段雙梅 趙恒 馬燕 蘇小琴 萬晶瓊 李振華 張石先 張磊 趙明

摘 要 通過富集方式和干燥方法的單因素實驗，最陡爬坡試驗和響應面設計，優(yōu)化辣木鮮葉γ-氨基丁酸（γ- aminobutyric acid，GABA）的富集工藝。建立的辣木鮮葉中GABA最適富集條件為辣木鮮葉在45 ℃下，真空處理34 h，然后50 ℃干燥。該條件處理的辣木GABA含量為（19.70±0.16）mg/g，是對照的2.63倍。

關鍵詞 辣木；真空處理；γ-氨基丁酸；響應面設計

中圖分類號 TS201 文獻標識碼 A

Abstract The γ-aminobutyric acid（GABA）enrichment technology in Moringa was optimized through single factor experiments， the steepest ascent experiment and a response surface design. An optimized technology was developed as follow： The fresh leaves of Moringa were treated in vacuum at 45 ℃ for 34 h and dired at 50 ℃. The content of GABA in Moringa was（19.70±0.16）mg/g， it was 2.63 times than that of the control. This study would provide technical support for the development of GABA-rich Moringa food.

Key words Moringa oleifera； vacuum treatment； γ-aminobutyric acid； response surface designs

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.027

辣木（Moringa oleifera）為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa），多年生速生樹木，最早產(chǎn)于印度[1]。其根、莖、葉、花、種子、樹枝及樹皮等均含有豐富的營養(yǎng)及藥用成分，如高蛋白質(zhì)、高鈣、維生素、氨基酸等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)辣木具有活化細胞、增強免疫力、保護心臟、降低血脂、預防癌癥等保健功效[4]。2012年，中國衛(wèi)生部批準辣木鮮葉為新資源性食品（2012年第19號）。近年來，隨著人們對健康的日漸重視和大健康產(chǎn)業(yè)的興起，辣木的營養(yǎng)價值、功能成分的研究及健康產(chǎn)品的開發(fā)受到廣泛關注[5]。隨著種植面積不斷擴大以及進入豐產(chǎn)期，辣木產(chǎn)量將極大地增加，精深加工將是產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵。

GABA是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中樞中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[6]，還具有降血壓[7-8]、降低膽固醇[9-11]、改善腦機能、抗驚厥、預防和調(diào)治癲癇[12]、活化腎肝功能、促進精子受精等多種生理活性及保健功能[13-14]。隨著人年齡增長及精神壓力增大會導致 GABA的積累異常困難，需通過日常飲食補充才能有效地改善這種狀況[15]。2009年，中華人民共和國衛(wèi)生部批準GABA為可用于食品生產(chǎn)加工的新資源食品[16]。目前，GABA功能性食品、保健品的研究開發(fā)已成為食品領域的研究熱點之一。

關于GABA食品的研究與開發(fā)火熱，主要有3種方式加工GABA食品，第一是通過真空等物理方式處理食品原料。如：日本、中國、斯里蘭卡等國[17]有報道，通過厭氧或紅外線處理鮮葉，加工GABA綠茶[18]、紅茶[19]、普洱茶[20]、白茶[21]、桑葉[22]等產(chǎn)品。又如，通過處理原料加工富含GABA萌芽糙米[23]、玉米[24]、米胚芽[25-26]、 GABA米糠[27]等產(chǎn)品。第二是應用產(chǎn)GABA的微生物發(fā)酵加工富含GABA的食品。如應用產(chǎn)GABA微生物發(fā)酵加工富含GABA的豆豉[28]、醬和腐乳[29]和四川泡菜[30]等發(fā)酵食品。此外，乳酸菌參與酸奶、奶酪的發(fā)酵，同時部分乳酸菌也能產(chǎn)生GABA，因此將二者結(jié)合可以加工出富含GABA的發(fā)酵乳制品。如Wang[31]、Nomur[32]發(fā)現(xiàn)應用乳酸菌發(fā)酵加工富含GABA奶酪。第三是外源添加加工富含GABA的食品。已有加工富含GABA的番茄紅素[33]、桑葉豆腐腦[34]和水晶粉絲[35]等專利。

盡管有很多研究和專利開展富含GABA的食品研究[35-38]，但未見富含GABA的辣木研究報道?；谏罴庸ぎa(chǎn)品是解決辣木產(chǎn)能過剩的重要途徑，以及GABA產(chǎn)品具有的廣闊市場前景，將兩種新資源性食品原料結(jié)合，研究加工富含GABA的辣木產(chǎn)品，具有重要理論與實際意義。為此，筆者研究辣木GABA富積條件，為富含GABA的辣木產(chǎn)品加工提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 辣木樣品 本研究所用材料，分別購置于云南曲靖與廣西南寧。其中富積方式、干燥方式以及爬坡實驗的材料購于云南曲靖；響應面及驗證試驗所用的辣木鮮葉購自廣西南寧。

1.1.2 主要試劑 色譜純甲醇、乙腈為美國TEDIA試劑公司產(chǎn)品；乙酸、四氫呋喃、三乙胺、氯仿、無水乙酸鈉、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 應用安捷倫1200系列HPLC系統(tǒng)，包括LC-20AB溶劑輸送單位，SIL-20A自動進樣器，CTO-20A柱溫箱（40 ℃），G1321A的熒光檢測器（激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm），LC Ver1.23工作站。色譜柱為Agilent Hypersil AA-ODS（2.1×200 mm，5 μm，U.S.A），配有保護柱為Hypersil ODS柱（20×2.1）（安捷倫，美國）。

1.2 方法

1.2.1 辣木GABA提取 辣木干燥葉粉碎過60目篩，稱取1.0 g樣品，用量筒量取70 ℃水100 mL，加入三角瓶中，沸水浴提取1 h，過濾，定容至100 mL。取1 mL濾液，加入200 μL氯仿，靜置5 min，離心5 min（4 ℃ 12 000 r/min），取上清液。上清液用0.45 μm硝酸纖維素膜過濾，濾液為待測液。

1.2.2 辣木GABA富集工藝優(yōu)化

（1）富集方式單因素試驗。根據(jù)文獻報道和實驗室條件，各稱取辣木鮮葉100 g，分別置于凍干機（FD5-series，美國金西盟國際集團）中9 h、真空干燥箱（DZF-6020，上海博訊實業(yè)有限公司）中真空（0.07 MPa）處理9 h以及自制容器中充氮處理9 h。每種處理重復2次，處理之后，按下述優(yōu)化的干燥方式干燥，按方法提取測定樣品GABA含量，研究富集方式對辣木GABA含量的影響。

（2）干燥方式單因素試驗。各稱取辣木鮮葉100 g，分別用鼓風50 ℃烘干、鼓風60 ℃烘干、鼓風80 ℃烘干、自然陰干（20 ℃）和微波干燥[G70F23N1P-M8（S0），廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司]，每種干燥方式重復2次，干燥之后按方法提取并測定GABA含量，研究干燥方式對辣木GABA含量的影響。

（3）爬坡試驗。在確定處理方式的基礎上，參考GABA茶葉[39]等加工工藝，各以100 g鮮葉，開展真空處理溫度/時間為25 ℃/6 h、30 ℃/12 h、35 ℃/18 h、40 ℃/24 h、45 ℃/30 h、50 ℃/36 h的爬坡實驗。每個處理重復2次。干燥后測定GABA含量，初步研究溫度與時間對辣木GABA含量的影響。

（4）響應面設計?；谂榔略囼灥幕A，根據(jù)中心復合原理，利用JMP 10.0軟件以GABA的生成量（Y）為響應值，溫度（X1，40～50 ℃）和時間（X2，24～36 h）為因子水平，中心點數(shù)為2個，重復次數(shù)為1次，進行響應曲面中心復合設計。每個實驗處理重復2次，按方法干燥、提取測定樣品的GABA含量。以真空處理溫度、時間為考察因素，以辣木中GABA含量為指標進行曲面三維圖的繪制，預測最佳處理溫度、時間及GABA含量。并根據(jù)預測條件重復2次實驗，測定含量，驗證響面優(yōu)化加工工藝。

1.2.3 辣木GABA含量測定

（1）色譜條件。采用自動進樣器進行OPA柱前在線衍生，衍生程序為抽取硼酸緩沖液5.0 μL，抽取衍生試劑（OPA）0.2 μL，洗針，抽取1.0 μL標液或樣品，混合9次后進樣。流動相A為25 μmoL無水乙酸鈉、0.018%三乙胺、0.3%四氫呋喃，pH7.2；流動相B為40%乙腈、40%甲醇和0.1%冰醋酸。洗脫梯度程序：0～1 min，B液從5%線性梯度增加至15%；1～11 min，B液從15%線性梯度增加至18%；11～25 min，B液從18%線性梯度增加至60%；25～27 min，B液由60%線性梯度增加至100%B；27～31.5 min，B液保持在100%；31.5～31.9 min，B液由100%降低至5%；32 min程序停止；以5% B液后運行平衡6 min；流速為0.5 mL/min。柱溫為40 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每一樣品提取2次，每個提取液測定2次，以mean±SD表示平均值。實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間采用最小顯著差數(shù)法進行兩兩比較，p<0.05為差異顯著。所有的統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)處理應用軟件IBM spss statistics 22（SPSS Inc.， Chicago， IL）進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA辣木茶加工工藝優(yōu)化

2.1.1 富集方式的優(yōu)化 應用HPLC測定3種方式處理的辣木樣品的GABA含量，均值與方差分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，真空處理加工的辣木GABA含量顯著高于其他處理（p<0.05）。因此，本研究后續(xù)試驗對辣木的富集方式均采用真空處理。

2.1.2 干燥方式的優(yōu)化 按方法進行干燥方式單因素實驗，應用HPLC測定5種干燥方式的辣木樣品GABA的含量，部分測定色譜圖見圖2。GABA保留時間為22.373 min，且與其他氨基酸基線分離。各干燥方式樣品的平均值與比較結(jié)果見圖3。由圖3可知，自然干燥和50 ℃干燥的辣木GABA含量無顯著差異（p>0.05），但是二者的含量顯著高于其他處理方式（p<0.05）。自然干燥耗時長、易受天氣制約、不易控制，故本研究的后續(xù)實驗中選擇50 ℃鼓風烘干。

2.1.3 最陡爬坡試驗結(jié)果 各辣木樣品中GABA含量，均值與方差分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，在溫度40～45 ℃和時間24～30 h范圍，GABA含量隨溫度升高和時間增加而升高。在溫度/時間為45 ℃/30 h時達到拐點；在溫度/時間為45～50 ℃和30～36 h范圍內(nèi)，GABA含量隨著溫度升高和時間增加而緩慢降低。因此，通過最陡爬坡試驗確定了后續(xù)實驗中，真空處理的溫度為40～50 ℃，時間為24～36 h。

2.1.4 響應曲面試驗結(jié)果 按方法進行響應面實驗設計處理，測定各處理辣木樣品GABA含量，結(jié)果見表1。對表1中GABA實測值的數(shù)據(jù)用最小二乘法擬合的二次多項方程，進行多元回歸擬合，獲得Y對處理溫度（X1）和處理時間（X2）的二次多項回歸方程：

Y=19.51-0.073×[（X1-45）/5]+1.45×[（X2-30）/6]-0.63×[（X1-45）/5]×[（X2-30）/6]-4.64×[（X1-45）/5]2-0.84×[（X2-30）/6]2，式中Y為預測響應值。

應用F檢驗檢測響應曲面設計的多元回歸方程及失擬顯著性檢驗兩者的有效性。從響應面回歸方程的方差與均值分析，F(xiàn)>0.01（5，14）、p<0.01，F(xiàn)極顯著。F檢驗結(jié)果表明該響應面模擬效果顯著，其矯正決定系數(shù)R2=0.97，表示此模型可以解釋97%的GABA總變異。

2.1.5 響應面兩因素交互作用分析 通過JMP 10.0軟件分析溫度和時間對辣木樣品中GABA含量的影響，并繪制交互作用圖（圖5）和響應曲面圖（圖6）。由圖5、6可知，真空處理的時間和溫度2個因素間的交互作用極顯著。隨著溫度的升高，辣木樣品GABA含量逐漸增加，且在真空處理時間33.43 h、溫度44.69 ℃時達到最大值為20.23 mg/g，隨后緩慢減少。即真空處理的時間34.43 h、溫度44.69 ℃，在此條件下辣木茶中GABA富集量為20.23 mg/g。

2.2 模型的優(yōu)化和驗證

應用響應面設計分析得到辣木中GABA的富積最優(yōu)條件為：溫度44.69 ℃、時間34.43 h，辣木中GABA含量可達20.23 mg/g。為了檢驗模型的準確性，分別稱取辣木鮮葉1 000 g，選擇處理溫度45 ℃、處理時間34 h，重復2次，真空處理試驗。測定發(fā)現(xiàn)GABA的平均為（19.70±0.16）mg/g。綜上優(yōu)化發(fā)現(xiàn)辣木中GABA富集的工藝如下：鮮葉45 ℃真空處理34 h，50 ℃鼓風干燥。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)辣木對糖尿病、高血壓、心血管病、肥胖癥、免疫力低下、壞血病、腫瘤等疾病都有顯著的治療作用[40]。由于辣木的保健功能顯著，以及批準成為新資源食品，國內(nèi)辣木食品的開發(fā)如火如荼，如：辣木片劑、辣木綠茶、辣木含片、辣木面包、辣木營養(yǎng)豆腐、辣木營養(yǎng)飲料、辣木保健靈芝等產(chǎn)品，成為補充人體營養(yǎng)、增強免疫力、預防疾病、提高生活品質(zhì)、保證身體健康的產(chǎn)品。隨著健康中國成為國家戰(zhàn)略，具有多種保健功能的辣木和辣木產(chǎn)品將成為大健康產(chǎn)品的重要組成部分，具有廣闊的市場前景。

GABA是一種具有多種生理功能的新資源食品，其在藥品、食品、保健品等領域都具有重要的應用[41]。本研究創(chuàng)新地將2種新資源食品結(jié)合起來，研究加工富含GABA的辣木產(chǎn)品，加工的產(chǎn)品同時具有辣木和GABA的保健功能，因此可能具有廣闊的市場前景。但是加工的富含GABA辣木產(chǎn)品的保健功能需要進一步研究。

GABA廣泛分布于植物中，具有抵抗逆境的功能。一般來講，植物組織中的GABA含量較低，約0.03～2.00 μmoL/g FW，但在不同外界應激條件包括熱擊、機械震動、缺氧、植物激素等刺激后可成倍增加。例如，缺氧條件可使水稻幼苗的GABA含量提高到8 μmol/g FW；大豆葉片的GABA含量在機械刺激、冷擊5 min后，可增加20～40倍，上升到1～2 μmol/g FW[42]。利用植物對外界的應激性原理，可以對植物GABA進行富集，如通過厭氧處理、浸泡處理、紅外線照射、低溫沖擊、葉面噴施等技術處理茶葉鮮葉，加工GABA茶葉[43]。其中厭氧、低溫、真空等以物理方法提高GABA含量，具有工藝簡單、易于后續(xù)處理、天然等優(yōu)點，廣泛應用于茶葉、桑葉等植物材料的GABA加工[44-45]。植物富集法主要通過改變溫度、壓力、時間、研磨和氧濃度等因素增加GABA含量。根據(jù)相關報道，鄒鋒揚等[46]真空處理鐵觀音品種茶樹鮮葉，GABA含量為2.11 mg/g；王芳等[21]真空處理白茶品種茶樹鮮葉，GABA含量為2.41 mg/g；邊偉等[47]采用O2 ∶ CO2 ∶ N2=1 ∶ 1 ∶ 8處理桑葉8 h，GABA含量為2.28 mg/g；何娜等[48]低溫處理結(jié)球甘藍內(nèi)葉，GABA含量為2.41 mg/g；林智等[49]真空處理茶鮮葉，GABA含量為3.33 mg/g；陳慶等[50]真空/氧氣交替處理桑葉，GABA含量為4.48 mg/g；朱云輝等[51]用苦蕎子在黑暗培養(yǎng)箱中發(fā)芽，測定苦蕎子葉GABA的含量為0.23 mg/g。與已有研究相比，本研究首次采用響應面設計的方法對GABA富積工藝中的溫度與時間這兩個關鍵因素進行了優(yōu)化，不僅優(yōu)化的工藝與已有報道不同，且GABA含量達到了19.70 mg/g。

植物體中GABA主要由GABA支路合成和轉(zhuǎn)化：由谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxy-lase， GAD， EC 4.1.1.15）催化谷氨酸脫羧合成GABA，GABA又在GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase， GABA-T， EC2.6.1.19）的作用下和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用形成琥珀酸半醛進入三羧酸循環(huán)[52]。其中GABA 轉(zhuǎn)氨酶在厭氧情況下活性降低，而谷氨酸脫羧酶則在厭氧、有氧的條件下，均有活性。本研究選擇真空處理辣木鮮葉，就是利用厭氧條件下，谷氨酸脫羧酶將谷氨酸脫羧合成GABA，而GABA轉(zhuǎn)氨酶活性降低，促使GABA累積的原理。本研究優(yōu)化的溫度，是辣木谷氨酸脫羧酶的最適反應溫度，優(yōu)化的時間是谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸形成GABA的反應持續(xù)時間，與谷氨酸脫羧酶活性持續(xù)時間以及辣木的谷氨酸含量有關。

本研究應用響應面技術優(yōu)化了辣木GABA富積工藝，研究中發(fā)現(xiàn)原料對產(chǎn)品GABA含量影響顯著。本研究所用材料，分別購置于云南曲靖與廣西南寧，研究中發(fā)現(xiàn)購于云南曲靖的辣木鮮葉，處理后GABA含量低于廣西南寧樣品。推測辣木品種、生長地區(qū)以及時間導致辣木鮮葉GABA以及谷氨酸含量差異，而這種差異決定了富積之后的辣木產(chǎn)品中GABA含量。因此，開展辣木GABA產(chǎn)品加工，首先需要檢測辣木原料的GABA含量，本課題組正在檢測不同產(chǎn)地的辣木GABA含量。

總之，通過干燥方式、富集方式的單因素實驗，最陡爬坡實驗、響應面設計與驗證，本研究建立了以辣木鮮葉為原料，45 ℃真空處理34 h，50 ℃熱風干燥的工藝，該工藝處理的辣木GABA含量達19.70 mg/g左右，為今后開發(fā)高含量的GABA辣木食品提供了理論依據(jù)。

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