金玉佩 劉佳 紀(jì)若璇 梁宏偉 張麗萍

摘 要 以楸樹體胚發(fā)生過程中不同時期的組織為材料，分析測定體胚發(fā)生過程不同階段的過氧化物酶（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、腺嘌呤核苷三磷酸酶（ATP）、淀粉酶（AMY）、酯酶（EST）這5種酶類的活性，以探討楸樹胚胎發(fā)生過程中的生理生化變化特征。結(jié)果表明：楸樹體胚發(fā)生過程中的不同時期，這5種酶類的活性也會相應(yīng)發(fā)生變化。POD、SOD和EST酶活反應(yīng)在旺盛增殖分化的黃色胚性愈傷組織（YEC）的活性最高，ATP和AMY酶活反應(yīng)在開始萌發(fā)的綠色子葉胚（GCE）中活性最高。在黑色愈傷組織和非胚性愈傷組織中，SOD、AMY和EST酶的活性很低，與此類組織的不能分化及處于生長停滯狀態(tài)具有一定相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 楸樹； 體細(xì)胞胚胎發(fā)生； 酶活測定

中圖分類號 Q418 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In this study， in order to explore the physiological and biochemical changes in the embryogenesis of C. bungei， we analyzed the activities of five enzymes， such as amylase（AMY）， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD）， enzyme adenosine triphosphate（ATP）and esterase（EST）， in different stages of somatic embryogenesis. The results showed that the five kinds of enzyme activities could change in accordingly to different stages on the process of somatic embryogenesis in C. bungei. The POD， SOD and EST enzyme activities were the highest in yellow embryogenic callus which had strong proliferation and differentiation， ATP and AMY enzyme activities were the highest in the green cotyledonary somatic embryo which was germinating. In black callus and non-embryogenic callus， the enzyme activities of SOD， AMY and EST were very low， which were related to the indifferentiation and growth stagnation of these tissues.

Key words Catalpa bungei； somatic embryogenesis； enzyme activity assay

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.011

楸樹（Catalpa bungei C. A. Mey.）屬紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）落葉大喬木，是中國特有的珍貴用材和觀賞樹種。楸樹自然狀態(tài)下自交不親和[1]，自然結(jié)實率低。目前楸樹通常采用嫁接和扦插等方式進(jìn)行無性繁殖，嫁接法繁殖揪樹須培育砧木、嫁接品種接穗，技術(shù)環(huán)節(jié)多，育苗周期長[2]。楸樹扦插有多種因素影響扦插成活率，其中嫩枝扦插有較高的成活率[3]，且有關(guān)扦插的生根機(jī)理還有待進(jìn)一步研究[4]。在幾位學(xué)者的研究下已經(jīng)建立楸樹組織再生體系。體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有快速、高增殖率及高再生率等優(yōu)點，能使楸樹新品種快速繁殖。

目前，許多裸子植物和被子植物都通過體細(xì)胞胚途徑獲得了再生植株，國內(nèi)外有關(guān)體細(xì)胞胚發(fā)生的研究日益增多。在國內(nèi)，關(guān)于植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展比較緩慢，尤其是關(guān)于胚胎相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控、人工種子制備以及體細(xì)胞胚胎的生產(chǎn)應(yīng)用方面的研究較國際上先進(jìn)水平落后很多[5]。國內(nèi)研究較多梓屬植物有花楸、滇楸、楸樹等，目前都已建立了組培再生體系。其中研究了滇楸體胚發(fā)生過程中細(xì)胞生物學(xué)和特異蛋白[6]，花楸種子生物學(xué)和體細(xì)胞胚再生體系的建立[5]。甚少關(guān)于體胚發(fā)生過程中關(guān)鍵酶活性的研究，而有關(guān)楸樹在體胚發(fā)生過程中各酶類的活性變化還未見報道。

本試驗通過對楸樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中不同發(fā)育階段組織材料的代謝相關(guān)酶類（過氧化物酶、超氧化物歧化酶、腺嘌呤核苷三磷酸酶、淀粉酶和酯酶）的活性測定和分析，有助于在生理生化水平上研究楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

以6月底至7月初楸樹未成熟合子胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，獲得的初代愈傷組織是非胚性愈傷組織，為膨大松散的淡黃綠色無定型組織團(tuán)，繼代培養(yǎng)增殖后轉(zhuǎn)變?yōu)闊o明顯變化；以初代愈傷組織誘導(dǎo)胚性愈傷組織，在體胚分化誘導(dǎo)過程中最先出現(xiàn)的是黑色愈傷組織，繼而在黑色愈傷組織上分化產(chǎn)生淡黃色胚性愈傷組織，為緊實細(xì)膩的淡黃色顆粒狀組織團(tuán)。繼續(xù)培養(yǎng)黃色胚性愈傷組織，會出現(xiàn)分化產(chǎn)生白色子葉胚，繼續(xù)分化產(chǎn)生綠色子葉胚（圖1）。

多次繼代培養(yǎng)后挑取非胚性愈傷組織（Non-embryogenic callus， NC）、黑色愈傷組織（Black callus， BC）、黃色胚性愈傷組織（Yellow embryogenic callus， YEC）、白色子葉胚（White cotyledon embryo， WCE）和綠色子葉胚（Green cotyledon embryo， GCE）各1 g，錫紙包裹過液氮中速凍后置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 粗酶液提取 分別取-80 ℃保存的非胚性愈傷組織材料和不同發(fā)育時期的胚性愈傷組織材料各1.0 g，加入聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone，PVPP）0.2 g，邊加液氮邊進(jìn)行研磨，研磨成粉后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）5.0 mL（pH7.8，使用前預(yù)冷），繼續(xù)研磨成勻漿后，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液重復(fù)上述步驟，取上清液即為酶提取液，分裝于200 μL離心管中，用于酶活性測定分析。

1.2.2 酶活測定 過氧化物酶活性的測定：采用創(chuàng)愈木酚法[7]測定POD酶活性；超氧化物岐化酶活性測定：以SOD對NBT光化還原的抑制作用來定量測定SOD酶活性[8]；腺嘌呤核苷三磷酸酶活性測定：通過酶促反應(yīng)所釋放的無機(jī)磷的量[9]來測定ATP酶活性；淀粉酶活性測定：參照李雯等[10]改進(jìn)的用淀粉酶分解麥芽糖的方法來測定AMY酶活性；酯酶活性測定：分解醋酸-α-萘酯的方法[11]來測定EST酶活性；使用美國Thermo紫外可見光分光光度計Evolution 220測定不同發(fā)育階段的各酶類的活性，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果用Microsoft excel 2010軟件進(jìn)行處理，生成圖表并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段的過氧化物酶活性變化

由圖2可以看出，各組織中過氧化物酶活性由高到低依次為：黃色胚性愈傷組織、黑色愈傷組織、綠色子葉胚、非胚性愈傷組織和白色子葉胚。黃色胚性愈傷組織在幾種組織中的過氧化物酶活性最高，達(dá)到15.64 U/（g·min），表明在黃色胚性愈傷組織中存在旺盛的POD酶生理生化代謝過程，以利于體細(xì)胞胚胎的分化發(fā)生。白色子葉胚時期為體細(xì)胞胚發(fā)育成熟階段，其過氧化酶活性最低，僅為6.78 U/（g·min），說明在萌發(fā)之前處于較低的POD生理生化代謝狀態(tài)下，與成熟種子胚的狀態(tài)相類似。

2.2 不同發(fā)育階段的超氧化物歧化酶活性變化

由圖3可以直觀地觀察到各發(fā)育時期的組織中超氧化物歧化酶活性由高到低依次為：黃色胚性愈傷組織、綠色子葉胚、白色子葉胚、非胚性愈傷組織和黑色愈傷組織。SOD是植物細(xì)胞中清除活性氧第一個發(fā)揮作用的酶。黃色胚性愈傷組織中存在活躍的生長分化過程，分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎，故其細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝反應(yīng)旺盛，高活性的SOD酶有助于清除快速細(xì)胞生長分裂過程中產(chǎn)生的活性氧自由基，故其組織內(nèi)SOD酶活性最高，達(dá)到11.11 U/g；黑色愈傷組織是黃色胚性愈傷組織的上一發(fā)育階段，其生長緩慢近乎停滯，因而SOD酶活性最低，僅為1.98 U/g。白色子葉胚與綠色子葉胚時期中SOD酶活性較為穩(wěn)定，無明顯變化。

2.3 不同發(fā)育階段的腺嘌呤核苷三磷酸酶活性變化

由圖4可以觀察到各發(fā)育時期組織中腺嘌呤核苷三磷酸酶活性由高到低依次為：綠色子葉胚、白色子葉胚、黑色愈傷組織、黃色胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。ATP酶活性越高，能夠為細(xì)胞生長分化發(fā)生提供的能量越多。非胚性愈傷組織主要由含有大液泡的薄壁細(xì)胞構(gòu)成，幾乎不具有分化再生能力，僅僅維持增殖，其組織細(xì)胞內(nèi)ATP酶生理生化反應(yīng)是最低的。黑色胚性愈傷組織是黃色胚性愈傷組織的前體階段，向胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變過程中需要耗能巨大，其酶活達(dá)到197.83 μmol/（g·min），為非胚性愈傷組織的2.14倍；而綠色子葉胚是白色子葉體胚開始萌發(fā)成苗的階段，綠色子葉胚進(jìn)一步發(fā)育即可形成完整小植株，其細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝最活躍，酶活性為218.67 μmol/（g·min），因此組織內(nèi)ATP酶的生理生化活性最高。

2.4 不同發(fā)育階段的淀粉酶活性變化

由圖5可以明顯看到淀粉酶活性由高到低依次為：綠色子葉胚、非胚性愈傷組織、黑色愈傷組織、白色子葉胚和黃色胚性愈傷組織。淀粉酶用于水解淀粉麥芽糖，并進(jìn)一步水解為葡萄糖后進(jìn)入糖酵解供給能量，在萌發(fā)的種子中活力最強(qiáng)。綠色子葉胚是正在萌發(fā)的體胚，其組織細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝旺盛，酶活達(dá)到16.48 mg/（g·min），不斷地降解淀粉為其生長發(fā)育提供大量能量，故其淀粉酶活性最高。在其他體胚發(fā)育階段的淀粉酶活性變化差異不大。

2.5 不同發(fā)育階段的酯酶活性變化

由圖6可以明顯觀察到酯酶活性在不同組織中差異較大。酯酶活性由高到低依次為：黃色胚性愈傷組織、白色子葉胚、綠色子葉胚、黑色愈傷組織和非胚性愈傷組織。酯酶能夠催化水解脂肪酸族和芳香族酯類化合物，參與組織細(xì)胞內(nèi)相對較為活躍的各類生理反應(yīng)。黃色胚性愈傷組織在培養(yǎng)過程中不斷分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎，其細(xì)胞內(nèi)各類代謝反應(yīng)活躍，其EST酶活性達(dá)到74.53 U/（g·s），因此其組織細(xì)胞內(nèi)酯酶活性最高。非胚性愈傷組織與黑色愈傷組織酯酶活性較接近且較低，說明其組織細(xì)胞內(nèi)各類生理反應(yīng)相對不活躍，這與其不能分化及處于生長停滯狀態(tài)相對應(yīng)。

3 討論

楸樹胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織及其他發(fā)育階段在形態(tài)上存在明顯的差異，其中的各類酶活性水平也存在明顯的差異。本試驗發(fā)現(xiàn)POD、SOD和EST在黃色愈傷組織中活性最高。SOD與POD酶相互協(xié)調(diào)配合，清除植物代謝旺盛和逆境脅迫下產(chǎn)生的過剩自由基[12-13]。2種酶作用相互協(xié)調(diào)正如本實驗中這2種酶活性變化趨勢相似，黃色愈傷組織期間兩酶活性最高與其活躍的生長分化旺盛狀態(tài)相符合。白色到綠色子葉胚階段POD酶活性上升與其他學(xué)者研究的滇楸[14]和花楸[15]體胚發(fā)生中POD酶活性在子葉胚時期后上升的趨勢一致。EST能夠催化蛋白質(zhì)的去磷酸化，催化細(xì)胞信號物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化[16]，能夠水解非生理存在的酯類化合物，因此對植物可能有去毒的功能[17]。本試驗EST酶活性在黃色愈傷組織中最高，與鐵皮石斛球形胚和心形胚時期的酯酶同工酶[18]出現(xiàn)特異條帶相印證。故而黃色愈傷組織內(nèi)各類生理反應(yīng)與其他階段比相對較活躍，且進(jìn)一步說明有相對較強(qiáng)的代謝過程和抗逆性。

ATP酶和淀粉酶在綠色子葉胚中活性最強(qiáng)。隨著胚性細(xì)胞后期細(xì)胞壁的加厚，ATP酶活性沉積物出現(xiàn)，為胚性細(xì)胞的分裂和發(fā)育提供能量[19]。因此綠色子葉胚作為體胚萌發(fā)的初始階段，其ATP酶活性是最強(qiáng)的。在雜交鵝掌楸的研究中發(fā)現(xiàn)胚性細(xì)胞早期和后期ATP酶活性高[20]，這與本試驗中黑色愈傷組織分化到綠色子葉胚發(fā)育的ATP酶活性高相符合。沉積于胚乳組織淀粉粒邊緣的淀粉酶與其細(xì)胞生理學(xué)功能緊密聯(lián)系，能催化淀粉水解為種子萌發(fā)提供能量[21]。因此，綠色子葉胚淀粉酶活性最高，其生理學(xué)功能與種子相同。本試驗的綠色子葉胚發(fā)育與任鶯[22]文章中Ⅰ型綠色愈傷組織一致，其淀粉酶活性高與細(xì)胞學(xué)觀察到淀粉粒豐富一致。

酶活性的分布和定位變化，從一個側(cè)面反映了胚性細(xì)胞在分化和發(fā)育過程中的生理和代謝狀態(tài)[15]。如上述，EST、POD和SOD 3種酶的活性強(qiáng)弱可作為鑒定楸樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中特定時期的生化參考標(biāo)記。

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