史國英 曾泉 周文亮 賴洪敏 農(nóng)澤梅 岑貞陸 胡春錦

摘要：【目的】分析廣西百色煙區(qū)煙草青枯病菌的遺傳多樣性，為了解該煙區(qū)青枯病的發(fā)生流行規(guī)律和該病原菌的致病機(jī)制提供參考?！痉椒ā客ㄟ^致病力測(cè)定、生化型鑒定及BOX-PCR對(duì)69株來源于廣西煙草主產(chǎn)區(qū)百色煙區(qū)的青枯菌株的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析?！窘Y(jié)果】供試菌株存在明顯的致病力分化，強(qiáng)致病力菌株、中等致病力菌株和弱致病力菌株出現(xiàn)頻率分別為17.39%、62.32%和20.29%，其中以中等致病力菌群為優(yōu)勢(shì)菌群；供試菌株的生化型復(fù)雜，其中37株屬于生化型III或生化亞型III-1、III-3和III-4，23株屬于生化型Ⅰ，1株屬于生化型Ⅱ，另有8株屬于非標(biāo)準(zhǔn)生化型；BOX-PCR分析結(jié)果表明百色煙草青枯病菌存在豐富的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果顯示菌株的遺傳多態(tài)性與菌株的地理來源、致病力、生化型具有一定的相關(guān)性，但并無明顯的地理種群、生化型種群或致病力一致的種群聚在一起?！窘Y(jié)論】廣西百色煙區(qū)煙草青枯病菌具有豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的生化型，可能是該煙區(qū)煙草青枯病為害逐年加重的重要原因之一。

關(guān)鍵詞： 煙草；青枯菌；生化型；遺傳多樣性；廣西百色

中圖分類號(hào)： S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）05-0825-06

Genetic diversity of Ralstonia solanacearum isolated

from tobacco in Baise， Guangxi

SHI Guo-ying 1， ZENG Quan1， ZHOU Wen-liang 2， LAI Hong-min2， NONG Ze-mei1，3，

CEN Zhen-lu1 *， HU Chun-jin1 *

（1 Microorganism Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China；

2 Baise Branch， Guangxi Tobacco Corporation，Baise， Guangxi 533000， China； 3 College of Agriculture，

Guangxi University， Nanning 530004， China）

Abstract：【Objective】Genetic diversity analysis for Ralstonia solanacearum isolated from tobacco in Baise， Guangxi was studied in order to explore occurrence and epidemic regulation in Baise tobacco planting region and pathogenic mechanism of R. solanacearum. 【Method】Sixty-nine representative strains of R. solanacearum isolated from different places in Baise tobacco planting area of Guangxi were analyzed for genetic diversity by pathogenicity and biovar determination， and Box-PCR analysis. 【Result】All the tested strains presented obvious pathogenicity differentiation. The proportions belonging to high， moderate and low pathogenicity were 17.39%， 62.32% and 20.29% respectively. Strains with moderate pathogenicity were dominant ones. Base on biovar test， the biovar of the tested strains were complex. Thirty-seven strains belonged to biotype Ⅲ or subtype biochemical Ⅲ-1， Ⅲ-3 and Ⅲ-4； twenty-three were biotype Ⅰ； one belonged to biotype Ⅱ and eight belong to atypical biovar. BOX-PCR analysis indicated that there was rich genomic diversity among all the tested R. solanacearum strains. According to clustering analysis， genetic diversity was related to geographical origin， pathogenicity and biovar to some extents. But there were no strain clusters with the same geographical origin， pathogenicity and biovar. 【Conclusion】R. solanacearum isolated from Baise， Guangxi has rich genetic diversity and complex biovar， and it may be one of the reasons why bacterial wilt causes more severe damages year by year in Baise tobacco planting area.

Key words： tobacco； Ralstonia solanacearum； biovar； genetic diversity； Baise， Guangxi

0 引言

【研究意義】百色是廣西最大的烤煙主產(chǎn)區(qū)，由于受氣候及長(zhǎng)期連作等因素影響，近年來百色部分煙區(qū)不同程度地受到青枯?。≧alstonia solanacearum）為害，且常與黑脛?。≒hytophthora nicotianae）、根黑腐?。═hielaviopsis basicola）等多種根莖類病害綜合發(fā)生，煙農(nóng)損失慘重，嚴(yán)重制約了廣西烤煙產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展（王五權(quán)等，2015）。煙草青枯病主要發(fā)生在旱地?zé)?，水旱輪作的煙田發(fā)病較少，迄今為止廣西旱地?zé)煹那嗫莶“l(fā)病率近乎100%，影響了旱地?zé)煼N植面積的進(jìn)一步擴(kuò)大。該病是由茄科雷爾氏菌（R. solanacearum）引起的一種重要土傳植物病害，寄主范圍廣泛（Remenant et al.，2010；蔡劉體等，2016）。由于其種群復(fù)雜，不同菌株在寄主范圍、生化型、致病力等特性上存在明顯差異，因而抗病或耐病品種通常隨著種植年限、地域及栽培方式的改變而喪失品種抗性（Khakvar et al.，2008；Khakvar，2009；肖田等，2015；李小杰等，2016）。因此，研究煙草青枯病菌的遺傳多樣性對(duì)于了解該病的發(fā)生和流行規(guī)律，從而針對(duì)性地制定相應(yīng)防治策略具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人的研究表明，煙草青枯病菌存在顯著的遺傳多樣性。鄭向華等（2007）、李小杰等（2016）運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)采集自廣東省韶關(guān)市和梅州市的38株青枯病菌及采集自豫南煙區(qū)的19株青枯病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示這些病菌DNA具有豐富的遺傳多樣性，且遺傳相似性與地理來源有一定的相關(guān)性。徐進(jìn)等（2010）對(duì)采集自福建省南平、三明和龍巖地區(qū)的45株煙草青枯病菌進(jìn)行青枯菌演化型復(fù)合PCR及對(duì)3種雙糖和3種己醇氧化利用能力檢測(cè)，結(jié)果顯示全部菌株均為青枯菌演化型I型即亞洲分支菌株，其中43株菌株屬于青枯菌生化變種III，1株菌株屬于生化變種IV，1株菌株屬于非標(biāo)準(zhǔn)型生化變種。Li等（2016）對(duì)我國西南、東南、長(zhǎng)江中上游和黃淮煙區(qū)的煙草青枯病菌的遺傳多樣性和致病力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些煙區(qū)的煙草青枯病菌均為演化型I，并可分為7個(gè)序列變種；致病力分析結(jié)果顯示菌株存在高、中、低3種致病型分化，但菌株的致病力與其序列變種和演化型間沒有明顯相關(guān)性；研究證明我國不同地理來源的煙草青枯菌表現(xiàn)出不同的遺傳多樣性水平，地理分布越往北，煙草青枯菌的遺傳多樣性越低。最近，曹毅等（2017）通過高通量測(cè)序分析了煙草青枯病與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，證明煙草青枯病病圃土壤中的擬桿菌門和放線菌門細(xì)菌在總菌群中豐度較低，研究結(jié)果為有針對(duì)性地篩選青枯病高效生防資源、通過微生物區(qū)系的生態(tài)調(diào)控控制青枯病為害提供了理論依據(jù)。【本研究切入點(diǎn)】本課題組前期已對(duì)廣西百色煙草青枯病發(fā)生為害情況進(jìn)行了全面調(diào)查和病原菌鑒定，證明百色煙草青枯菌在演化型分類上均屬于演化型I（王五權(quán)等，2015），但目前針對(duì)百色煙草青枯病菌遺傳多樣性及其生化型尚無系統(tǒng)地研究報(bào)道，當(dāng)?shù)責(zé)煵萜贩N的推廣和布局缺乏依據(jù)，病害防治工作極其被動(dòng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在前期工作基礎(chǔ)上，通過致病力測(cè)定、生化型鑒定及BOX-PCR分析等技術(shù)手段，對(duì)來源于廣西百色煙區(qū)的69株青枯菌的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為了解該煙區(qū)青枯病的發(fā)生流行規(guī)律和該病原菌的致病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試煙草青枯病菌菌株共69株，均為本課題組于2014～2015年間從百色市靖西、樂業(yè)、德保和凌云縣等煙草主產(chǎn)區(qū)的典型病株上分離獲得，所有菌株均已經(jīng)過分離純化、致病性測(cè)定及青枯菌演化型分類鑒定等研究，所有供試菌株均屬于演化型Ⅰ（王五權(quán)等，2015）。供試煙草品種為云煙97。

1. 2 菌株致病力測(cè)定

供試菌株用無菌水配成3×107 CFU/mL的菌懸液備用。取5～6葉期云煙97供試。參考岑貞陸等（2013）的針刺接種法接種病原菌，接種后逐日觀察、測(cè)量并記錄菌株接種產(chǎn)生病斑擴(kuò)展長(zhǎng)度，直到病情穩(wěn)定不再進(jìn)一步擴(kuò)展為止。

根據(jù)接種點(diǎn)莖稈的病斑擴(kuò)展長(zhǎng)度確定菌株的相對(duì)致病力。將菌株的致病力分為強(qiáng)、中、弱3個(gè)評(píng)價(jià)等級(jí)：強(qiáng)致病力（H），病斑平均擴(kuò)展長(zhǎng)度>5 cm；中等致病力（M），5 cm≥病斑平均擴(kuò)展長(zhǎng)度≥2 cm；弱致病力（L），病斑平均擴(kuò)展長(zhǎng)度<2 cm。

1. 3 菌株生化型測(cè)定

參考亢雅娟等（2008）、徐進(jìn)等（2010）的青枯菌生化型測(cè)定方法，分析所有供試菌株對(duì)3種雙糖（麥芽糖、乳糖和纖維二糖）和3種己醇（山梨醇、甘露醇和甜醇）的利用能力及對(duì)硝酸鹽的還原情況，根據(jù)青枯菌生化型的劃分標(biāo)準(zhǔn)（表1）確定菌株的生化型。

1. 4 菌株BOX-PCR多態(tài)性分析

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。BOX-PCR分析參考林海云等（2011）的方法。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：10.0 μL ddH2O；2×Taq MasterMix 13.0 μL，10 μmol/L BOXA1R引物1.0 μL；1.0 μL模板DNA（約50 ng）。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃1 min，52 ℃ 1 min，68 ℃ 7 min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸15 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間1 h，用UVP凝膠成像儀拍攝。

BOX-PCR電泳圖譜分析：參照BOX擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，每一條DNA帶均為一個(gè)分子標(biāo)記，并代表一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)所得位點(diǎn)的二源數(shù)據(jù)（對(duì)電泳圖上同一位置無電泳條帶的計(jì)為0，有條帶的計(jì)為1）記錄譜帶。菌株遺傳相似系數(shù)的計(jì)算和系統(tǒng)聚類分析通過DPS 7.05完成。

2 結(jié)果與分析

2. 1 供試菌株的致病力分化情況

根據(jù)菌株接種發(fā)病及病斑擴(kuò)展情況和致病力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，供試69株菌株在云煙97莖稈上致病性反應(yīng)可分為強(qiáng)致病力、中等致病力和弱致病力3種類型（圖1），強(qiáng)致病力菌株、中等致病力菌株和弱致病力菌株出現(xiàn)的頻率分別為17.39%、62.32%和20.29%（表2），其中以中等致病力菌群為優(yōu)勢(shì)菌群。

2. 2 供試菌株的生化型鑒定結(jié)果

根據(jù)菌株對(duì)3種雙糖、3種已醇及對(duì)硝酸鹽還原的反應(yīng)模式，發(fā)現(xiàn)69株供試菌株中有37株屬于生化型Ⅲ或Ⅲ-1、Ⅲ-3、Ⅲ-4等生化亞型，23株屬于生化型Ⅰ，1株屬于生化型Ⅱ，另有8株無法歸屬于前人劃分的生化型反應(yīng)模式，屬于非標(biāo)準(zhǔn)型生化變種（W）（表2）。

2. 3 供試菌株BOX-PCR多態(tài)性分析結(jié)果

供試煙草青枯菌菌株的BOX-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳分析結(jié)果見圖2，采用BOX引物共擴(kuò)增出18種條帶，且全部為特異性條帶，多態(tài)帶比率為100%。

對(duì)所有供試菌株的BOX-PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，電泳圖上擴(kuò)增條帶的有無分別記為1和0，建立“0，1”表，將“0，1”數(shù)據(jù)輸入統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 7.05進(jìn)行聚類分析，獲得由不同菌株基因組指紋圖譜構(gòu)建的聚類分析樹狀圖（圖3）。聚類分析結(jié)果表明，百色煙草青枯病菌存在豐富的遺傳多樣性，幾乎每個(gè)菌株都有各自的多樣性條帶，69株菌株在遺傳距離為0.60的基礎(chǔ)上聚為一群。菌株的聚類分析結(jié)果與菌株來源有一定的相關(guān)性，如少數(shù)同源性極高的菌株均來源于同一煙區(qū)，但有部分來源相同的青枯菌的遺傳距離較遠(yuǎn)；同時(shí)，遺傳多樣性與菌株的生化型、致病力等也存在一定的相關(guān)性，如編號(hào)為12和13號(hào)菌株，17和18號(hào)菌株，46和48號(hào)菌株，67和68號(hào)菌株，它們?cè)诘乩韥碓?、生化型、致病力及多態(tài)性分析結(jié)果上均完全一致；但也有部分多態(tài)性分析結(jié)果基本一致的菌株，其生化型及致病力存在明顯差異，如編號(hào)為2和3號(hào)菌株，14和15號(hào)菌株，28和29號(hào)菌株，34、35和36號(hào)菌株，52和53號(hào)菌株，63、64和65號(hào)菌株。

3 討論

本研究供試菌株均分離自廣西百色煙草主產(chǎn)區(qū)的青枯病植株，經(jīng)過柯赫法則證明為煙草青枯病致病菌，菌株來源基本涵蓋了所有發(fā)生青枯病的煙區(qū)，其結(jié)果能夠反映百色煙草青枯病的遺傳分化情況，對(duì)該煙區(qū)煙草青枯病菌的遺傳多樣性具有一定的代表性。

前人研究證明我國大部分煙區(qū)煙草青枯病菌主要含生化型III和IV（徐進(jìn)等，2010；謝銳鴻等，2014），而百色煙草青枯菌菌株生化型存在Ⅲ型（包括生化型Ⅲ-1、Ⅲ-3和Ⅲ-4等亞型）、Ⅱ型和Ⅰ型及無法歸屬于前人劃分的青枯菌生化型標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)準(zhǔn)生化型，說明百色煙草青枯病菌的生化型結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。本研究所有煙區(qū)的青枯病菌菌株生化型均包含Ⅲ型和Ⅰ型，唯一的1株Ⅱ型菌株來源于樂業(yè)縣。值得注意的是，出現(xiàn)了8株非標(biāo)準(zhǔn)生化型菌株，雖然它們出現(xiàn)的區(qū)域較窄，只分布在德?？h煙區(qū)，但有必要監(jiān)控其在田間的動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)情況。

我國煙草青枯病抗性種質(zhì)資源多來自美國和津巴布韋，多為針對(duì)演化型Ⅱ型或Ⅲ型菌株選育獲得（徐進(jìn)等，2010）。據(jù)王五權(quán)等（2015）研究報(bào)道，百色煙區(qū)的煙草青枯菌在演化型分類上均屬于演化型Ⅰ，但目前生產(chǎn)上尚缺乏針對(duì)演化型Ⅰ菌株的抗病品種，多年來該煙區(qū)嘗試?yán)闷贩N抗病性來控制煙草青枯病為害但收效甚微。因此，今后對(duì)百色煙區(qū)的抗青枯病種質(zhì)篩選、評(píng)價(jià)及布局應(yīng)針對(duì)性地使用當(dāng)?shù)匮莼廷裰械亩鄠€(gè)強(qiáng)致病力菌株作為測(cè)試菌。

本研究的BOX-PCR分析結(jié)果與前人關(guān)于青枯病菌的遺傳多樣性與菌株來源具有一定相關(guān)性的觀點(diǎn)具有一致性（鄭向華等，2007；李小杰等，2016），少數(shù)電泳圖譜基本一致的菌株主要來源于同一煙區(qū)。但百色煙草青枯病菌的遺傳多樣性似乎更復(fù)雜，幾乎每個(gè)菌株都有各自的多樣性條帶，基于BOX-PCR的聚類分析結(jié)果表明所有供試菌株在遺傳距離0.60的基礎(chǔ)上聚為一大類群；菌株的遺傳多態(tài)性分析結(jié)果與菌株的地理來源、致病力、生化型具有一定的相關(guān)性，如少數(shù)同源性極高的菌株的地理來源、致病力和生化型均完全一致，但大部分地理來源相同的菌株多態(tài)性圖譜又存在明顯差異，并無明顯的地理種群、生化型種群或致病力一致的種群聚在一起。因此，本研究結(jié)果僅反映了百色煙區(qū)煙草青枯病菌遺傳多樣性的復(fù)雜性，菌株多態(tài)性指標(biāo)并不能顯示菌株在致病力、生化型分化上的差異。

4 結(jié)論

廣西百色煙區(qū)煙草青枯病菌具有豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的生化型，使得該病原菌在生存競(jìng)爭(zhēng)中具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，給病害的防治帶來一定困難，也可能是導(dǎo)致目前該煙區(qū)青枯病為害逐年加重的重要原因之一。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）