張忠武 孫信成 楊友偉 田軍 楊連勇 詹遠華 柏秀芳 劉峰

摘 要 為了使EMS誘變在豇豆育種中發(fā)揮最佳效果，獲得優(yōu)質(zhì)的誘變材料，對豇豆品種‘天暢9號、‘銀豇王進行了3種EMS濃度、3種處理時間的誘導處理，并對當代的種子萌發(fā)、幼苗生長、植株主要農(nóng)藝性狀及生化指標的變化進行研究。結果表明：EMS能導致豇豆種子的發(fā)芽力和生長速率下降，葉片變小，而種子浸出液電導率、幼苗SOD活性及可溶性蛋白質(zhì)含量增加；對銀豇王的葉綠素含量、一級分枝數(shù)、結莢性有增加傾向，而天暢9號表現(xiàn)相反。處理劑量以濃度0.3% EMS、時間3～4 h為宜。

關鍵詞 豇豆；EMS；生長發(fā)育

中圖分類號 S643.4 文獻標識碼 A

Abstract In order to get the best results in the EMS mutagenesis of cowpea breeding and obtain quality mutagenic material， the cowpea varieties of‘Tianchang 9and‘Yin-jiang-wangwere treated under 3 EMS concentrations and 3 treatment time， and the effect of contemporary seed germination， seedling growth， main agronomic characters of plant， and major biochemical indices were studied. The results showed that the germination ability of seeds and growth rate， leaf size decreased， while the conductivity of the leaching liquid， SOD activities and soluble protein content of seeds increased by EMS treatment. The chlorophyll content， the first-class branch number， podding-habit of‘Yin-jiang-wangwere tended to increase， while on the contrary to‘Tianchang 9. The concentration of 0.3% EMS， and treatment time 3-4 h by EMS treatment of cowpea seeds were appropriate.

Key words Vigna unguiculata； EMS； growth and development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.006

化學誘變是一種專一性強、周期短、改良效果明顯的新型育種方法。采用化學誘變劑人為誘導作物發(fā)生突變，能夠產(chǎn)生自然界原來沒有的或一般常規(guī)方法難以獲得的新類型、新性狀、新基因，再通過突變體的多世代篩選和鑒定直接或間接地培育出生產(chǎn)上可以利用的作物新品種[1]。

甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）被認為是一種應用最好的誘變劑，與常規(guī)育種方法相比，具有方法簡便、育種周期短、效果好等特點，在改良作物品種和創(chuàng)造新種質(zhì)方面發(fā)揮著巨大作用，并在作物突變體庫的構架與反向遺傳學等基礎研究中發(fā)揮了重要作用，尤其是與雜交育種技術結合，育種效果更為顯著[2]。在豆類作物中，前人通過EMS處理，先后育成了大豆、四棱豆等新品種[3-5]。

豇豆（Vigna unguiculata L.）作為我國主要蔬菜作物之一，EMS誘變的研究鮮見。本試驗通過不同劑量EMS處理豇豆種子，對種子浸出液電導率、種子萌發(fā)特性、幼苗超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，簡稱SOD）活性、可溶性蛋白質(zhì)含量及植株生長發(fā)育的變化進行研究，明確EMS的誘變效應，找出最佳誘變方法，為建立突變體庫、誘變育種及反向遺傳學等基礎研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以常德市農(nóng)林科學研究院蔬菜研究所生產(chǎn)的‘天暢9號和‘銀豇王為試材?！鞎?號為2015年生產(chǎn)，其莢條為嫩綠色，長度75 cm左右，春季播種至始收60 d左右；‘銀豇王為2014年生產(chǎn)，其莢條為銀白色，長度70 cm左右，春季播種至始收55 d左右。參試材料均保存在-8 ℃冰柜中。

1.2 方法

1.2.1 EMS處理 試驗采用3因素完全隨機設計。因素1為品種（P），即P1為‘天暢9號，P2為‘銀豇王；因素2為濃度（N），設EMS為3個濃度水平，即0.3%（N1）、0.5%（N2）、0.9%（N3）；因素3為誘導時間（H），設誘導時間4 h（H1）、6 h（H2）、8 h（H3）。以清水處理為對照（CK），共計20個處理，3次重復。每處理種子為500粒，方法是用清水浸種4 h（常溫18 ℃左右），再用EMS浸泡，并每隔30 min攪動1次，使誘導劑與種子接觸均勻，處理后用0.1 mol/L Na2S2O3中和20 min，再用流動的自來水漂洗2 h[6]。瀝干水分后用54 cm×28 cm×5.5 cm的72孔塑料穴盤播種，每穴2粒，基質(zhì)為湖南省湘暉農(nóng)業(yè)技術開發(fā)有限公司配制的草炭基質(zhì)，播種環(huán)境為塑料大棚，未作輔助加溫，白天溫度20～22 ℃，夜間溫度18～20 ℃。

1.2.2 大田栽植 播種后10 d移栽至塑料大棚避雨栽培，地面覆蓋銀黑雙面地膜。穴距0.8 m×行距0.4 m，雙株定植，每小區(qū)栽植20株。苗數(shù)不足的小區(qū)以保護行材料補齊密度，統(tǒng)計中按小區(qū)內(nèi)有效單株的平均值補缺進行統(tǒng)計。

1.2.3 電導率的測定 將EMS處理并清水漂洗后的種子，每份取樣20粒，用濾紙吸干水分后，置入小燒杯中，倒入10 mL蒸餾水浸泡，30 min后測定電導率，以空白蒸餾水為對照[7]，電導率儀采用上海雷磁涇儀器有限公司生產(chǎn)的DDS-11A數(shù)顯電導率儀。

1.2.4 種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的測定 各處理在播種后6 d統(tǒng)計發(fā)芽勢，8 d后統(tǒng)計種子發(fā)芽率。以子葉完全出土，且真葉露出子葉為發(fā)芽。相對發(fā)芽率為處理發(fā)芽率與對照的比率[8]，即處理種子發(fā)芽率/對照發(fā)芽率×100%。

1.2.5 半致死劑量的計算 以播種后8 d的相對發(fā)芽率為統(tǒng)計資料，通過Excel 圖表功能，以誘導時間為自變量，相對發(fā)芽率為因變量自動繪制趨勢線，并顯示線性方程、指數(shù)方程及其判定系數(shù)R2，計算相對發(fā)芽率為50%的反函數(shù)，得出半致死劑量的誘導時間[9]。

1.2.6 幼苗SOD活性及可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

播種后9 d，取各處理幼苗葉片0.5 g，提取酶液后進行SOD活性及可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。SOD活性測定采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光還原法[10]，可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[10]。

1.2.7 生長速率的測定 以播種后36 d的植株為統(tǒng)計對象，每處理隨機選取10株，測量植株頂端距地面的垂直距離，取其平均值（L），除以總生長時間（T），計算出播種后36 d內(nèi)的生長速率（R）。

生長速率（R）=總生長量（L）/總生長時間（T）

1.2.8 葉綠素及類胡蘿卜素含量的測定 在植株開花期，剪取主蔓頂端以下的第3片真葉進行測定，取樣時間為16 ： 30，晴天，光照強度32 200 lx，大棚內(nèi)空氣溫度38.1 ℃。測定方法為分光光度法[10]。

葉綠素a的含量（Ca）=12.21×OD663-2.81×OD646

葉綠素b的含量（Cb）=20.13×OD646-5.03×OD663

類胡蘿卜素含量（Cc）=（1 000×OD470-3.27×Ca-104×Cb）/229

相對含量=C處理/CCK×100%

1.2.9 葉片大小測定 以主莖中部的最大復葉片的中間葉長代表葉片大小。在植株開花期，隨機選取10株主莖中部的最大復葉片的中間葉，以刻度直尺測量葉長[11]。通過Excel表格自動運算各種處理下的算術平均值（Average）、標準偏差（Standard deviation），再計算變異系數(shù)CV（Coefficient of Variation）。

變異系數(shù)（CV）=標準偏差/算術平均值×100%。

1.2.10 主蔓一級分枝數(shù)的統(tǒng)計 在豇豆成熟期，主莖上一級分枝，不論結莢與否，分枝以長達2節(jié)以上為準，每小區(qū)選取10株完整植株為觀測對象進行目測計數(shù)[11]。

1.2.11 有效花梗數(shù)的統(tǒng)計 在豇豆成熟期，每小區(qū)選取10株完整植株，目測法統(tǒng)計主莖上結有成熟莢及可食嫩莢的花梗總數(shù)，未能結莢的非正常花梗不作統(tǒng)計。

1.2.12 單株結莢數(shù)的統(tǒng)計 在豇豆成熟期，每小區(qū)選取10株完整植株，目測法統(tǒng)計植株上結莢總數(shù)[11]。

2 結果與分析

2.1 對種子浸出液電導率的影響

由圖1、2可知，豇豆種子通過EMS處理后，種子浸出液的電導率急劇升高。‘銀豇王的電導率峰值時間為處理4 h左右；‘天暢9號出現(xiàn)稍晚，在0.9%濃度下誘導6 h達到峰值，在0.3%和0.5%濃度下則為8 h。

2.2 對種子萌發(fā)的影響

由表1可知，EMS處理對豇豆種子萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用，并隨濃度增加及處理時間的延長，發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈逐漸下降趨勢，其值也都在50%以下，其中‘銀豇王下降幅度更大。從回歸方程看（表2），線性方程的判定系數(shù)R2平均值為0.831 6，而指數(shù)方程的為0.917 5，高于前者，說明指數(shù)方程更能準確描述誘導時間與相對發(fā)芽率之間的函數(shù)關系。運用指數(shù)方程得出半致死劑量的誘導時間，‘天暢9號在0.3%、0.5%、0.9% EMS濃度下，半致死劑量時間分別為4.41、3.63、3.59 h，‘銀豇王在上述3種濃度下分別為2.04、0.84、0.79 h。

2.3 對幼苗SOD活性及蛋白質(zhì)含量的影響

如圖3、4所示，隨著EMS處理時間的延長，豇豆幼苗的SOD活性總體上表現(xiàn)為先降后升，再下降；但兩品種處理組的SOD活性峰值表現(xiàn)不一樣，其中‘銀豇王的SOD活性峰值時間在處理6 h附近，‘天暢9號在8 h左右。幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量有所升高（圖5、6），低劑量下變化不明顯，高劑量下則上升幅度較大。在0.9% EMS誘導8 h下，‘銀豇王的可溶性蛋白質(zhì)含量高出對照29.0%，‘天暢9號高出59.7%。

2.4 對植株生長速率的影響

EMS處理后，出現(xiàn)一些旺長株和矮化株，植株高矮不齊。由圖7、8可知，2個品種在EMS處理后，高濃度下生長速率均有下降表現(xiàn)。‘銀豇王在處理時間低于6 h時，生長速率加快，但處理8 h后速率很快下降。 ‘天暢9號在各種處理下均表現(xiàn)為生長速率下降，其中在0.9% EMS處理4 h后速率下降不明顯，但隨后隨著處理時間的延長，生長速率下降的幅度加大，處理8 h后速率達到最低水平。

2.5 EMS對植株葉片大小的影響

由表3可知，通過EMS處理后，豇豆葉片的變異系數(shù)不大?！y豇王的葉片沒有規(guī)律性變化?！鞎?號則隨濃度的加大略有縮小趨勢，但變異系數(shù)均在9.54%～14.89%之間。

2.6 對植株葉片中葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響

由表4可知，2個品種對EMS的誘變效應各不相同?！y豇王在EMS作用下，葉綠素a和葉綠素b有含量增加的表現(xiàn)，而類胡蘿卜素變化不明顯?！鞎?號通過EMS處理后，葉綠素a和葉綠素b的含量均下降，但類胡蘿卜素卻大幅增加，最大增幅達到48.5%。

2.7 對分枝性的影響

由表5可知，在不同處理下，2個品種的一級分枝數(shù)變化不同?！y豇王在EMS處理下，分枝數(shù)有增多的傾向，劑量越大，分枝數(shù)越多，證明在EMS高劑量處理下植株發(fā)生分枝現(xiàn)象已很普遍?！鞎?號表現(xiàn)相反，分枝數(shù)有減少的傾向，證明EMS處理后一部分植株的分枝已減少甚至不分枝。

2.8 對結莢性能的影響

由表6可知，2個品種在各種處理下，有效花梗的總數(shù)量變化趨勢不同?！y豇王表現(xiàn)為有效花梗數(shù)增加，濃度高、時間長則增幅更大，在0.9% EMS處理8 h下，有效花梗最高達到7.12個/株。而‘天暢9號在EMS處理后有效花梗數(shù)減少，一般在3.44～4.80個/株之間，均低于對照的5.63個/株。在單株結莢數(shù)方面，2個品種的變化趨勢與有效花梗數(shù)相近?！y豇王在EMS處理后結莢數(shù)增多，其中在0.9% EMS處理6 h，單株結莢數(shù)達到9.12條/株，達到最大值?！鞎?號在處理后的單株結莢數(shù)為5.53～6.76條/株，均低于對照的8.90條/株。

3 討論

EMS處理種子后，細胞膜遭受一定程度損害，導致細胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，種子浸出液電導率上升，而且出苗率下降，幼苗的SOD活性升高，本研究結果與前人研究結論一致[12-14]。半致死劑量是衡量敏感性的主要指標，也是誘變育種適宜劑量的參考[15]。本研究中，估算出‘天暢9號在0.3%、0.5%、0.9% EMS濃度下，半致死劑量處理時間分別為4.41 h、3.63 h、3.59 h，‘銀豇王在上述3種濃度下則分別為2.04 h、0.84 h、0.79 h。

EMS處理種子后，幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量在低劑量下變化不明顯，高劑量下有增加的趨勢，與前人的研究結論不同[16]。EMS對生長速率有一定的抑制作用，但低劑量處理對‘銀豇王播種后36 d內(nèi)的生長速率反而有促進作用。另外，EMS對葉綠素及類胡蘿卜素的含量產(chǎn)生一定影響，‘銀豇王的葉綠素a、葉綠素b有含量增加的表現(xiàn)，而類胡蘿卜素變化不明顯?！鞎?號的葉綠素a和葉綠素b的含量均下降，而類胡蘿卜素的含量卻增加。

EMS誘變處理后，化學物質(zhì)擾亂了植物生理活動，會出現(xiàn)一些畸變現(xiàn)象。大豆會產(chǎn)生植株矮化，熟性提早或延遲現(xiàn)象[17]，分枝數(shù)和單株莢數(shù)的變異系數(shù)增大[18]。本研究中發(fā)現(xiàn)，因供試豇豆品種不同而產(chǎn)生結果不一樣，EMS處理后‘銀豇王的分枝數(shù)、有效花梗數(shù)、結莢數(shù)有增多的傾向，而‘天暢9號表現(xiàn)相反。

人工誘導能夠誘發(fā)基因突變，改良植物特性而獲得優(yōu)良突變體，誘導劑量適宜與否是誘變育種成功的關鍵之一。過低劑量則不足以引起突變或突變率低，劑量過高則因嚴重損傷而突變致死，從而掩蓋其他突變，因此，為了獲得更多的變異類型、較高的突變率及足夠的可供選擇的群體，就必須選擇適宜劑量[19]。筆者建議，EMS誘導豇豆種子的適宜劑量控制在濃度0.3%，時間3～4 h。

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