郭鳳芝 許穎妍 熊青 劉濤 呂恃衡 陳桂信 佘文琴

摘 要 以玳玳花瓣為材料，采用RT-PCR和RACE技術，克隆了玳玳HPL基因cDNA全長，全長為1 776 bp，其中包含52 bp的5′非編碼區(qū)，224 bp的3′非編碼區(qū)，1 500 bp的編碼區(qū)（編碼499個氨基酸，分子量為55.7 ku）。將該HPL基因cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列及所推導的氨基酸序列與其他植物的HPL基因cDNA序列進行比較，推斷玳玳花瓣HPL屬于13-HPL類。通過PCR擴增得到了玳玳HPL基因組全長。測序結果顯示玳玳HPL基因中包含1個長2 374 bp的內(nèi)含子。將分離出來的玳玳HPL基因cDNA的編碼區(qū)序列插入pET-15b載體上構建原核表達載體，在細菌BL21細胞中進行原核表達。結果表明：該編碼區(qū)片段可在原核細胞中大量表達，其表達產(chǎn)物分子量大小約為55 ku，與13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究為下一步利用HPL基因cDNA進行遺傳轉化研究奠定基礎，將為花卉香味的遺傳改良提供一條新途徑。

關鍵詞 玳玳（Citrus aurantium）；脂氫過氧化物裂解酶；cDNA全長；原核表達

中圖分類號 Q785 文獻標識碼 A

Abstract In this research， the full length cDNA of Hydroperoxide lyase（HPL）from Daidai（Citrus aurantium）petals was cloned by RT-PCR and RACE and tried to express this gene in E.coli. The cDNA sequence of Daidai HPL was 1 776 bp long. It contained an ORF encoding 499 amino acid residues（Mw=55.7 ku）， a 5′ untranslated region of 52 bp and a 3′ untranslated region of 224 bp. Daidai HPL was a hydrophilic protein. Compared with HPLs of other plants， this phylogenetic analysis suggested that Daidai HPL was a member of the 13-HPL family. Genomic fragment of Daidai HPL gene was also amplified by using PCR， and subsequent sequencing analysis showed that the Daidai HPL gene contained one intron of 2 374 bp. The Daidai HPL gene cDNA was inserted into the vector pET-15b. The expression construct was transformed into BL21 and was induced. Daidai HPL was expressed at high level in E.coli. SDS-PAGE analysis showed that Daidai HPL was 55 ku， which is approximately the same with the calculated molecular weight 55.7 ku. The research aimed to control the expression of HPL gene and regulate he production of scents in plants， and provide a new approach to the genetic improvement of flower scents.

Key words Daidai（Citrus aurantium）； hydroperoxide lyase； full length cDNA； expression in E.coli.

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.014

玳玳花（Citrus aurautium）又名回青橙、代代，原產(chǎn)中國浙江，屬蕓香科的常綠灌木或小喬木，為酸橙的變種，是重要的木本香花及觀果植物。其花潔白，香氣濃郁，可供窨制花茶、香精提取和入藥。

香味是花卉品質的一個重要組成，近年來，隨著人們生活水平和欣賞品位的提高，花香的遺傳改良開始受到重視。由于花香氣成分、結構及其生物合成過程比較復雜，花香形成機制和遺傳改良的研究進展緩慢。前人研究認為，產(chǎn)生花香的物質通常有萜類、醛類和醇類等。劉廷禮等[1]對玳玳花的香氣物質成分進行了研究，結果表明，癸醛、壬醛、芳樟醇、牻牛兒醇等為玳玳花香味物質的重要成分。

在植物體中許多醛類和醇類香味物質或其主要合成前體主要來源于植物體中的脂氧化途徑。脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是脂氧化途徑中的一個關鍵酶，能催化脂氫過氧化物裂解生成短鏈醛（醇）。這些揮發(fā)性短鏈醛（醇）具有芬芳氣味，是許多植物特異氣味的主要成分或前體[2]。隨著生化技術分析技術的進步，在香味物質的組成及其生物合成途徑、香味形成過程中關鍵酶的純化等方面取得了可喜的進展，目前己經(jīng)從西瓜幼苗[3]、大豆幼苗[4]、茶葉[5]、向日葵子葉下胚軸[6]、橄欖果實[7]、黃瓜[8]、番茄果實[9]等植物器官中純化了HPL。近年來，PCR技術、cDNA文庫構建與篩選、RACE技術等分子生物學技術在植物上廣泛應用，Matsui等[10]在進行HPL生理生化研究的基礎上，首先從甜椒葉片和果實中克隆了HPL基因的cDNA全長，此后，擬南芥[11-12]、番茄[13]、紫花苜蓿[14]、黃瓜[15]、番石榴[16]、甜瓜[17]、馬鈴薯[18-19]、西瓜[20]、杏[21]、水稻[22]等植物的HPL基因cDNA全長相繼被克隆。

本研究以玳玳花瓣為材料，采用RT-PCR和RACE等分子生物學技術，分離玳玳HPL基因cDNA全長，并對其原核表達和基因組序列進行研究，為今后的HPL遺傳轉化研究提供基礎，能夠通過分子手段增強或削弱的香氣，為花卉香味的遺傳改良提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株玳玳種植在福建農(nóng)林大學?；ㄆ詢?nèi)，將即將開放的玳玳花蕾，裝入鋁箔袋中并作好標記，液氮速凍后帶回實驗室， 立即貯藏于-80 ℃冰箱備用。

cDNA第一鏈合成試劑盒（RevertAIDTM M-First Strand cDNA Synthesis Kit）、3′RACE試劑盒（3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends）和5′RACE試劑盒（5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends）購于Invitrogen公司；3S柱離心式PCR產(chǎn)物小量快速純化試劑盒購于申能博采生物科技有限公司；DNA片段快速純化/回收試劑盒（DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit）購于北京鼎國生物技術有限責任公司；TaKaRa LA TaqTM、TaKaRa Ex TaqTM、T4-DNA連接酶、Marker DL 2000、限制性核酸內(nèi)切酶等購于TakaRa生物工程（大連）有限公司；Taq DNA polymerase（5.0 U/μL）、RNase A等購于北京天為時代科技有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購于天為時代科技有限公司，pGEM-T-Easy載體購于Promega公司，轉化受體菌為大腸桿菌DH5α菌株和BL21（DE3）plyss菌株，表達載體為pET-15b。

1.2 方法

1.2.1 玳玳HPL基因cDNA全長及基因組全長擴增

采用CTAB法提取玳玳花瓣總RNA，SDS法提取玳玳花瓣總DNA，采用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳對總 RNA、總DNA的質量與含量進行檢測。參照甜椒、擬南芥、番茄、紫花苜蓿、番石榴、馬鈴薯、甜橙等的HPL基因的核苷酸序列設計2對保守區(qū)引物（CF1、CR1和CF2、CR2）（表1）。參照cDNA第一鏈合成試劑盒（RevertAIDTM M-First Strand cDNA Synthesis Kit）對玳玳HPL基因cDNA保守區(qū)進行擴增，根據(jù)保守區(qū)cDNA的測序結果和5′RACE試劑盒及3′RACE試劑盒的使用說明書的要求，設計5′RACE逆轉錄引物（5D-GSP0）及5′RACE下游引物（5D-GSP1和5D-GSP2）與3′RACE上游引物（3D-GSP3和3D-GSP4）（表1），引物序列均委托上海博亞生物技術有限公司合成。

玳玳cDNA全長擴增：以玳玳cDNA為模板進行PCR擴增，反應總體系為50 μL，其中包括ddH2O 39.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55～64 ℃（根據(jù)引物Tm值確定）30 s，72 ℃ 1～4 min（根據(jù)擴增片段決定），30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

玳玳HPL基因組全長擴增：反應體系同玳玳cDNA全長擴增，反應條件為：94 ℃ 5 min進行熱啟動；94 ℃ 25 s，68 ℃ 4 min，5個循環(huán)；94 ℃ 25 s，65 ℃ 4 min，10個循環(huán)；94 ℃ 25 s，62 ℃ 4 min，20個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物連接到pEG-T-Easy Vector載體上，化學轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，菌液PCR檢測，篩選陽性克隆，將擴增出目的條帶的樣品菌液送到上海博亞生物技術有限公司進行序列測定。利用NCBI網(wǎng)站、DNAMAN軟件對測序序列進行分析與拼接，得到了玳玳HPL基因cDNA、基因組全長序列。

1.2.2 玳玳HPL基因生物信息學分析 對所獲得的玳玳HPL基因全長進行生物信息學分析，利用Blast 進行核苷酸序列同源性分析，采用DNAMAN進行蛋白質理化性質分析，并利用DNAMAN軟件，將玳玳與其他已經(jīng)登錄的18種植物的HPL氨基酸序列作多重比對，并繪制進化樹。

1.2.3 玳玳HPL基因的原核表達 根據(jù)測序結果，設計基因編碼區(qū)兩端的特異引物：上游引物（HPL-S1）和下游引物（HPL-S2）（表1），委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系為50 μL，其中包括ddH2O 38.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L Dntp 1 μL，HPL-S1（10 mmol/L） 2 μL，HPL-S2（10 mmol/L）2 μL，cDNA 1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物確定為HPL基因，連接克隆到pGEM-T Easy Vector中，化學轉化DH5α菌株，進行菌液PCR篩選陽性克隆，陽性菌落提取質粒并進行雙酶切檢測，確認獲得重組表達質粒pGEM-T Easy-HPL。將重組表達質粒轉化BL21 plyss感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行菌液PCR及重組質粒酶切驗證，將陽性菌液按1%的量加入含有Amp的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃ 220 r/min，搖培至菌液OD600達0.4～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃ 220 r/min，搖培4～12 h，每隔2 h取樣1次，10 000 r/min離心1 min，收集菌體，1×SDS Loading Buffer重懸菌體，沸水煮5 min，冰上冷卻，離心，取上清進行SDS-PAGE分析。

2 結果與分析

2.1 玳玳HPL基因cDNA全長序列的獲得與分析

從圖1可看出，玳玳花瓣總RNA質量較好，28S、18S的帶型整齊清楚，且28S的帶比18S的帶更亮（28S rRNA的亮度大約是18S rRNA的2倍），說明提取的總RNA較完整，未發(fā)生降解。分光光度計檢測結果顯示，OD260/OD280=1.98，說明樣品中沒有蛋白質和酚類的污染；OD260/230=2.03，說明RNA樣品中也沒有其他小分子物質的污染。利用DNAMAN分析軟件將保守區(qū)cDNA、3′RACE和5′RACE（圖2）得到的核苷酸序列進行拼接，得到了玳玳HPL基因cDNA全長序列，玳玳HPL基因cDNA全長為1 776 bp（在GenBank中的登錄號為DQ866816），其中開放閱讀框為1 500 bp（圖2），編碼499個氨基酸，分子量為55.7 ku，5′非編碼區(qū)為52 bp，3′非編碼區(qū)為224 bp。

2.2 玳玳HPL基因組全長序列的獲得與分析

以玳玳總DNA為模板，用HPL-S1和HPL-S2作為上、下游引物進行PCR擴增反應，得到一條約4 000 bp大小的特異片段（圖3），將該PCR產(chǎn)物進行回收，經(jīng)過連接、轉化、藍白斑篩選和質粒PCR鑒定，獲得含重組質粒的陽性菌落。將重組質粒進行測序，結果見圖4。分析測序結果表明，擴增到的玳玳HPL基因組序列長為4 093 bp，將其與玳玳HPL基因cDNA全長進行序列比對，結果發(fā)現(xiàn)此序列包含1個內(nèi)含子，長為2 374 bp。內(nèi)含子兩端有AGGT……AGGT的剪切信號序列。編碼區(qū)序列存在15個點突變，7個會造成氨基酸的改變，但沒有移碼和無意突變（即變成終止子的突變）。

2.3 玳玳HPL基因生物信息學分析

2.3.1 玳玳HPL基因同源性和進化樹分析 將玳玳HPL基因cDNA的全長序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，結果表明，該序列與黃瓜和甜瓜HPL基因cDNA的同源性最低，分別為33.3%和33.2%，而與甜橙和粗檸檬HPL基因cDNA的同源性最高，分別為99%和98%，表明所克隆的基因為HPL基因。

將玳玳與其他已經(jīng)登錄的18種植物的HPL氨基酸序列作多重比對，并繪制進化樹（圖5）。結果顯示，植物的HPL基本上聚為兩大類：13-HPL（玳玳、粗檸檬、甜橙、紫花苜蓿、番茄、馬鈴薯、甜椒、煙草、番石榴、黃瓜2、擬南芥、香蕉、大麥）和9-HPL（杏）、9/13-HPL（甜瓜、黃瓜AF229811、截形苜蓿、截形苜蓿2）。兩大聚類中又分為許多小聚類，基本上是同物種或物種親緣關系近的HPL序列一致性較高；物種親緣關系遠的序列一致性較低。玳玳、粗檸檬和甜橙3種植物同屬于蕓香科柑橘屬，親緣關系近，因此其序列一致性非常高（達98%）。

2.3.2 玳玳HPL基因cDNA全長編碼產(chǎn)物的保守結構域及氨基酸組成分析 利用DNAMAN軟件分析玳玳HPL基因cDNA全長編碼產(chǎn)物，從氨基酸的組成看，20種氨基酸都有出現(xiàn)，以絲氨酸出現(xiàn)次數(shù)最多（54次），其次為亮氨酸（51次），色氨酸和組氨酸出現(xiàn)次數(shù)最少（僅出現(xiàn)6次）。從氨基酸的類型看，非極性氨基酸有8種，共出現(xiàn)247次，占總數(shù)（499）的49.5%；不帶電荷的極性氨基酸有7種，出現(xiàn)140次，占總數(shù)的28.1%；堿性氨基酸有3種，出現(xiàn)56次，占總數(shù)的11.2%；酸性氨基酸出現(xiàn)56次，占總數(shù)的11.2%?？偟膩碚f，極性氨基酸總數(shù)為252，超過非極性氨基酸總數(shù)為247。為了確定HPL基因cDNA編碼產(chǎn)物的親水或疏水性，對其進行親水性分析（圖6），由此推測，玳玳花瓣HPL基因cDNA的編碼產(chǎn)物為親水性多肽。

HPL屬于細胞色素P450（CytP450）蛋白質家族，將玳玳HPL的4個保守序列區(qū)與其他植物的進行多重比對（圖7），結果發(fā)現(xiàn)，4個結構域中的一些序列在整個HPL家族中相當保守。如結構域A中的Phe-X-X-Gly-Phe-Asn-X-X-Gly-Gly，結構域B中的Leu-X-X-Ser-X-Val-X-Glu-X-Leu-Arg-X-X-Pro-Pro，結構域C中的Phe-XXX-Arg，結構域D中Pro-X-X-X-Asn-Lys-Gln-Cys-Ala/Pro-Gly/Ala-Lys-Asp/Asn-X-Val結構。但玳玳的HPL也存在其獨特性，如L螺旋區(qū)附近的與亞鐵血紅素的綁定位點附近的保守序列（domain D）Pro-X-X-X-Asn-Lys-Gln-Cys-Ala/Pro-Gly/Ala-Lys-Asp/Asn-X-Val中參與亞鐵血紅素綁定的Cys前面的第二個殘基Arg被Lys代替。B結構域中的酪氨酸在玳玳HPL中被半胱氨酸代替；C結構域中大部分植物有的脯氨酸，在玳玳中被絲氨酸取代，這是否是玳玳HPL特有的結構特征，還有待進一步驗證。

2.4 玳玳HPL基因的原核表達分析

重組表達質粒pGEM-T Easy-HPL在大腸桿菌中，經(jīng)過IPTG誘導實現(xiàn)了高效蛋白表達，提取總蛋白進行SDS-PAGE分析，電泳結果顯示出HPL融合表達的特異條帶（圖8，圖中黑色箭頭標出），該條帶大小約為55 ku與HPL蛋白分子量55.7 ku的理論值相符。誘導2 h后HPL蛋白表達明顯增加，誘導4 h與誘導2 h的蛋白表達量無明顯變化。

3 討論

前人研究結果表明，HPL是一個多基因家族編碼的蛋白，屬于細胞色素P450s（CYP74）家族；同種植物不同組織器官，可能有不同的HPL基因，植物的HPL基因有13-HPL、9-HPL和9/13-HPL三大家族，根據(jù)植物不同組織器官中底物的過氧基位置的差異，HPL家族基因的表達也有所不同[14]。同一個物種或物種親緣關系近的HPL基因的序列同源性較高；物種親緣關系遠的序列同源性較低。每個HPL基因家族中又可能有多個基因現(xiàn)象，加上HPL基因在染色體上有多拷貝現(xiàn)象，如在番茄等植物中的HPL基因就有2個或2個以上的拷貝數(shù)[11]，因此，植物HPL基因家族具有復雜性。

盡管植物HPL是由復雜的多基因家族編碼的，但所有植物的HPL都存在4個保守的區(qū)域。本研究獲得的玳玳HPL基因cDNA序列與同屬于蕓香科柑橘屬植物的粗檸檬、甜橙的HPL cDNA序列同源性非常高（分別達99%和97%），尤其是編碼活性中心區(qū)域的核苷酸序列高度保守；玳玳HPL蛋白質的結構域分析結果表明，該蛋白具有植物細胞色素P450家族A、B、C、D共4個保守區(qū)域的典型特征；因此初步判斷本研究獲得的基因屬于HPL基因家族。另有研究結果表明，植物的HPL存在的4個保守區(qū)域；一個是定位在L螺旋前面的Phe-X-X-Gly-X-Arg-X-Cys-X-Gly，其中的半胱氨酸殘基被認為是亞鐵血紅素的第5個配位基；第2個是由K螺旋區(qū)的Glu-X-X-Arg和L螺旋區(qū)玳玳Pro-Glu-Arg-Phe組成的ERR組合，這套組合被認為起到穩(wěn)定核心結構的作用。第3個是位于I螺旋區(qū)的Ala/Gly-Gly-X-Asp/Glu-Thr-thr/Ser，此結構被認為和氧的結合有關系。第4個是C螺旋區(qū)的Trp/His-X-X-X-Arg，其具有調(diào)整亞鐵血紅素丙酸酯的作用[12]。玳玳HPL的確個保守結構域是否存在上述功能還有待進一步的研究。

玳玳HPL進化樹分析結果表明，該基因與13-HPL基因聚為一類，進一步推測，玳玳HPL屬于13-HPL家族。前人研究結果表明13-HPL 催化相關底物后產(chǎn)生的各類物質不僅與植物的抗病蟲和傷害的能力有關，同時該物質還是植物中香氣物質的重要成分[14]。本研究玳玳HPL基因催化相關底物后產(chǎn)生的物質是否與玳玳濃郁的花香有關，該花香是否又具有抗病蟲和傷害的能力，有待進一步研究。

為了能夠進一步確證所獲得的玳玳HPL基因編碼的氨基酸序列與蛋白結構及探究其可能存在的功能。本研究首先對玳玳HPL基因進行初步的原核表達分析，結果表明該基因經(jīng)誘導2 h后在BL21中明顯表達，為后續(xù)收集獲得大量玳玳HPL蛋白進行相關研究變成可能。此外，本研究為了能夠更好地統(tǒng)籌研究HPL基因，由基因組到轉錄與翻譯，及其蛋白功能之間存在的關系，對玳玳HPL基因組進行了擴增，將玳玳HPL基因組擴增產(chǎn)物與玳玳HPL基因cDNA全長進行序列比對，結果發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)序列存在15個點突變，7個會造成氨基酸的改變。綜上所述，玳玳HPL基因cDNA、基因組DNA的克隆與相關分析，及該基因的原核表達的初步試驗成功，為后續(xù)玳玳HPL基因相關功能的研究與利用HPL基因cDNA進行遺傳轉化研究、花卉香味的遺傳改良奠定基礎。

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