滕婕華　衛(wèi)家賢　李象欽　李超群　倪敏　翁樂逸　謝國文

摘要： 掌葉木居群具有較豐富的遺傳多樣性，該研究利用9對微衛(wèi)星（SSR）分子標(biāo)記揭示了掌葉木（Handeliodendron bodinieri）的遺傳多樣性。結(jié)果表明：觀測等位基因數(shù)（Na）平均為3.903，有效等位基因數(shù)（Ne）平均為2.545，期望雜合度（He）平均為0.521，Shannons多態(tài)性信息指數(shù)（I）為0.962，PIC平均值為0.465。掌葉木的自然分布居群有相對較高的遺傳多樣性，但由于人為破壞等因素導(dǎo)致該群體瀕危，而瀕危并不是因?yàn)檫z傳多樣性降低而造成的。居群間的遺傳分化為掌葉木8個居群間的遺傳一致度為（GI=0.849～0.970），遺傳距離為（GD=0.032～0.164）?；贜eis遺傳距離用UPGMA法對掌葉木居群進(jìn)行聚類，Neis的基因分化系數(shù)為（Gst）為0.027，平均Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)（G′stN）為0.031，平均Hericks標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)（G′stH）為0.064，基因流（Nm）為3.368。AMOVA分析結(jié)果表明：掌葉木居群間變異占3%，居群內(nèi)變異占97%，居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的分化。利用Mantel檢測發(fā)現(xiàn)，居群間的遺傳距離與地理距離顯著正相關(guān)（r=0.299，P<0.05）。該研究結(jié)果為掌葉木生物多樣性和資源保護(hù)與利用提供了更充分的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 掌葉木， 微衛(wèi)星（SSR）， 瀕危植物， 遺傳多樣性， 毛細(xì)管電泳

中圖分類號： Q949.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）11147109

Abstract： Genetic diversity of Handeliodendron bodinieri was studied with microsatellite （SSR） markers. We used nine pairs polymorphic microsatellite loci to reveal that H. bodinieri was rich in genetic diversity. Average number of alleles （Na） and effective number of alleles （Ne） were 3.903 and 2.545 respectively. The mean expected heterozygosity （He） was 0.521 and Shannons diversity （I） was 0.962 and PIC=0.465. Natural populations of H. bodinieri had relatively high level of genetic diversity， however the genetic diversity of the populations were reduced due to factors like sabotage. The majority of genetic variation occurred within populations. The genetic distance

（GD） and genetic identity （GI） among eight populations of H. bodinieri were 0.032-0.164， 0.849-0.970， respectively. According to genetic distance UPGMA， genetic differentiation （Gst = 0.027）， G′stN=0.031， G′stH=0.064 and gene flow （Nm） was 3.368. The results analyzed by AMOVA showed that the variation among the populations was 3%， while the variation within the populations was 97%. Mantel test revealed that there was positive correlation between genetic distance and geographical distance（r=0.299， P<0.05） among the populations. The results are helpful to develop scienfific and valid strategies for protecting the biodiversity of H. bodinieri.

Key words： Handeliodendron bodinieri， microsatellite（SSR）， endangered plant， genetic diversity， capillary electrophoresis

掌葉木（Handeliodendron bodinieri）屬于無患子科（Sapindaceae）掌葉木屬（Handeliodendron）植物，是中國特有單種屬中國孑遺植物（傅立國和金鑒明，1992），又稱鴨腳板、平舟木、韓德木，被列為國家I級保護(hù)植物。僅分布于我國廣西與貴州接壤的喀斯特地貌的石灰?guī)r山地常綠闊葉林中，海拔高度在500～900 m之間的疏林或林緣，密集的樹林中較少。廣西北部的樂業(yè)、田林、東蘭、環(huán)江、南丹和貴州南部的荔波、平塘、獨(dú)山等地（張著林等，2000）。木材質(zhì)地堅硬，是用于工程建筑及制作家具的良好材料，且種子可用于榨油，具有重要的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值（賈良志和周俊，1987；陳波濤等，2007）。掌葉木根系發(fā)達(dá)，依靠根系深入到石縫之中吸取養(yǎng)料來維持生存；具掌狀復(fù)葉，與其它無患子科植物的羽狀復(fù)葉不同。其植物分類系統(tǒng)位置介于無患子科與七葉樹科之間，對于研究無患子科和七葉樹科的系統(tǒng)發(fā)育具有重要的意義。

遺傳多樣性是指存在于不同生物個體內(nèi)、單個物種內(nèi)及多個物種間總的遺傳變異（Hughes et al，2008）。由于單一或生物個體較稀少的物種中遺傳變異是有限的，所以較難適應(yīng)千變?nèi)f化的環(huán)境；而在不同個體中，居群擁有豐富的遺傳變異，因此能更好地去適應(yīng)變化中的環(huán)境（Rao & Hodgkin，2002；Pauls et al，2013）。不同物種間多樣性與不同群體遺傳結(jié)構(gòu)有很大的區(qū)別，所以，采取正確的策略和措施對物種進(jìn)行保護(hù)，前提一定要建立在對該物種群體遺傳學(xué)的研究之下（趙冰等，2015）。微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列（SSR），是現(xiàn)階段研究群體遺傳多樣性較好的標(biāo)記（Arnold & Emms，1998） 。SSR標(biāo)記在真核生物基因組中是隨機(jī)分布的，由于其豐富的多態(tài)性和共顯性遺傳等特征，被廣泛應(yīng)用于種間和種內(nèi)遺傳多樣性的分析。國內(nèi)有開展過掌葉木的有性繁殖、芽苗移栽、遷地保護(hù)、居群生態(tài)、種子生態(tài)以及生物學(xué)特性等研究（周洪英和張著林，2000；韋小麗等，2006；黃仕訓(xùn)等，2002；張著林和林昌虎，2006；常進(jìn)雄等，2002；熊志斌等，2003； 曹麗敏等，2006）。但是，在群體遺傳多樣性方面的研究相對滯后，僅見Wang et al（2008）、賀瑞坤等（2011）進(jìn)行了掌葉木微衛(wèi)星分子標(biāo)記的相關(guān)開發(fā)及He et al （2012）對掌葉木的遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)的研究報道， 但研究中取的居群數(shù)僅為茂蘭自然保護(hù)區(qū)一個，結(jié)果尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過前人已開發(fā)的SSR引物，對掌葉木自然分布區(qū)采集8個居群進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，試圖進(jìn)一步確認(rèn)掌葉木的居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為掌葉木生物多樣性保護(hù)和利用提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

在掌葉木植物分布范圍內(nèi)進(jìn)行居群廣泛調(diào)查與采樣，從廣西西北部的東蘭（DL）、南丹（ND）、環(huán)江（HJ）、樂業(yè)（LY）、田林（TL）到貴州南部的獨(dú)山（DS）、荔波（LB）、平塘（PT）8個居群（表1），分別采集24個個體（個體之間的距離在30 m 以上，以免克隆株）的新鮮葉片，個體數(shù)量相等才能更科學(xué)的衡量遺傳多樣性水平。硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測采用博邁德快速提取試劑盒（購自北京博邁德生化科技有限公司）對掌葉木葉片進(jìn)行總DNA提取。采用紫外可見分光光度計對DNA的含量及純度進(jìn)行測定，所提取的DNA質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與毛細(xì)管電泳通過隔號選取96個雙數(shù)掌葉木個體DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用9對SSR引物對96份掌葉木材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，9對引物分別從前人已開發(fā)（Wang et al， 2008； 賀瑞坤等， 2011）并通過篩選進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表2），在正向引物5′端以磷熒光染料標(biāo)記。

PCR總反應(yīng)體系在10 μL的體積中進(jìn)行，包括模板DNA 0.5 μL，正反引物各0.6 μmol·L1，2×PCR Master Mix 5 μL，加ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序如下：先95 ℃條件下預(yù)變性5 min，而后95 ℃變性30 s，52～56 ℃（視引物Tm值而定）退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后在72 ℃條件下在延伸4 min，4 ℃保存。

利用毛細(xì)管電泳法（CE）將PCR的產(chǎn)物在ABI3730 XL基因分析儀上進(jìn)行檢測結(jié)果。每個CE樣品中含有0.3 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL Genescan500分子量內(nèi)標(biāo)和9.5 μL去離子甲酰胺?；旌霞尤?6孔板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機(jī)檢測，PCR產(chǎn)物和Genescan500分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號均可在毛細(xì)管電泳的過程中由基因分析儀自動保存（圖1，圖2）。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析使用GeneMarkerV2.2.0軟件對ABI3730XL基因分析儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計得出不同的SSR引物對掌葉木擴(kuò)增得到的SSR標(biāo)記片段，將SSR標(biāo)記片段與Genescan500分子量內(nèi)標(biāo)比較，得到不同片段長度大小序列，利用Genepop軟件和GenAlEx 6.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算掌葉木各居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率、Neis基因多樣性（Nei）、Shannons遺傳多樣性信息指數(shù)、遺傳分化系數(shù)（Fst）、基因流（Nm）、居群間遺傳距離與遺傳一致度，及AMOVA分析和Mantel相關(guān)分析性檢驗(yàn)等，并利用MEGA5.0軟件來構(gòu)建NJ遺傳關(guān)系樹。

2結(jié)果與分析

2.1 居群遺傳多樣性參數(shù)

通過隔號選取96 份掌葉木個體，篩選出9 對SSR 分子標(biāo)記，進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，單個居群的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）變化范圍在89%～100%之間，平均為97%，觀測等位基因數(shù)（Na）變化范圍在2.889～4.444之間，平均為3.903，有效等位基因數(shù)（Ne）變化范圍在2.283～2.791之間，平均為2.545，期望雜合度（He）變化范圍在0.442～0.568之間，平均為0.521，Shannons多態(tài)性信息指數(shù)（I）變化范圍在0.818～1.061之間，平均為0.962。8個居群按各多樣性指標(biāo)排序，結(jié)果表明，東蘭（DL）居群的遺傳多樣性最高（PPB=100%， He=0.564， I=1.061），PIC值為0.511，環(huán)江（HJ）居群的信息指數(shù)最低（PPB=89%， He=0.483， I=0.818），PIC值為0.421，且與其他居群的差異較為顯著。通過研究結(jié)果比較，在本研究中， 掌葉木的期望雜合度（He=0.442～0.568，Mean=0.521），與He et al（2012）研究掌葉木的期望雜合度（He=0.463～0.510，Mean=0.489），數(shù)值較為相近。

2.2 居群遺傳結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步研究掌葉木居群間的遺傳分化程度，根據(jù)9對SSR引物擴(kuò)增的結(jié)果，計算各居群間的Neis遺傳距離（GD）和遺傳一致度（GI），以此來判定居群間相互關(guān)系的遠(yuǎn)近，表明每8個居群之間彼此關(guān)系的密切程度。由表4 中的數(shù)據(jù)可知，掌葉木8個居群間的遺傳一致度為（GI=0.849～0.970），遺傳距離為（GD=0.032～0.164），即8 個居群的遺傳一致度較高，遺傳距離較小，彼此之間關(guān)系密切。根據(jù)遺傳距離利用UPGMA法對8 個居群進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，掌葉木這8 個自然居群基本上符合了采集點(diǎn)的地理分布。

2.3 居群遺傳分化

2.3.1 遺傳分化系數(shù)利用GenAlEx 6.5 軟件統(tǒng)計掌葉木9 個微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)（Gst）、Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)（G′stH）、Hericks標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)（G′stH）、Josts變異估計（Dest）等指數(shù)（表5）。表5結(jié)果顯示，在9對SSR引物中，8 個掌葉木居群的平均Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)（G′stN）為0.031，平均Hericks標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)為0.064。

根據(jù)Neis總基因多樣性（Ht）及居群內(nèi)基因多樣性（Hs）來計算掌葉木的遺傳分化水平（Gst）。由表6可知，掌葉木居群的總基因多樣性平均為0.552，其中居群內(nèi)基因多樣性平均為0.521，Neis的基因分化系數(shù)平均為0.027，表明總變異中有2.7%的變異存在于居群間，97.3%的變異存在于居群內(nèi)。各居群間的基因流（Nm）為3.368，居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的分化。

2.3.2 分子遺傳變異分析（AMOVA）通過對掌葉木96個樣品進(jìn)行AMOVA分析，從居群遺傳變異分析結(jié)果（表7）可以看出，來源于居群間的遺傳變異占3%，而來源于居群內(nèi)的遺傳變異占97%，表明居群內(nèi)的遺傳變異大于居群間， 遺傳分化達(dá)到了極顯著水平（P<0.001）。AMOVA分析結(jié)果與基因分化系數(shù)（Gst）值所得結(jié)果一致。

2.4 Mantel相關(guān)性檢驗(yàn)

在本研究中，利用Mantel檢測遺傳距離（GD）和地理距離（GGD）的相關(guān)性，結(jié)果見圖4。由圖4的線性關(guān)系來看，圖中直線表明為正相關(guān)，且r=0.299， P=0.01， P<0.05為顯著，說明掌葉木遺傳距離與地理距離顯著正相關(guān)。

3討論

3.1 掌葉木的遺傳多樣性

SSR分子標(biāo)記具有較好的穩(wěn)定性、多態(tài)性高、共顯性、引物特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，是重要的DNA標(biāo)記技術(shù)之一（高志紅等，2002），且該技術(shù)較成熟，因此被廣泛運(yùn)用于遺傳多樣性的研究當(dāng)中。采用不同分子標(biāo)記進(jìn)行研究的群體具有較大差別的遺傳多樣性（徐立安等，2001；朱其慧等，2002）。

以觀測等位基因數(shù)（Na）作為衡量 SSR 位點(diǎn)多態(tài)性和居群變異程度高低的重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，使用的9 個SSR 位點(diǎn)在8 個掌葉木居群上的平均觀測等位基因數(shù)為 3.903。 以Shannons 信息指數(shù)作為評價遺傳多樣性的重要指標(biāo)；以生物多樣性指數(shù)PIC值來說明不同居群間的遺傳多樣性。在本研究中，9 個 SSR 位點(diǎn)在 8 個掌葉木居群上得到其物種水平上I= 0.962，PIC平均值為0.465，表明不同居群間的遺傳多樣性較高。掌葉木的期望雜合度（He=0.442～0.568，Mean=0.521），與He et al（2012）研究掌葉木的期望雜合度（He=0.463～0.510，Mean=0.489），數(shù)值較為相近。而與掌葉木的一個近緣種無患子科傘花木（Eurycorymbus cavaleriei）（He=0.710～0.754）相對而言，掌葉木的遺傳多樣性較低。

3.2 居群遺傳結(jié)構(gòu)

掌葉木8個居群間的遺傳一致度為（GI=0.849～0.970），遺傳距離為（GD=0.032～0.164），即8 個居群的遺傳一致度高，遺傳距離較小，彼此之間關(guān)系密切?；谶z傳距離進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)掌葉木這8 個自然居群基本上符合了采集點(diǎn)的地理分布。

遺傳分化是反映遺傳結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。本研究中8 個掌葉木居群的平均Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)為0.031，平均Hericks標(biāo)準(zhǔn)遺傳分化系數(shù)為0.064， Neis的基因分化系數(shù)平均為0.027，說明總變異中只有2.7%的變異存在于居群間，97.3%的變異存在于居群內(nèi)，大部分變異來自于居群內(nèi)。居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的分化。用AMOVA方法進(jìn)行方差分析結(jié)果表明： 掌葉木居群間變異占3%，居群內(nèi)變異占97%，居群間和居群內(nèi)的變異均是極為顯著（P<0.001） ，此分析結(jié)果與基因分化系數(shù)所得結(jié)論一致。

一般認(rèn)為當(dāng)基因流（Nm）大于1時，則它能足以抵制遺傳漂變的作用，并能防止遺傳漂變導(dǎo)致居群遺傳分化的發(fā)生（Slatkin，1981）。通過本實(shí)驗(yàn)研究，測得的居群間基因流值為3.368，屬于較高水平，這表明各居群間基因交流較為頻繁。在本實(shí)驗(yàn)研究中，居群間存在一定的基因交流很可能是影響8 個居群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素。用于本研究中所涉及到的 8 個居群均來自喀斯特地貌，推測其原因可能為（1）因?yàn)檎迫~木的花粉可以隨風(fēng)散播，花粉與種子可以隨風(fēng)四處散播（Greene，2005）；（2）河流和以掌葉木果實(shí)為生的動物是遠(yuǎn)距離的傳播基因交流等。

通過計算得出的遺傳距離和地理距離，利用Mantel檢測進(jìn)行相關(guān)性分析，得出結(jié)論：r=0.299， P=0.01， P<0.05為顯著，遺傳地理與地理距離顯著正相關(guān)。由于掌葉木分布范圍較小，生長在中國特有的喀斯特地貌，且其分類地位孤立。因此，掌葉木的遺傳距離與地理距離呈正相關(guān)，和其分布的地理位置有關(guān)。

通過野外調(diào)查得知，掌葉木多以星散分布為主，密林中很少見，多生長在疏林或林緣。掌葉木的自然分布居群有相對較高的遺傳多樣性， 但是由于人為破壞等因素導(dǎo)致該群體瀕危，而瀕危并不是因?yàn)檫z傳多樣性降低而造成的。本研究首次對掌葉木目前已知的所有居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，而同類研究掌葉木的 Wang et al （2008）、賀瑞坤等（2011）及He et al（2012）都只是選取了生長在荔波的一個居群。其中，Wang et al （2008）及賀瑞坤等（2011）開發(fā)了掌葉木的微衛(wèi)星SSR引物，但未對其遺傳多樣性進(jìn)行分析研究。因此，本研究對于分析掌葉木的遺傳多樣性信息更具有科學(xué)依據(jù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，掌葉木單個居群內(nèi)遺傳多樣性較豐富，但是居群間遺傳分化較小。因此，通過該實(shí)驗(yàn)得到的遺傳信息將為瀕危植物掌葉木生物多樣性保護(hù)和利用提供科學(xué)的依據(jù)。在掌葉木保護(hù)措施上，應(yīng)該以居群保護(hù)為重點(diǎn)，并且在較大程度內(nèi)保護(hù)現(xiàn)有個體數(shù)量的完整性來維護(hù)掌葉木居群的繁衍，應(yīng)加大保護(hù)防止生長在林緣的掌葉木個體因人為砍伐或其他因素破壞而造成遺傳多樣性損失。

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