閆洪波 李桂琴 宋亞偉 孟鈺玉 王云松 關(guān)軍鋒

摘 要 薔薇科植物中有多種具有重要價值的水果，如蘋果、梨、桃、草莓和黑樹莓等。這些水果普遍容易發(fā)生由多酚氧化酶（PPO）介導(dǎo)的酶促褐變而導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失，從全基因組角度分析比較PPO基因家族，有助于加深對PPO基因家族和功能的認(rèn)識。 采用比較基因組學(xué)的方法，對這5種植物的PPO基因家族進(jìn)行了基因鑒定、染色體定位、編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、內(nèi)含子統(tǒng)計分析、基因系統(tǒng)進(jìn)化、基因倍增與丟失等特征分析。從這5種植物中，共計鑒定出了42個PPO基因，其中6個基因被認(rèn)定是假基因；絕大多數(shù)基因編碼的蛋白定位于葉綠體，2個定位于線粒體，3個是分泌型蛋白；PPO基因在染色體上有串聯(lián)重復(fù)和散布兩種形式；9個基因具有內(nèi)含子，聚類結(jié)果顯示可以將它們分為6個類型，每個基因類型在進(jìn)化過程中都發(fā)生過基因倍增和丟失；同型基因內(nèi)含子的位置和大小具有相似性。這些結(jié)果揭示薔薇科植物PPO基因內(nèi)含子是伴隨著基因倍增產(chǎn)生的，基因倍增也是推動PPO基因多樣化的重要動力，PPO基因倍增和丟失差異導(dǎo)致PPO基因數(shù)量在不同物種之間產(chǎn)生差異。

關(guān)鍵詞 薔薇科；多酚氧化酶；基因倍增；基因進(jìn)化

中圖分類號 S661；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstarct There are many important fruit plants such as apple， pear， strawberry， blackberry， peach in Rosaceae. They were liable to occurrence enzymatic browning caused by polyphenol oxidase， which result in lots of economics loss. For further analysis PPO， PPO genes were compared by genomic level among five Rosaceae plants. PPO genes were identified and those genes were anchored in chromosome， encoding proteins subcellular location， intron characters， gene duplication and loss， gene phylogeny were analyzed using comparative genomic methods. From five the plants， 42 genes were identified， of which six genes were deduced pseudogenes， 31 genes encoding proteins were located in chloroplast， two were located in mitochondria， three were secretory protein. PPO genes were anchored with tandem repeat or scatter. Phylogenetic trees showed that all these PPO genes could be classed into six types， and genes duplication and loss was occurred for each type in history. There were nine intron-PPO genes and the position and length of intron from the same type PPO gene were similar. In conclusion， the appear of PPO genes intron was an accompany to gene duplication， and PPO genes polymorphism was also caused by gene duplication. The main reason of PPO genes copy variation is gene duplication and loss with plant evolution in Rosaceae.

Key words rosaceae； polyphenol oxidase； gene duplication； gene evolution

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.021

薔薇科植物中有很多重要栽培果樹，如蘋果（Malus domestica）、梨（Pyrus communis）、草莓（Fragaria ananassa）、桃（Prunus persica）和黑樹莓（Rubus occidentalis）等，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，市場需求量大。然而這些果樹產(chǎn)生的果實在貯藏和運輸過程中容易發(fā)生褐變反應(yīng)，對其外觀、風(fēng)味、營養(yǎng)和加工性能帶來不良影響，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

大量研究認(rèn)為，褐變現(xiàn)象發(fā)生的主要原因是多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）介導(dǎo)的酶促反應(yīng)[2-3]。PPO蛋白屬于核編碼含銅金屬酶類，可分為兩大類，即單酚氧化酶（Monophenol oxidase，又稱酪氨酸酶，Tyrosinase EC1. 14. 18. 1）、雙酚氧化酶（Diphenol oxidase，又稱兒茶酚氧化酶，Catechol oxidase EC.1.10.3.1）[4]。PPO蛋白前體一般由N-端導(dǎo)肽（Transit peptide）、N-端催化結(jié)構(gòu)域、PPO1_DWL結(jié)構(gòu)域、PPO1_KFDV結(jié)構(gòu)域幾部分組成[5-6]。PPO除可以造成褐變外，還與病害、昆蟲或機(jī)械傷害引起的防衛(wèi)反應(yīng)密切相關(guān)。PPO基因抗病機(jī)制主要是PPO蛋白參與植物次生代謝，產(chǎn)生的某些物質(zhì)可以直接毒殺病原菌。也有研究表明PPO參與某些植物的色素合成途經(jīng)[7-8]。

多酚氧化酶通常由一個小基因家族編碼。PPO 基因目前已經(jīng)從幾十種植物中克隆出來。在番茄中，編碼多酚氧化酶的基因有7個，該基因家族定位于第8號染色體上，并且群集在165 kb區(qū)段；在馬鈴薯中，編碼多酚氧化酶的基因至少有6個；茄子中有11個PPO基因存在[9-11]。

雖然已經(jīng)有薔薇科植物PPO基因的報道，但是尚未見到從比較基因組水平上對PPO基因家族的研究。蘋果、桃、梨、草莓和黑樹莓等薔薇科植物基因組測序已經(jīng)完成[12-16]，因此，本研究通過在全基因組水平上對5種植物的PPO基因家族進(jìn)行基因鑒定、染色體定位、編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、內(nèi)含子統(tǒng)計分析、基因系統(tǒng)進(jìn)化等，目的在于對PPO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的詮釋，同時為PPO的遺傳機(jī)制研究以及抑制褐變育種提供理論基礎(chǔ)

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果、桃、梨、草莓和黑樹莓PPO基因家族成員相關(guān)信息主要來自GDR數(shù)據(jù)庫（https：//www.rosaceae.org）。

1.2 方法

1.2.1 PPO基因家族鑒定 為全面鑒定PPO基因，利用已經(jīng)克隆和鑒定的馬鈴薯、茄子、菠蘿等[9-11，17]PPO基因家族氨基酸序列在（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，然后以保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列作為靶序列，對相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，E值設(shè)為E<10-4，獲得候選基因。將這些候選的蛋白基因序列通過MEGA7.0[18]軟件提供的Clustal W（多序列比對程序）工具進(jìn)行多序列比對，去除重復(fù)的基因，將剩余的候選PPO通過PFAM網(wǎng)站（http：//pfam.Janelia.org/） 預(yù)測這些蛋白是否具有3個完整的植物多酚氧化酶典型結(jié)構(gòu)域。如果存在，即為多酚氧化酶基因家族成員，如果3個結(jié)構(gòu)域不完整則被認(rèn)為是假基因。

1.2.2 基因物理定位和內(nèi)含子確定 根據(jù)PPO基因序列信息比對相應(yīng)的scaffold（BAC）或染色體序列，最終確定每個PPO基因在染色體上相應(yīng)的位置。為確定基因中是否含有內(nèi)含子和內(nèi)含子的位置，用BLASTN方法比對轉(zhuǎn)錄序列和基因組序列來分析基因內(nèi)含子。

1.2.3 PPO蛋白在亞細(xì)胞上定位 通過網(wǎng)絡(luò)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）分析植物多酚氧化酶的氨基酸序列，進(jìn)行葉綠體定位檢測[19]，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TatP/）[20]對葉綠體定位蛋白分析其類囊體定位信號。對于其他非葉綠體定位蛋白，通過網(wǎng)絡(luò)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[21]分析其可能的亞細(xì)胞定位。根據(jù)檢測結(jié)果判定多酚氧化酶在葉綠體、線粒體以及其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的定位，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4 常見PPO序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為揭示這5種植物PPO基因家族成員的保守性以及同源基因（直系同源和旁系同源）的得失，本研究將檢索到的淀粉合酶基因DNA序列用FASTA 格式保存，利用MEGA 7.0軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）進(jìn)行模型篩選后，采用GTR+G+I構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1 000，去除Bootstrap支持率低于50%的節(jié)點，顯示各分支長度。

1.2.5 基因復(fù)制和丟失估算 基因復(fù)制和丟失估算以人工分析和軟件分析相結(jié)合的方法進(jìn)行。人工分析方法如下：在進(jìn)化樹中，每個物種都至少含有1條序列，如果未發(fā)現(xiàn)某個物種的序列，則認(rèn)為該物種丟失了該序列，如果某物種具有2條或2條以上的序列，則認(rèn)為該物種內(nèi)產(chǎn)生了基因復(fù)制。軟件分析使用MEGA7.0進(jìn)行，該軟件主要是通過計算基因-物種進(jìn)化樹來估算基因復(fù)制或者丟失。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種薔薇科植物基因的鑒定

利用上述PPO蛋白N-端催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行TBLASTN和BLASTP搜索及分析，從蘋果、梨、草莓、桃和黑樹莓中鑒定出6種PPO類型共42個PPO基因，每個基因的編號和編碼蛋白特征如表1。從蘋果中鑒定出16個PPO基因，其編碼區(qū)長度在879（MDP0000799783）～1 830 bp（MDP0000234782）之間；從梨中鑒定出8個基因，編碼區(qū)長度分布在1 035（PCP020848）～2 100 bp（PCP020847）之間，桃中共有6個PPO基因，編碼區(qū)長度在1 617（Prupe.4G041800）～1 788 bp（Prupe.4G041900）之間；草莓中分析出6個PPO基因，編碼區(qū)長度范圍在1 761 （mrna30433.1）～1 821 bp（mrna30435.1）之間；黑樹莓則只發(fā)現(xiàn)6個PPO基因，在數(shù)據(jù)庫中只有4個編號，其中Bras_G06469區(qū)段的頭部、中部和尾部分布著3個PPO基因，編碼區(qū)長度在1 683（Bras_G10112）～1 818 bp（Bras_G06469-3）之間。在這5個物種中，PPO分子量變化具有顯著差異，最大分子量達(dá)到79.26 ku（PCP014164），而分子量最小的是MDP000079978，僅為32.51 ku；等電點變化范圍比較小，分布在5.07～7.57之間，具體分布如表1所示。

2.2 假基因鑒定

通過分析完整的植物多酚氧化酶具有的酪氨酸酶的中心域、PPO1_DWL和PPO1_KFDV 3個結(jié)構(gòu)域。鑒定到的42個基因中有6個為假基因（表1），蘋果中有3個，分別是MDP0000226045（酪氨酸酶不完整）、MDP0000298729（酪氨酸酶缺失）和MDP0000799783（酪氨酸酶不完整）；桃中有1個假基因Prupe.4G41800.1（酪氨酸酶不完整）；梨中有2個假基因分別為PCP020848.1（酪氨酸酶超家族前缺失全部180個氨基酸）和PCP020847.1（酪氨酸酶以及PPO1_KFDV超家族不完整）。

2.3 內(nèi)含子統(tǒng)計分析

在蘋果、梨、桃、黑樹莓和草莓編碼多酚氧化酶基因中，有多個基因存在內(nèi)含子（表2）。PPOⅡ型基因在蘋果（MDP0000221498）、梨（PCP020846）和桃（Prupe.4G041900）都含有內(nèi)含子，內(nèi)含子的位置、大小、剪切方式基本一致（圖1，表2）。蘋果中MDP0000500159和MDP0000744636屬于PPOⅤ類型基因，它們內(nèi)含子的位置和大小幾乎完全一致；梨中PPOⅣ型基因PCP020851也含有內(nèi)含子；PPOⅤ類型的PCP020847含有1個3.4 kb長的內(nèi)含子，破壞了該基因結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其成為1個假基因；桃中PPOⅤ型基因Prupe.4G041800也包含有內(nèi)含子；草莓PPOⅥ基因mrna19628基因也包含內(nèi)含子，其它植物同類型基因都未發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子。

2.4 PPO基因的物理定位

根據(jù)42個PPO基因的序列特征將其定位在染色體或框架（scaffold）圖相應(yīng)的物理位置。蘋果PPO基因散布在2、4、5、10號染色體上，PPOⅠ、PPOⅡ與PPOⅢ 3個類型分別只含有1個基因，分別位于10號染色體3.3 M和33 M以及4號染色體4.5 M，PPOⅣ類型有9個基因集中串聯(lián)在一個0.7 M的區(qū)域內(nèi)，位于5號染色體3.8 M和4.5 M之間，PPOⅤ類型有4個基因，其中1個基因位于2號染色體31 M，另外3個集中串聯(lián)在10號染色體28 M的一個55 kb區(qū)域（圖2）。桃中共有6個PPO基因，全部集中連鎖在4號染色體1.9 M附近25 kb的狹窄區(qū)域內(nèi)，6個基因中間未被其他基因區(qū)隔（圖2）。草莓4個PPO基因分布在3號染色體，其中mrna30433.1、mrna30434和mrna30435集中分布在3號染色體2.6 M附近一個10 kb區(qū)域，而且中間沒有被別的基因區(qū)隔，相應(yīng)的黑樹莓中3個 PPO基因分布在其一個共線性BAC片段上（圖2），另一個基因在3號染色體0.9 M附近，也和黑樹莓相應(yīng)基因分布在共線性位置（圖2）。梨中4個基因分布在scaffold 00014，另外4個基因分布在4個不同BAC片段上（圖2）。

2.5 PPO亞細(xì)胞定位

從蘋果、梨、桃、草莓和黑樹莓5個物種共鑒定出36個基因編碼完整PPO，同已知的絕大多數(shù)PPO一樣，這5種植物的31個基因編碼PPO定位在葉綠體中，葉綠體信號肽切割位置保守，31個蛋白葉綠體信號肽在半胱氨酸前切割如圖3的左側(cè)豎線所示，經(jīng)分析這些蛋白都有潛在的類囊體定位信號如圖3右側(cè)豎線所示，說明葉綠體定位PPO蛋白的信號肽切割區(qū)域高度保守。PPO定位在線粒體的報道極少，不過蘋果中MDP0000500159和MDP0000744636編碼的蛋白亞細(xì)胞定位為線粒體。草莓中mrna25268、mrna19628和黑樹莓中Bras_G10112編碼蛋白含有分泌蛋白信號肽。

2.6 多酚氧化酶基因家族進(jìn)化分析

為揭示5種薔薇科植物物種間多酚氧化酶基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，選取非薔薇科植物外源植物馬鈴薯作為對照，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。從圖4可以看出，薔薇科5種植物的PPO基因可以分為6種類型，分別為PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ、PPOⅣ、PPOⅤ、PPOⅥ（圖4）。這6種類型基因中，PPOⅠ型包含7個基因，蘋果、梨、桃各1個，草莓和黑樹莓各2個；PPOⅡ包含3個基因，桃、梨和蘋果上各1個。PPOⅢ型包含4個基因，梨2個，蘋果1個，桃1個。PPOⅣ型包含12個基因，蘋果有6個，黑樹莓和桃各2個，梨和草莓各1個。PPOⅤ型包含7個基因，蘋果4個，草莓、黑樹莓和梨各1個。PPOⅥ型包含3個基因，草莓中2個，黑樹莓中1個。PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ、PPOⅣ、PPOⅤ這5種基因類型均在3種以上薔薇科植物中發(fā)現(xiàn)，而且同型基因之間的氨基酸相似度遠(yuǎn)大于同一物種內(nèi)部不同型號基因之間的相似度，說明它們在薔薇科植物分化之前就已經(jīng)存在了。PPOⅥ雖然只在草莓和黑樹莓中發(fā)現(xiàn)，但是這類基因在聚類時首先和馬鈴薯PPO基因歸為一個類型，說明這類基因在薔薇科植物與其他植物分化之前就存在。

2.7 基因倍增分析

根據(jù)PPO系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)定在薔薇科植物分化以前，就存在6種類型的PPO基因（圖4）。5種植物中PPO基因在薔薇科植物分化以后，都有基因丟失和倍增現(xiàn)象發(fā)生（表3）。PPOⅠ基因在黑樹莓和草莓分化之前，它們的共同祖先與其他薔薇科植物分化以后發(fā)生了1次倍增，而且倍增產(chǎn)物在2個植物中都留存下來，其他3種植物只保留了1個拷貝形式。PPOⅡ基因沒有發(fā)生過倍增，但是在草莓和黑樹莓中發(fā)生了丟失。PPOⅢ基因在草莓和黑樹莓中也發(fā)生了丟失。PPOⅣ基因在薔薇科植物分化后發(fā)生了復(fù)雜的倍增，蘋果和梨分化之前發(fā)生了1次倍增，之后梨丟失其中的1個拷貝，以后蘋果2個類型的PPOⅣ基因又各自倍增2次，桃和黑樹莓在各自進(jìn)化中發(fā)生了1次倍增。PPOⅤ基因在桃中全部丟失，而蘋果在進(jìn)化中發(fā)生了2次倍增。PPOⅥ基因在蘋果、桃和梨中都完全丟失，黑樹莓中發(fā)生了1次倍增。

3 討論

植物PPO基因家族通常由1個小基因家族編碼，番茄多酚氧化酶的基因有7個PPO基因[9]，馬鈴薯中編碼多酚氧化酶的基因至少有6個[10]，白楊中有13個PPO基因[22]。本研究發(fā)現(xiàn)蘋果中有16個PPO基因，梨中有8個PPO基因，桃、草莓和黑樹莓各自有6個PPO基因。蘋果、梨和桃丟失PPOⅥ基因類型，而草莓和黑樹莓則丟失PPOⅡ和PPOⅢ 2種基因類型。而同一基因類型在不同物種之間基因數(shù)量差異也很明顯，蘋果中PPOⅣ基因在染色體上串聯(lián)重復(fù)存在高達(dá)9個，而梨、桃和草莓中只有2個PPOⅣ類型基因，黑樹莓僅1個PPOⅣ基因（圖2），這種差異顯然是PPOⅣ基因在不同物種中倍增差異造成的（表3）。說明5中薔薇科植物PPO基因數(shù)量的差異是PPO基因倍增和丟失差異造成的。

倍增基因命運有DRNNF、SF和DDC等幾種模式[23-25]。蘋果9個PPOⅣ基因中有3個基因成為了假基因，而梨PPOⅣ和PPOⅤ類型基因，分別由一個正?；虬l(fā)揮功能和一個假基因形式存在（表1），這些倍增PPO基因符合DRNNF模式。蘋果PPOⅤ基因經(jīng)過2次倍增形成4個拷貝，它們又分化成2種類型，一種是葉綠體蛋白，另一種是線粒體蛋白，這完全符合倍增基因命運的亞功能化（SF）模式。可見PPO基因倍增進(jìn)化模式差異是造成5種薔薇科植物PPO基因功能多樣化的一個重要原因。

曾經(jīng)一度認(rèn)為植物PPO基因不存在內(nèi)含子，不過本研究所選取的5種薔薇科植物蘋果、梨、桃、黑樹莓和草莓發(fā)現(xiàn)多個基因存在內(nèi)含子（表2、3）。草莓PPOⅥ一對倍增基因mrna19628和mrna25268，前者有內(nèi)含子而后者則沒有（表2、3），說明mrna19628中內(nèi)含子是基因倍增時產(chǎn)生的；蘋果4個PPOⅤ型基因，MDP0000500159和MDP0000744636有內(nèi)含子，它們的內(nèi)含子大小、位置和剪切方式幾乎完全一致，而MDP0000234782和MDP0000709073則沒有內(nèi)含子，而前兩個基因是后兩個倍增的產(chǎn)物，說明這2個內(nèi)含子是在蘋果PPOⅤ基因倍增時產(chǎn)生（表2、3）；梨的PPOⅣ類型一對倍增基因PCP020851和PCP020848，前者有一個115 bp內(nèi)含子而后者沒有，PPOⅤ基因類型的一對倍增基因PCP020847和PCP025388，前者由于包含1個3.4 kb的內(nèi)含子，導(dǎo)致該基因成為假基因，后者也有內(nèi)含子（表2、3）。PPOⅡ型基因在蘋果、梨和桃中都有內(nèi)含子，而且內(nèi)含子的位置、大小、剪切方式基本一致（圖1），從GenBank數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)杏的PPOⅡ型基因也有內(nèi)含子，而且內(nèi)含子的位置、大小、剪切方式與蘋果、梨和桃的也相似。PPOⅡ基因和PPOⅣ由一個祖先基因在薔薇科植物分開前倍增產(chǎn)生的，PPOⅡ型基因內(nèi)含子也是在這個倍增過程中產(chǎn)生的（表2、3）。從這幾種基因獲得內(nèi)含子情況可以看出，這5種薔薇科植物PPO基因內(nèi)含子是伴隨著基因倍增產(chǎn)生的。

總之，筆者比較分析了薔薇科5個物種42個PPO基因的特征，它們可以分成6種基因類型，所有類型都起始于薔薇科植物分化之前，PPO基因數(shù)量在不同物種之間的差異是由PPO基因倍增和丟失差異引起的，薔薇科植物PPO基因內(nèi)含子是伴隨著基因倍增產(chǎn)生的，基因倍增也是推動PPO基因多樣化的重要動力。

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