平。

2.2 遺傳相似性和聚類分析

利用NTSYSpc軟件計(jì)算種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（Gs），結(jié)果表明18份皂莢種質(zhì)兩兩間的Gs在0.491 4～0.938 1之間，平均值為0.711 4，變幅為0.446 7，說明供試材料間存在較大的遺傳差異。其中焦科4和焦科5的Gs最大（0.938 1），親緣關(guān)系最近，山皂莢和豫皂2的Gs最小（0.491 4），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

利用NTSYSpc軟件對(duì)18份皂莢種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明（圖2），在Gs為0.60處可將18分皂莢材料分為3組。第1組為野皂莢；第2組為山皂莢和皂莢T；第3組共有15個(gè)皂莢種質(zhì)材料：密刺、碩刺、皂莢H、豫皂1、懷皂王2、博科、焦科1、焦科2、焦科3、濟(jì)科、嵩刺1、太行2、豫皂2、焦科4和焦科5。

2.3 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

通過篩選的15個(gè)引物對(duì)18份皂莢種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果分析，選取其中SC1、SC13和SC23 3個(gè)引物擴(kuò)增的8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了18份皂莢種質(zhì)的DNA指紋圖譜（圖3）。每份材料都有唯一的指紋圖譜，可以將18份皂莢種質(zhì)區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定。

3討論與結(jié)論

3.1 皂莢種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

利用分子標(biāo)記技術(shù)分析皂莢種質(zhì)資源的遺傳多樣性，了解不同皂莢種質(zhì)之間的遺傳差異，對(duì)于皂莢的新品種選育和種質(zhì)資源鑒定具有重要意義。在遺傳多樣性研究中，多態(tài)性是評(píng)價(jià)遺傳多樣性的重要依據(jù)之一。在本研究中，通過SCoT標(biāo)記對(duì)18份皂莢種質(zhì)資源的遺傳變異分析表明，多態(tài)性位點(diǎn)百分率 （PPL）高達(dá)96.61%，多態(tài)性信息量（PIC）為0.875 9，處于高水平（高：PIC >

0.5； 適中： 0.5 > PIC > 0.25； 低： PIC < 0.25）（徐玉仙等，2015），說明本研究篩選的引物在供試材料間具有很高的多態(tài)性，可以有效的用于皂莢的遺傳多樣性分析。同樣，有效等位基因數(shù)、Neis 基因多樣性和 Shannons 信息指數(shù)分別為1.440 1、0.272 6和0.426 1，也處于較高水平。另外，18個(gè)皂莢種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（Gs）在0.491 4～0.938 1之間，變幅達(dá)0.446 7，說明供試材料間存在較豐富的多樣性。通過對(duì)多態(tài)性信息量、有效等位基因數(shù)、Neis 基因多樣性指數(shù)和Shannons信息指數(shù)，4個(gè)主要的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行的非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨(dú)立樣本檢驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。

3.2 皂莢種質(zhì)資源的聚類分析

本研究涉及野皂莢、山皂莢和皂莢共3個(gè)種18份材料。聚類結(jié)果表明，在Gs為0.60處可將18份皂莢種質(zhì)分為3組。其中，野皂莢單獨(dú)為一組，山皂莢和皂莢T聚為一組，其余15份皂莢種質(zhì)材料聚為一組。在上述第3組的15份皂莢種質(zhì)中，焦科4和焦科5是以皂莢莢果為目的選育的品種，其余均以皂刺為目的選育。焦科4和焦科5的接穗均為莢果較大的不同皂莢品種，在所有供試材料中親緣關(guān)系最近，在其15份皂莢種質(zhì)一組聚為一個(gè)分支，其它13份材料聚為另一分支，與預(yù)期相符。濟(jì)科是以嵩刺1為接穗、山皂莢為砧木的嫁接品種，兩者首先聚在一起，也與實(shí)際情況相吻合。從聚類圖中還能看出部分種質(zhì)材料具有一定的地理來源一致性特征。如采集于河南修武的5份材料除焦科4和焦科5聚在一起外，焦科1、焦科2和焦科3也聚在一起；采集于河南博愛的5份材料也分別聚于2個(gè)分支，豫皂1、懷皂王2和博科為一個(gè)分支，太行2和豫皂2為另一分支；采集于河南嵩縣的3份材料除嵩刺1外，其余2份材料密刺和碩刺聚在一起。另外，皂莢T是從土耳其引進(jìn)種子的三年生播種苗，起初曾被作為皂莢品種，但其三年生播種苗無論從葉的形態(tài)、皮孔大小及形狀以及嫩枝的顏色都與山皂莢極為相似，因此認(rèn)為該種子在引進(jìn)時(shí)可能鑒定有誤。本研究結(jié)果顯示山皂莢和皂莢T聚為一組，兩者具有很近的親緣關(guān)系，因此，應(yīng)將皂莢T歸為山皂莢而非皂莢品種，同時(shí)還要結(jié)合其它標(biāo)記技術(shù)及其以后的生長(zhǎng)過程中所表現(xiàn)出的其它形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.3 皂莢種質(zhì)資源鑒定與DNA指紋圖譜構(gòu)建

分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，能直接反映植物間的遺傳差異，具有高效、快捷、準(zhǔn)確度高、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為植物種質(zhì)鑒定的有效方法，也是數(shù)字化身份證構(gòu)建的有效工具，已在大量的種質(zhì)資源研究中得到應(yīng)用。SCoT作為一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，在植物種質(zhì)鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建方面已經(jīng)得到了初步應(yīng)用。陳紅等（2014）利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)71份貴州桃種質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，來自貴陽和黔南州荔波縣的兩份青桃資源（20號(hào)和39號(hào)）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明它們?yōu)橥愇铩Ｍ瑫r(shí)也證實(shí)自同一縣份的血桃（31號(hào)和32號(hào)）和白花桃（16號(hào)和19號(hào)）不完全是同一樣品，從而在分子水平理清了供試材料的親緣關(guān)系，并對(duì)部分桃資源名稱混亂的現(xiàn)象進(jìn)行了糾正，為貴州桃種質(zhì)資源的科學(xué)保存與利用提供了依據(jù)。林清等（2013）通過對(duì)5個(gè)SCoT引物在46份供試芥菜種質(zhì)中擴(kuò)增所得的16個(gè)多態(tài)性DNA譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，初步構(gòu)建了芥菜種質(zhì)的指紋圖譜，能夠準(zhǔn)確地鑒定這46份芥菜種質(zhì)。本研究利用SCoT技術(shù)，選用3個(gè)引物擴(kuò)增的8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了18份皂莢種質(zhì)的DNA指紋圖譜，為皂莢種質(zhì)間的鑒別提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，通過SCoT標(biāo)記對(duì)18份皂莢種質(zhì)資源的遺傳變異分析表明，18份皂莢種質(zhì)材料間具有較豐富遺傳多樣性；聚類分析與皂莢的傳統(tǒng)分類基本吻合，并對(duì)可疑材料皂莢T進(jìn)行了合理歸類；利用3個(gè)SCoT引物擴(kuò)增的8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建的DNA指紋圖譜具有唯一性，可以利用此圖譜對(duì)供試材料進(jìn)行鑒定。

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