韋淑亞 趙旭東 楊廣笑 何光源

摘要：【目的】克隆分析二穗短柄草鈣依賴型蛋白激酶（CDPK）基因BdCDPK14，并檢測其在干旱脅迫下的表達量，為揭示鈣依賴型蛋白激酶的抗旱調(diào)控機制打下基礎。【方法】根據(jù)NCBI檢索結(jié)果設計特異引物，以二穗短柄草cDNA為模板，采用PCR擴增二穗短柄草CDPK基因家族成員BdCDPK14，利用在線分析軟件對BdCDPK14基因編碼蛋白進行生物信息學分析，并采用RT-PCR檢測PEG-6000干旱脅迫下的BdCDPK14基因表達量。【結(jié)果】從二穗短柄草葉片中克隆獲得的BdCDPK14基因（GenBank登錄號XM_003564390）片段長度1750 bp，其開放閱讀框（ORF）1545 bp，編碼514個氨基酸，其編碼蛋白分子量56.78 kD，理論等電點5.45，脂肪指數(shù)78.21，不穩(wěn)定指數(shù)38.66，屬于穩(wěn)定蛋白。BdCDPK14蛋白與小麥TaCPK13蛋白（ABY59018）的親緣關系最近，含有4個EF-hands結(jié)構(gòu)、蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、脂多糖激酶家族、ATP結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活區(qū)和預測跨膜區(qū)等結(jié)構(gòu)域，主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋構(gòu)成，位于葉綠體和細胞質(zhì)膜上。在PEG-6000干旱脅迫下，BdCDPK14基因在脅迫3 h內(nèi)的相對表達量無明顯變化，脅迫6 h后相對表達量開始升高，至脅迫12 h時的相對表達量最高?！窘Y(jié)論】克隆獲得的BdCDPK14基因為二穗短柄草CDPK基因家族成員之一，參與其抗干旱脅迫反應，可作為候選基因用于二穗短柄草抗旱機制研究。

關鍵詞： 二穗短柄草；BdCDPK14基因；克隆；生物信息學分析；干旱脅迫；表達

中圖分類號： Q949.714.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0761-07

0 引言

【研究意義】二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是一種溫帶禾本科植物，是用于研究小麥、水稻作物新型模式植物的理想植株，具有重要的經(jīng)濟價值。鈣依賴型蛋白激酶（CDPK）為單肽鏈，在結(jié)構(gòu)上具有明顯的特征，從N端到C端存在4個功能區(qū)（可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)），是鈣離子（Ca2+）信號通路中的重要成員，在植物抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用（陳飛等，2013；韋淑亞等，2013）。因此，克隆研究二穗短柄草CDPK相關基因，對揭示其在作物抗干旱中的調(diào)控機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自CDPK首次在大豆中得到純化和鑒定（Harmon et al.，1987）以來，陸續(xù)在水稻、擬南芥、楊樹、小麥等物種中發(fā)現(xiàn)CDPKs成員（Kong et al.，2013；Zuo et al.，2013）。CDPKs是一個基因家族，至今擬南芥中有34個、水稻中有29個、玉米中有40個、大麥中有27個CDPKs基因已被鑒定（Cheng et al.，2002；Asano et al.，2005；Fedorowicz- Strońska et al.，2016）。植物CDPKs在與Ca2+結(jié)合后被激活，通過磷酸化下游的底物而啟動植物體內(nèi)的一系列生理生化反應，包括植物生長發(fā)育、調(diào)節(jié)氣孔運動、調(diào)節(jié)碳氮和能量代謝、光信號轉(zhuǎn)導、植物的耐鹽抗旱性及超敏反應等（Romeis et al.，2001；Krupa et al.，2006；Wei et al.，2014）。過表達OsCPK9基因的轉(zhuǎn)基因水稻可顯著提高對干旱的耐受性，其原因是OsCPK9轉(zhuǎn)基因植株對脫落酸更敏感，而OsCPK9基因干擾轉(zhuǎn)基因植株對脫落酸的敏感性無明顯變化，說明OsCPK9基因通過調(diào)控依賴ABA信號的傳導途徑增強植物對干旱脅迫的耐受性（Wei et al.，2014）。此外，擬南芥過表達CPK10基因能提高其對干旱脅迫的耐受性，作用機理是CPK10基因通過依賴ABA和Ca2+調(diào)控氣孔運動而提高對干旱脅迫的耐受性（Zou et al.，2010）；玉米過表達ZmCPK12基因也可提高轉(zhuǎn)基因植物對鹽和干旱的耐受性（Wang and Song，2013）?！颈狙芯壳腥朦c】CDPKs在擬南芥、水稻和玉米等植物中參與抗干旱脅迫的研究已有報道，但針對新型禾本科植物二穗短柄草CDPKs基因（BdCDPKs）的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過克隆BdCDPK14基因，利用蛋白在線分析軟件對其編碼蛋白進行生物信息學分析和結(jié)構(gòu)功能預測，并比對分析干旱脅迫下BdCDPK14基因的表達情況，為揭示CDPKs的抗旱調(diào)控機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

二穗短柄草二倍體近交系Bd21種子由華中科技大學中英聯(lián)合實驗室保存提供，大腸桿菌（Escherichia coli）Top10菌株、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，pMD18-T載體和PrimeStar HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司，植物總RNA提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司、2×Es Taq Master Mix（含染料）購自北京康為世紀生物有限公司、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 干旱脅迫處理 挑選優(yōu)良的二穗短柄草Bd21種子置于鋪有無菌水浸濕濾紙的干凈培養(yǎng)皿中，22 ℃暗培養(yǎng)1周左右，待種子發(fā)芽后移種至花盆，置于人工氣候室中培養(yǎng)4周左右，挑取生長狀況良好且長勢一致的植株，用20% PEG-6000向幼苗葉片噴灑及根部澆灌模擬干旱脅迫，以未經(jīng)PEG-6000干旱脅迫為對照。干旱脅迫處理0、1、3、6和12 h后，分別剪取二穗短柄草幼苗葉片放入2.0 mL無菌離心管中，液氮迅速冷凍后存放于-80 ℃冰箱中，供RNA提取使用。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 二穗短柄草葉片總RNA提取按照植物RNA提取試劑盒說明進行操作。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后的完整RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，備用。

1. 2. 3 引物合成及半定量RT-PCR 從數(shù)據(jù)庫NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）獲得目的基因BdCDPK14（GenBank登錄號XM_003564390）的全長cDNA序列信息，根據(jù)序列信息，利用Primer Premier 5.0設計引物，BdCDPK14基因全長引物序列（F：5'-CT

TGCGTTGCGTGCCGACCAG-3'，R：5'-GGCCTCTTT

CCTTCCTTCCCT-3'）、actin基因（內(nèi)參基因）引物（F：5'-CCCGATGGACAGGTTATCACTA-3'，R：5'-ATAG

AGCCACCAATCCAAACAC-3'）和BdCDPK14基因半定量RT-PCR特異性引物（F：5'-CTACACCGCGTTCC

AGTACTTCGAC-3'，R：5'-CTGGCTGCTCGCCTCCT

CGGTT-3'）均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。全長基因PCR擴增程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃ 10 s，66 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。半定量RT-PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。重復3次。用1.2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，并送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1. 2. 4 BdCDPK14蛋白進化分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫信息進行BLAST比對分析，并使用DNAMAN對BdCDPK14與其他物種中同源性較高的CDPKs進行多序列比對分析。為進一步研究BdCDPK14與其他同源CDPKs間的進化關系，以MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 5 BdCDPK14蛋白序列生物信息分析 利用生物軟件和在線工具對BdCDPK14蛋白進行生物信息學分析，主要包括理化性質(zhì)、疏水性、二級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)等。其中，蛋白生理生化信息分析使用http：//web.expasy.org/protparam/，分析蛋白疏水性使用Hphob./Kyte & Doolittle法：http：//web.expasy.org/

protscale/），二級結(jié)構(gòu)預測（PSIPRED v3.3）http：//

bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/，保守結(jié)構(gòu)域預測http：//

plantsp.genomics.purdue.edu/index.html，三級結(jié)構(gòu)預測http：//swissmodel.expasy.org/。用TargetP和WoLFPSort對BdCDPK14基因編碼蛋白的亞細胞定位進行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BdCDPK14基因克隆結(jié)果

以二穗短柄草Bd21幼苗mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示獲得約1750 bp的目的條帶（圖1），與BdCDPK14基因（GenBank登錄號XM_ 003564390）的預期擴增一致，可以用于后續(xù)研究。

2. 2 BdCDPK14蛋白結(jié)構(gòu)及生物信息學分析結(jié)果

2. 2. 1 BdCDPK14基因編碼蛋白的同源性分析結(jié)果

將小麥TaCPK13（ABY59018），水稻OsCPK2（NP_

001044575）、OsCPK14（EEE64198）、OsCPK25（NP_00

1065691）和OsCPK26（ABA95733），擬南芥AtCPK17（NP_196779）和AtCPK34（NP_197437），楊樹PtCDPK29

（XP_002299975）和PtCDPK30（XP_002313265）與BdCDPK14蛋白進行多序列比對分析，結(jié)果如圖2所示，深藍色區(qū)域代表目的蛋白與同源蛋白完全相同的氨基酸序列，粉色和淺藍色區(qū)域代表相似的氨基酸序列。通過箭頭和橫線標示出N端可變區(qū)、蛋白激酶區(qū)、自抑制區(qū)、EF-hands、類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域。采用MEGA 5.0進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BdCDPK14蛋白與小麥TaCPK13的親緣關系最近（圖3）。綜上所述，擴增獲得的BdCDPK14基因的確是二穗短柄草CDPK基因家族成員之一，且與禾谷類小麥CDPKs有較高的同源性。

2. 2. 2 BdCDPK14蛋白理化性質(zhì)及疏水性分析結(jié)果

采用在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）對BdCDPK14基因編碼蛋白進行分析，結(jié)果顯示，BdCDPK14基因的開放閱讀框（ORF）1545 bp，共編碼514個氨基酸。其中，含谷氨酸殘基（Glu）43個，含量最高（8.4%）；色氨酸殘基（Trp）4個，含量最低（0.8%）；不含吡咯賴氨酸殘基（Pyl）和硒半胱氨酸殘基（Sec）。BdCDPK14蛋白的氨基酸殘基組成及百分比詳見表1。

BdCDPK14蛋白的相對分子質(zhì)量56.78 kD，分子式C2489H3964N694O775S24，總原子數(shù)7946，理論等電點5.45，脂肪指數(shù)78.21，不穩(wěn)定指數(shù)38.66，屬于穩(wěn)定蛋白。按照Hphob./Kyte & Doolittle法分析該蛋白的疏水性，其總平均親水性系數(shù)為-0.451，為親水蛋白，蛋白序列的親/疏水性分析結(jié)果如圖4所示。

2. 2. 3 BdCDPK14蛋白二級結(jié)構(gòu)預測分析結(jié)果 采用在線工具（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）對BdCDPK14蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，如圖5所示。圖中紅色表示α-螺旋，黃色表示β-折疊，直線表示無規(guī)卷曲，藍色代表可信度。預測結(jié)果顯示，BdCDPK14蛋白所含的二級結(jié)構(gòu)類型中無規(guī)卷曲和α-螺旋含量較高，是該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。

2. 2. 4 BdCDPK14蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果 采用在線工具（http：//plantsp.genomics.purdue.edu/index.html）對BdCDPK14蛋白結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果表明，BdCDPK14蛋白含有4個EF-hands結(jié)構(gòu)、蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、脂多糖激酶家族、ATP結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活區(qū)和預測跨膜區(qū)等結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域的分布情況及對應的蛋白序列如圖6所示。

2. 2. 5 BdCDPK14蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果 采用在線工具（http：//swissmodel.expasy.org/）對BdCDPK14蛋白同源建模，預測其三級結(jié)構(gòu)，BdCDPK14蛋白以弓漿蟲一種CDPK突變體為模板，建立的三級結(jié)構(gòu)模型如圖7所示。該蛋白主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果基本一致。

2. 2. 6 BdCDPK14基因編碼蛋白亞細胞定位預測結(jié)果 采用TargetP和WoLFPSort對BdCDPK14基因編碼蛋白的亞細胞定位進行預測，結(jié)果表明，BdCDPK14蛋白主要位于葉綠體和細胞質(zhì)膜上，位于細胞核、液泡或作為細胞骨架的可能性較小，即該蛋白可能主要在胞質(zhì)膜和葉綠體中發(fā)揮作用。

2. 3 BdCDPK14基因表達分析結(jié)果

對干旱脅迫下BdCDPK14基因的表達量進行檢測，結(jié)果如圖8所示。BdCDPK14基因在脅迫3 h內(nèi)的相對表達量無明顯變化，脅迫6 h后相對表達量開始升高，至脅迫12 h時的相對表達量最高。BdCDPK14基因的表達受干旱脅迫誘導，因此推測BdCDPK14基因參與二穗短柄草的抗干旱脅迫反應。

3 討論

逆境脅迫會引起植物細胞內(nèi)Ca2+變化，植物中的CDPKs（Ca2+結(jié)合蛋白）會識別這些復雜的Ca2+信號，并將Ca2+信號進一步向下游級聯(lián)放大和傳遞，進而導致蛋白質(zhì)磷酸化和脅迫相關基因的表達，以提高植物對逆境脅迫的耐受性（姜珊珊等，2013）。CDPK作為Ca2+信號通路中的重要成員，在信號通路中占據(jù)關鍵位置。二穗短柄草具有遺傳背景簡單、基因組小（約272 Mb）、染色體基數(shù)5條及遺傳資源豐富等優(yōu)點，已成為禾本科植物功能基因組分析的重要工具。每個CDPK家族成員從肽鏈的N端到C端均由一個同源性最低的N末端可變區(qū)、一個同源性較高的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（催化區(qū)）、一個最保守的自我抑制區(qū)（連接區(qū)）和保守性最差的鈣調(diào)素樣結(jié)構(gòu)域（調(diào)控區(qū)）等4個功能區(qū)組成（Harmon et al.，2000）。本研究從二穗短柄草中成功克隆獲得BdCDPK14基因，該基因編碼的氨基酸序列具有CDPK的基本特征，與其他物種中的CDPK家族成員具有較高的一致性，其中與小麥TaCPK13蛋白的親緣關系最近。CDPKs的N端可變區(qū)包含豆蔻?；妥貦磅；奈稽c，可能負責與膜結(jié)合，在細胞定位方面發(fā)揮著重要作用（Li et al.，2008）。以TargetP和WoLFPSort兩種軟件預測BdCDPK14基因編碼蛋白，發(fā)現(xiàn)BdCDPK14蛋白主要在胞質(zhì)膜和葉綠體中發(fā)揮作用，與ACPK1定位在細胞膜和葉綠體上（Chehab et al.，2004）的結(jié)果一致。

CDPK對植物非生物脅迫呈正調(diào)節(jié)作用，被認為是抗性育種的候選基因（Asano et al.，2012；Zhao et al.，2015）。水稻OsCDPK7基因能夠被高鹽和低溫脅迫誘導，過表達的OsCDPK7基因通過調(diào)控脅迫相關基因的表達而增強植物對高鹽和干旱的耐受性，但過表達OsCDPK7基因能否增強植物對低溫的耐受性有待進一步探究（Saijo et al.，2000）；水稻OsCPK9基因也能被干旱脅迫誘導，過表達OsCPK9基因通過增強氣孔關閉、調(diào)節(jié)滲透平衡和依賴ABA的信號傳導途徑提高植物對干旱脅迫的耐受性（Wei et al.，2014）；胡楊PeCPK10基因的過表達能促使氣孔關閉而顯著提高植物對干旱的耐受性，組成型表達PeCPK10基因則顯著增強ABA/非生物脅迫相關基因的表達（Chen et al.，2013）?？梢?，CDPK家族基因在植物對非生物逆境脅迫應答的信號傳導過程中扮演著重要角色。植物響應脅迫應答的信號通路極其復雜，各種通路正在不斷地被研究完善。Wang等（2016）將CDPK的研究重點轉(zhuǎn)向其作用底物，發(fā)現(xiàn)水稻OsCDPK14能磷酸化下游底物OsDi19-4，而被磷酸化后的OsDi19-4參與了ABA相關基因的調(diào)控表達。本研究利用20% PEG-6000對二穗短柄草進行干旱脅迫，并檢測BdCDPK14基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BdCDPK14基因可被干旱脅迫誘導表達，說明BdCDPK14可能是二穗短柄草對干旱脅迫應答的正調(diào)控因子。該結(jié)論為進一步鑒定BdCDPK14蛋白基因在非生物逆境脅迫中的功能、參與的信號轉(zhuǎn)導途徑及BdCDPK14與下游蛋白互作模式研究打下了基礎。

4 結(jié)論

克隆獲得的BdCDPK14基因為二穗短柄草CDPK基因家族成員之一，參與其抗干旱脅迫反應，可作為候選基因用于二穗短柄草抗旱機制研究。

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（責任編輯 蘭宗寶）